陳定宇，何小鳳，程 薇，全欣瑩，張 瑜，趙 艷，王琴容，周建獎(jiǎng)，謝 淵

胃癌是我國第二大常見腫瘤，其病死率高，要降低胃癌的總體病死率，早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)治療非常重要[1]。胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)方面，包括宿主因素、環(huán)境因素和幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)感染，流行病學(xué)資料顯示Hp及其特定毒力因子與胃癌的發(fā)生相關(guān)[2]。Hp是引起胃炎、消化性潰瘍、胃癌和與黏膜相關(guān)的淋巴樣組織淋巴瘤的主要病因之一[3]。Hp對(duì)胃黏膜損傷涉及因素眾多，其中其毒素蛋白引起的損傷是一個(gè)重要的方面。Hp相關(guān)毒素蛋白包括空泡細(xì)胞毒素A(vacuolating cytotoxin,VacA)、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A(cytotoxin-associated gene A,CagA)等，其中CagA是一種親水性強(qiáng)的、暴露于菌體表面的外膜蛋白[4-5]。課題組前期經(jīng)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)CagA組能引起E-鈣黏蛋白(epithelial cadherin，CDH1)表達(dá)增高[6]。CDH1是一種依賴鈣離子的細(xì)胞黏附分子，編碼E-鈣黏蛋白，主要在細(xì)胞黏附和細(xì)胞極性中發(fā)揮作用[7]。有研究[8]發(fā)現(xiàn)CDH1基因突變可能與彌漫性胃癌的發(fā)病有關(guān)，是彌漫性胃癌的危險(xiǎn)因素和標(biāo)志之一，而目前Hp感染對(duì)CDH1表達(dá)的影響及其在胃癌發(fā)生中的作用尚不清楚。因此，該研究用Hp灌胃蒙古沙鼠和Hp感染人胃上皮細(xì)胞分析Hp對(duì)CDH1表達(dá)的影響，數(shù)據(jù)庫分析CDH1在胃癌和癌旁組織中的表達(dá)差異、胃癌患者的預(yù)后分析及KEGG富集分析，檢測臨床人胃癌組織CDH1表達(dá)，探究Hp調(diào)控CDH1表達(dá)在胃癌發(fā)生中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1蒙古沙鼠 SPF級(jí)4～5周齡雄性蒙古沙鼠50只，體質(zhì)量60～100 g，購于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(浙2003-0001)。在室溫(20±2) ℃，濕度 55%～65%，明暗交替，光照適度，通風(fēng)潔凈良好條件下飼養(yǎng)，嚴(yán)格遵守SPF級(jí)動(dòng)物管理規(guī)定進(jìn)行飼養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.1.2細(xì)胞與菌株 人胃上皮細(xì)胞AGS購于ATCC細(xì)胞庫，由貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。Hp國際標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11637菌株由貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3人胃癌組織與正常組織 人胃癌組織和正常組織由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科提供，并獲得貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)及患者知情同意。

1.1.4試劑 兔抗GAPDH(10494-1-AP)購自美國Proteintech公司；兔抗CDH1(20874-1-AP)購美國Proteintech公司；山羊抗兔二抗購自美國Proteintech公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；雙抗、胰蛋白酶均購自美國Hyclone公司；Western blot配膠試劑盒、蛋白提取試劑盒購自美國Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人胃上皮細(xì)胞AGS培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)液中(含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素)，置于37 ℃含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長到密度為90%以上時(shí)進(jìn)行傳代備用。

1.2.2細(xì)菌培養(yǎng)Hp國際標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11637接種于含有10%綿羊血、0.4%Hp選擇劑的哥倫比亞血瓊脂平板上，置于37 ℃、5% O2、10% CO2的微需氧環(huán)境中培養(yǎng)，細(xì)菌接種后3 d左右待生長旺盛時(shí)，通過接種環(huán)將菌收集至含PBS的無菌離心管中，5 000 r/min、2 min離心-重懸3次，在分光光度計(jì)上確定菌液濃度。

1.2.3胃癌動(dòng)物模型的構(gòu)建 用Hp國際標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11637經(jīng)口接種蒙古沙鼠，間隔48 h灌胃一次，每次1 ml(15×108個(gè)/ml)，共3次，連續(xù)觀察24個(gè)月。分別選取Hp感染后3、12、24個(gè)月3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各選取3只，組成Hp感染3、12、24個(gè)月實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組。禁食24 h、禁水12 h后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取出胃組織，平均分為2份，1份4%甲醛固定，1份快速液氮冷凍。以Hp未感染的蒙古沙鼠各3只為對(duì)照組。

