劉江麗，李盈盈，王佳雯，許喻鈞,2，張 艷，黃江濤,2，胡祖權(quán)，曾 柱,2

2019年開始，由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)感染引起的肺炎在全球范圍內(nèi)大流行[1]。SARS-CoV-2傳染性強，傳播速度快，被世界衛(wèi)生組織列為對人類危害最嚴(yán)重的病毒之一，嚴(yán)重危害全球公共衛(wèi)生安全，研制預(yù)防、診斷和治療的方法具有重要意義。在SARS-CoV-2的4種結(jié)構(gòu)蛋白(S、M、E、N)中，N蛋白高度保守，具有很高的免疫原性，并在感染過程中大量表達(dá)[2]。因此，N蛋白被認(rèn)為是冠狀病毒檢測及抑制劑藥物的靶點，對SARS-CoV-2的診斷和排查具有重要價值[3]。鑒此，該研究以SARS-CoV-2 N蛋白為研究對象，通過雜交瘤技術(shù)制備重組SARS-CoV-2 N蛋白的特異單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)，為SARS-CoV-2的免疫學(xué)檢測和抑制劑藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 載體、細(xì)胞與實驗動物重組質(zhì)粒pET-28a-SARS-CoV-2-N由廣東省實驗動物監(jiān)測所叢鋒老師惠贈；小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0購自江蘇無錫福陽生物科技有限公司；6周齡SPF級雌性BALB/c小鼠，購自遼寧省實驗動物資源中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2015-0001。

1.2 主要試劑Tryptone、Yeast extract購自英國Oxoid公司；蛋白Marker購自美國Thermo-Fisher公司；抗His鼠單克隆抗體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；HT、HAT選擇培養(yǎng)基、AP標(biāo)記山羊抗鼠IgG抗體、對硝基苯磷酸二鈉購自美國Sigma-Aldrich公司；ECL發(fā)光試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；BCIP/NBT顯色試劑購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 SARS-CoV-2 N重組蛋白的表達(dá)、純化與鑒定

1.3.1SARS-CoV-2 N重組蛋白的表達(dá)與純化 取20 μl重組菌株BL21(DE3)/pET-28a-SARS-CoV-2-N接種于20 ml 2TY液體培養(yǎng)基(含50 μg/ml Kan)中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)14 h。次日取5 ml菌液轉(zhuǎn)接到200 ml 2TY培養(yǎng)基(含50 μg/ml Kan)中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600 nm達(dá)到0.5～0.6時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，25 ℃、200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)12～14 h。4 ℃、6 000 r/min離心10 min收集菌體，加入12 ml PBS緩沖液重懸菌體，經(jīng)超聲波破碎處理后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液，經(jīng)Ni-NTA基質(zhì)純化后用BCA蛋白定量試劑盒定量，取3 μg重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.3.2重組SARS-CoV-2 N蛋白的鑒定 用BCA蛋白定量試劑盒測定重組蛋白濃度后，取1 μg重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉2 h，以抗His鼠單克隆抗體(1 ∶5 000)為一抗、AP標(biāo)記山羊抗鼠IgG(1 ∶5 000)為二抗分別孵育1.5 h，最后用BCIP/NBT顯色試劑盒顯色。

1.4 陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選

1.4.1動物免疫與抗血清滴度檢測 采取皮下多點注射的方式對6周齡BALB/c小鼠進(jìn)行免疫(25 μg/只)，免疫3次。初次免疫使用弗氏完全佐劑與目的蛋白等體積混合并充分乳化；第2次和第3次免疫用弗氏不完全佐劑等體積混合并乳化。第3次免疫后第10天取小鼠尾靜脈血，通過間接ELISA法檢測抗血清效價，選擇效價高的小鼠用于細(xì)胞融合。在融合前3 d，腹腔注射不加佐劑的目的蛋白25 μg，進(jìn)行加強免疫。

1.4.2細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的篩選 用PEG1500將分離得到的脾細(xì)胞與提前復(fù)蘇的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按2 ∶1至5 ∶1的比例融合，融合后使用HAT及HT培養(yǎng)基進(jìn)行換液培養(yǎng)。培養(yǎng)約3 d后吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，通過間接ELISA篩選陽性雜交瘤細(xì)胞。采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，直至所有克隆化細(xì)胞孔檢測陽性率為100%時，即可確定已獲得陽性雜交瘤細(xì)胞株。