1.2.4Hp感染細(xì)胞 在哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上刮下Hp，用分光光度計(jì)測量菌的濃度。取胃上皮細(xì)胞計(jì)數(shù)后按1×106個(gè)/孔接種6孔板，過夜培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁后，經(jīng)MOI感染復(fù)數(shù)40 ∶1感染細(xì)胞，24 h后收集樣品。

1.2.5免疫組化 石蠟包埋的組織切片置于二甲苯中脫蠟3次，每次10 min，再經(jīng)乙醇水化脫二甲苯，100%乙醇作用3次，每次10 min，之后再90%、70%、50%、30%乙醇分別作用3 min，高溫高壓抗原修復(fù)，3% H2O2冷卻10 min，1×PBS洗滌切片10 min，室溫孵育一抗2 h，PBS洗滌3次，每次10 min，室溫孵育二抗2 h，DAB顯色1～3 min，PBS終止顯色，蘇木精染色3 min，ddH2O終止反應(yīng)，氨水反藍(lán)1～2 min，ddH2O終止反應(yīng)，50%、70%、90%、無水乙醇、無水乙醇分別作用3 min，二甲苯作用3次，每次10 min，封片。

1.2.6Western blot檢測CDH1蛋白的表達(dá) 按裂解液試劑盒說明書提取總蛋白，經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳2 h，轉(zhuǎn)膜2 h，含脫脂奶粉的1×TBST(0.05% Tween 20)溶液室溫封閉2 h，CDH1一抗(1 ∶5 000)4 ℃孵育過夜，1×TBST(0.05% Tween 20)溶液洗膜3次，每次10 min，加入二抗(1 ∶10 000)室溫孵育2 h，1×TBST(0.05% Tween 20)溶液洗膜3次，每次10 min，化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，經(jīng)化學(xué)發(fā)光成像儀曝光成像，ImageJ讀取灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間均數(shù)比較。驗(yàn)證Hp感染AGS細(xì)胞對(duì)CDH1調(diào)控的影響，采用t檢驗(yàn)。驗(yàn)證Hp感染感染蒙古沙鼠后對(duì)CDH1調(diào)控的影響，采用χ2檢驗(yàn)。生存曲線分析采用 Kaplan-Meier 法，并采用Log-Rank檢驗(yàn)。驗(yàn)證CDH1在人胃癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)情況，采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Hp感染蒙古沙鼠胃組織CDH1的表達(dá)Hp灌胃蒙古沙鼠，分別選取Hp感染后3、12、24個(gè)月3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各選取3只，取胃組織4%甲醛固定，石蠟包埋并制成切片。胃組織臨床病理表型Hp感染后3個(gè)月為固有層及黏膜下層血管擴(kuò)張，黏膜局部淺表糜爛；Hp感染后12個(gè)月為固有層內(nèi)散在淋巴漿細(xì)胞浸潤且黏膜糜爛；Hp感染后24個(gè)月固有層內(nèi)散在淋巴漿細(xì)胞浸潤，部分區(qū)域輕度非典型增生且黏膜糜爛。免疫組化檢測Hp對(duì)CDH1表達(dá)的影響，Hp感染3、12、24個(gè)月胃組織CDH1陽性率分別為13.70%、13.20%、22.90%，對(duì)照組陽性率分別為0.04%、4.50%、4.77%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.039，P<0.05)，表明Hp感染可引起CDH1表達(dá)增高，且可能與胃部病理表型變化有關(guān)。見圖1。

圖1 Hp感染蒙古沙鼠胃組織CDHI表達(dá)

2.2Hp感染胃上皮細(xì)胞AGS CDH1的表達(dá)以MOI為40 ∶1感染胃上皮細(xì)胞細(xì)胞AGS，24 h后提取蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，Western blot檢測目的蛋白CDH1的變化。結(jié)果顯示，與未感染對(duì)照組比較，Hp感染組CDH1蛋白表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 Hp感染胃上皮細(xì)胞AGS CDH1的表達(dá)

2.3 TCGA數(shù)據(jù)庫分析CDH1在胃癌和癌旁組織中的差異表達(dá)TCGA胃癌數(shù)據(jù)庫中共收集449例具有臨床病理參數(shù)的病例及其對(duì)應(yīng)的CDH1 mRNA表達(dá)量。生物信息學(xué)分析得出，胃癌組標(biāo)本CDH1基因表達(dá)量為(147.59±0.11)，癌旁組織組的表達(dá)量為(76.36±0.48)，胃癌組織組表達(dá)量高于癌旁組織組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 胃癌組織與癌旁組織CDH1基因表達(dá)

2.4 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析CDH1表達(dá)與生存的相關(guān)性通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生存分析，隨著在50、100、150個(gè)月的時(shí)間變化，CDH1高表達(dá)相比低表達(dá)胃癌患者生存率降低，表現(xiàn)為CDH1高表達(dá)胃癌患者低生存，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P<0.05,HR(95%CI)=1.49(1.25～1.77)]。見圖4。

圖4 CDH1基因高、低表達(dá)水平的胃癌患者生存率

2.5 CDH1基因KEGG富集分析通過R語言對(duì)CDH1進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果CDH1表達(dá)與胃癌、甲狀腺癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、黑素瘤等腫瘤相關(guān)，功能顯著富集到細(xì)菌侵襲上皮細(xì)胞、黏附連接、細(xì)胞黏附分子，通路顯著富集到Apelin信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路和Rap1信號(hào)通路等。見圖5。

圖5 CDH1基因的KEGG富集分析

2.6 CDH1蛋白在人胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)人胃癌組織和癌旁組織標(biāo)本各10例，免疫組化染色檢測CDH1的表達(dá)。結(jié)果顯示，CDH1陽性率在人胃癌組織為76.27%，高于癌旁組織45.68%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.909，P<0.01)。見圖6。

圖6 CDH1在人胃癌組織中的表達(dá)

3 討論

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，大部分胃癌患者為散發(fā)病例，約10%的胃癌患者存在家族聚集現(xiàn)象，可能與遺傳、飲食、環(huán)境等因素有關(guān)。其中，與遺傳因素相關(guān)的胃癌即彌漫性胃癌[9]。彌漫性胃癌以早發(fā)性彌漫型胃癌為特征，病理類型多為印戒細(xì)胞癌，診治困難且預(yù)后差[10]。在胃癌的發(fā)生中，Hp誘導(dǎo)的慢性炎癥被認(rèn)為是重要的誘因之一，這也意味著環(huán)境因素可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生癌變，這與遺傳因素誘導(dǎo)的可能不同[9]。目前Hp誘導(dǎo)胃黏膜炎癥機(jī)制尚未完全明了，可能機(jī)制包括Hp定植引起的炎癥、Hp毒素引起的炎癥等，但其致癌機(jī)制尚不清楚[4]。研究[11]發(fā)現(xiàn)，彌漫性胃癌家族病例的基因分析提示，CDH1在多位點(diǎn)均易發(fā)生高頻突變，是彌漫性胃癌的危險(xiǎn)因素和標(biāo)志之一。而Hp感染與CDH1表達(dá)及胃癌之間的關(guān)系鮮有研究。本研究通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，Hp灌胃組與對(duì)照組比較，3、12、24個(gè)月3個(gè)時(shí)間點(diǎn)蒙古沙鼠胃組織CDH1表達(dá)量升高；Hp感染胃上皮細(xì)胞后，通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，Hp感染組CDH1蛋白表達(dá)量上升，以上結(jié)果表明Hp可上調(diào)CDH1表達(dá)。有研究[12]發(fā)現(xiàn)，CDH1與多種上皮來源的惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且在多種上皮性腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)其異常表達(dá)。多數(shù)腫瘤都存在至少一個(gè)癌變驅(qū)動(dòng)基因 ，CDH1種系突變便是彌漫性胃癌形成的重要驅(qū)動(dòng)基因[13]。因此，本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫和Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析分析發(fā)現(xiàn)胃癌組織組相比癌旁組織組CDH1表達(dá)水平高，CDH1的高表達(dá)對(duì)胃癌患者低生存呈正相關(guān)；通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，CDH1表達(dá)與胃癌、細(xì)菌侵襲上皮細(xì)胞等相關(guān)；免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人胃癌組織相比癌旁正常組織CDH1表達(dá)水平高，表明CDH1與胃癌發(fā)生可能呈正相關(guān)，提示CDH1在Hp相關(guān)性胃癌中有著重要作用。

綜上所述，CDH1表達(dá)量在蒙古沙鼠Hp灌胃組明顯高于對(duì)照組，在Hp感染AGS細(xì)胞組高于對(duì)照組；生物信息學(xué)分析CDH1基因在胃癌組織中高表達(dá)，CDH1基因高表達(dá)與胃癌不良預(yù)后呈正相關(guān)，KEGG富集得出CDH1與胃癌和細(xì)菌侵襲上皮細(xì)胞等相關(guān)；臨床人胃癌組織CDH1表達(dá)量高于癌旁正常組織，表明Hp感染引起的CDH1高表達(dá)可能在Hp相關(guān)性胃癌發(fā)生中具有重要的作用，結(jié)果為進(jìn)一步探索Hp引起胃癌發(fā)生的機(jī)制和靶向治療提供理論支持。