1.5 mAbs的大量制備與純化取6周齡BALB/c小鼠，腹腔注射0.5 ml液體石蠟致敏，1～2周后，每只小鼠腹腔注射1×106個雜交瘤細(xì)胞，待腹水產(chǎn)生后收集，10 000 r/min離心10 min，取中間腹水層用Protein G親和柱純化得mAbs，置于-20 ℃保存。

1.6 mAbs特性鑒定

1.6.1mAbs亞型鑒定 重組N蛋白稀釋至1 μg/ml，取100 μl加入ELISA板孔中作為包被抗原。用2% BSA封閉1 h后，每孔加入100 μl雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為一抗，HRP標(biāo)記各抗體分型及亞類抗體作為二抗。最后在每孔中加100 μl可溶型單組分TMB底物溶液，黑暗條件下反應(yīng)30 min，每孔中加入100 μl 1 mol/L H2SO4溶液終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀讀取OD450 nm值。

1.6.2mAbs純度檢測 用BCA蛋白定量試劑盒測定純化后的mAbs濃度。用SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒配制12%分離膠、5%濃縮膠。取6 μg樣品，加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，充分混勻后沸水煮8 min，置于冰上備用。電泳槽中加入1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液，取樣品上樣，先用80 V電泳40 min，再用120 V電泳1 h。SDS-PAGE膠用考馬斯亮藍(lán)染色液染色30 min，加入脫色液脫色，用凝膠成像系統(tǒng)掃描。

1.6.3mAbs效價測定 利用間接ELISA法測定抗體效價，重組N蛋白用PBS稀釋至1 μg/ml，取100 μl加入ELISA板孔中作為包被抗原，同時設(shè)置空白對照和陰性對照(空白對照為包被抗原，不加一抗的處理組；陰性對照為不包被抗原，加一抗的處理組)。以1 000、3 000、9 000、27 000、81 000、2 430 000倍比梯度稀釋的腹水作為一抗、AP標(biāo)記山羊抗鼠IgG(1 ∶5 000)為二抗分別孵育1.5 h，最后在每孔中加入100 μl 0.2% 對硝基苯磷酸二鈉顯色液，黑暗條件下顯色30 min，使用酶標(biāo)儀測定OD405 nm值。ΔA405 nm=(實驗組OD405 nm-空白對照OD405 nm)/陰性對照OD405 nm，其值大于2倍的最大稀釋倍數(shù)為mAbs的效價。

1.7 Western blot檢測mAbs的結(jié)合特性取1 μg重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉2 h，分別以制備的5個mAbs(1 ∶1 500)為一抗、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG(1 ∶10 000)為二抗孵育1 h，最后使用ECL發(fā)光試劑盒顯色。

2 結(jié)果

2.1 SARS-CoV-2 N重組蛋白的制備及鑒定重組菌株BL21(DE3)/pET-28a-SARS-CoV-2-N經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，在25 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12～14 h后提取菌體蛋白。重組N蛋白通過Ni-NTA基質(zhì)純化后，SDS-PAGE電泳檢測。結(jié)果如圖1A所示，在約52 ku處有一目的條帶，且蛋白大小與預(yù)期一致，純度大于90%，可作為免疫抗原。使用抗His單克隆抗體對純化后的重組N蛋白進(jìn)行Western blot檢測。結(jié)果如圖1B所示，在相應(yīng)位置有印跡條帶，與SDS-PAGE結(jié)果相符，說明獲得了預(yù)期的目的蛋白。

圖1 SDS-PAGE及Western blot檢測重組SARS-CoV-2 N蛋白

2.2 mAbs亞型鑒定經(jīng)過3次亞克隆，獲得5個mAbs，分別命名為N1、N2、N3、N4和N5。通過間接ELISA法鑒定制備的mAbs亞型，結(jié)果表明，N1的重鏈為IgG2a，N2、N3、N4和N5的重鏈為IgG1，輕鏈均為κ鏈。

2.3 SDS-PAGE電泳檢測純化的mAbs將純化后的mAbs經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒測定濃度后，取6 μg抗體樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。結(jié)果如圖2所示，抗體重鏈大小約為50 ku，輕鏈大小約為25 ku，但大小存在較大差異。

圖2 SDS-PAGE電泳檢測純化的mAbs

2.4 mAbs效價測定分別將5個mAbs以倍比梯度稀釋，采用間接ELISA法測定mAbs的效價。結(jié)果如圖3所示，5個mAbs都表現(xiàn)出與重組SARS-CoV-2 N蛋白較高的結(jié)合能力，其效價均達(dá)到2×104以上。

圖3 間接ELISA分析mAbs的效價

2.5 Western blot檢測mAbs的結(jié)合特性取1 μg重組SARS-CoV-2 N蛋白作為抗原，分別以制備的5個mAbs為一抗進(jìn)行Western blot檢測。結(jié)果如圖4所示，在相應(yīng)位置出現(xiàn)目的條帶，說明5個mAbs均能特異性識別重組N蛋白。

圖4 Western blot檢測mAbs的結(jié)合特性

3 討論

迄今為止，已出現(xiàn)多種威脅人類生命健康的病毒，包括尼帕病毒、狂犬病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒、中東呼吸綜合征冠狀病毒、嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒和SARS-CoV-2等[4-5]。SARS-CoV-2是繼中東呼吸綜合征冠狀病毒和嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒之后，近二十年來出現(xiàn)的第3種高致病性人類冠狀病毒，對人類健康和公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅和挑戰(zhàn)。

針對當(dāng)前新冠肺炎疫情，目前有抗SARS-CoV-2的特效治療藥物，以病毒表面蛋白易感部位為靶點的單克隆抗體被認(rèn)為是一種有前途的抗病毒藥物[6]，單克隆抗體是由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的僅針對某一抗原決定簇的特異性抗體，由于其特異性強，靈敏度高，被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究、疾病診斷和治療[7]。經(jīng)過三十多年的研究和發(fā)展，單抗藥物在惡性腫瘤、呼吸道疾病和自身免疫性疾病治療領(lǐng)域取得了巨大進(jìn)展，同時也是醫(yī)藥領(lǐng)域最具有前景的研發(fā)方向。目前，已有4種抗病毒單克隆抗體作為上市藥物應(yīng)用于臨床，分別是防治小兒呼吸道合胞病毒感染的palivizumab、治療人類免疫缺陷病毒感染的ibalizumab、用于狂犬病毒暴露后預(yù)防的rabishield以及用于治療埃博拉病毒感染的inmazeb[8-10]。Wang et al[11]篩選出可以同時結(jié)合SARS和SARS-CoV-2 S蛋白RBD結(jié)構(gòu)域的人源單抗47D11，該抗體能抑制S蛋白與hACE2受體的結(jié)合，無論是單獨或聯(lián)合使用47D11都有預(yù)防或治療SARS-CoV-2的潛力。Ju et al[12]從8例SARS-CoV-2感染者中分離出多種RBD特異性mAbs，這些抗體可以聯(lián)合使用，產(chǎn)生協(xié)同抗病毒作用。

本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)對重組SARS-CoV-2 N蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，確定在IPTG終濃度為1 mmol/L、誘導(dǎo)溫度為25 ℃時，培養(yǎng)12～14 h能夠獲得大量可溶性表達(dá)的重組蛋白。利用Ni-NTA基質(zhì)進(jìn)行蛋白親和層析純化后進(jìn)行SDS-PAGE及Western blot檢測，結(jié)果顯示重組蛋白大小約52 ku且純度較高，但通過His標(biāo)簽純化后仍有少量雜蛋白。利用雜交瘤技術(shù)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與經(jīng)重組蛋白免疫的BALB/c小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行融合，采用間接ELISA法和有限稀釋法篩選出5株能穩(wěn)定分泌抗N蛋白mAbs的雜交瘤細(xì)胞株。間接ELISA法檢測結(jié)果顯示這些mAbs的效價均達(dá)到2×104以上。Western blot驗證結(jié)果表明，獲得的5個mAbs均能特異性識別重組SARS-CoV-2 N蛋白，但同時也能夠檢測到較重組N蛋白略小的一條蛋白條帶，可能是原核表達(dá)過程中存在少量截短表達(dá)的重組蛋白。Gralinski et al[13]指出SARS-CoV-2 N蛋白與SARS-CoV N蛋白有較高的同源性，本研究篩選得到的mAbs與SARS-CoV可能存在交叉反應(yīng)，鑒于這一類病毒的危害都較大，利用這些抗體開發(fā)檢測試劑盒仍具有重要的臨床價值。綜上所述，本研究制備的5個mAbs為SARS-CoV-2免疫診斷和抑制劑藥物的研發(fā)奠定了實驗基礎(chǔ)。