李岳勇，蒙蘭青，黃 清，李 東，邱紹財(cái)

急性腦梗死的臨床治療主要是早期靜脈溶栓治療，時(shí)間窗在發(fā)病后3.0～4.5 h內(nèi)[1]。但大多數(shù)腦梗死患者不能及時(shí)接受溶栓治療，預(yù)后較差。因此，進(jìn)一步研究腦缺血的病理生理機(jī)制具有重要且迫切的臨床價(jià)值。研究[2-4]表明，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在大腦中高度表達(dá)，與多種神經(jīng)疾病有關(guān)，如自閉癥譜系障礙和癲癇。TALNEC2作為一種促進(jìn)細(xì)胞損傷的lncRNA，研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中TALNEC2增加[5]。此外，心肌缺血患者血清和缺氧損傷的H9c2細(xì)胞中TALNEC2增加[6]。然而，TALNEC2在急性腦梗死中的作用尚未闡明。該研究通過體外腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cell，BMEC)暴露于缺氧-葡萄糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)模型，確定TALNEC2在急性腦梗死中的表達(dá)和作用，并探討TALNEC2基因敲低對小鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，旨在為探索急性腦梗死的治療靶點(diǎn)提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 BMEC培養(yǎng)與OGD模型建立將成年雄性C57BL/6J小鼠(雄性，體質(zhì)量25～30 g，10周齡，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司)的大腦皮層均質(zhì)化，過濾，然后用膠原酶B，膠原酶/Dispase酶(瑞士Roche公司)依次消化，并在40% Percoll溶液中離心。收集含有微血管的第2條帶并將其置于膠原涂層的培養(yǎng)皿上。小鼠BMEC(3代，基于因子Ⅷ的表達(dá)，純度>95%，表現(xiàn)出緩激肽受體功能)在使用前生長到85%～95%的融合率。為了在體外模擬缺血樣條件，將小鼠BMEC培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到溫度控制(37±1)℃的厭氧室(美國Forma Scientific公司)，其中含有5% CO2和95% N2的混合氣體，并用去氧無糖Hanks平衡鹽溶液(美國Invitrogen公司)代替培養(yǎng)基，細(xì)胞在厭氧室中保持16 h，對照組小鼠BMEC不暴露于OGD。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染廣州銳博生物科技有限公司合成了si-TALNEC2、si-NC、pcDNA、基于pcDNA的TALNEC2過表達(dá)載體(TALNEC2)、miR-19a-3p模擬物(miR-19a-3p)和miR-NC(miR-NC)。建立OGD模型前，使用Lipofectamine 3000(美國Invitrogen公司)將上述慢病毒或載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中，孵育48 h。

1.3 小鼠MCAO模型的建立采用C57BL/6小鼠建立MCAO模型。將小鼠隨機(jī)分為4組：溶媒對照組(Sham)、MCAO組、MCAO+siRNA陰性對照組(MCAO+si-NC)和MCAO+siRNA抗TALNEC2組(MCAO+si-TALNEC2)，每組12只。在建立MCAO模型前24 h將si-TALNEC2或si-NC慢病毒載體注入小鼠左心室。MCAO手術(shù)參照文獻(xiàn)方法[7]建立，麻醉后，從頸外動脈至頸內(nèi)動脈插入5-0外科尼龍單絲縫合線以閉塞大腦中動脈。MCAO手術(shù)60 min后，取下縫合線。Sham組采用相同的手術(shù)方法，無MCAO。于MCAO后1、3、7和14 d進(jìn)行神經(jīng)功能評分，取腦組織進(jìn)行TTC染色分析。

1.4 神經(jīng)功能評分和梗死體積的測量在手術(shù)后的1、3、7和14 d進(jìn)行了足誤測試以評估MCAO治療后小鼠的神經(jīng)功能，低神經(jīng)評分顯示神經(jīng)功能缺損[7]。在手術(shù)后14 d，將小鼠麻醉，收集大腦，切割成2 μm厚的切片，并用2%TTC溶液(美國Sigma公司)在37 ℃黑暗中染色15 min。使用圖像實(shí)驗(yàn)室軟件(美國Bio-Rad公司)分析梗死組織(梗死組織呈白色)的面積。

1.5 qRT-PCR分析使用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)分離總RNA，并使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Fisher公司)或TaqMan microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Applied Biosystems公司)將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后，使用SYBR green(Applied Biosystems)將cDNA用于qRT-PCR分析。以β-actin或U6小RNA為內(nèi)源性對照，用2-ΔΔCt法計(jì)算RNAs的相對表達(dá)。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)從腦組織或BMEC細(xì)胞中提取的蛋白質(zhì)用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒(上海Beyotime公司)定量，在98 ℃變性10 min，然后通過SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(美國Millipore公司)上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉膜1 h，然后在4 ℃下用抗Bcl-2(1 ∶1 000稀釋，英國Abcam公司)、Bax(1 ∶2 000稀釋，英國Abcam公司)、JNK(1 ∶5 000稀釋，英國Abcam公司)和β-actin(1 ∶5 000稀釋，英國Abcam公司)一級抗體孵育過夜。隨后，在室溫下與辣根過氧化物酶偶聯(lián)二級抗體(1 ∶10 000稀釋，英國Abcam公司)孵育2 h，并與增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色底物(上海Beyotime公司)相互作用。用圖像實(shí)驗(yàn)室軟件(Bio-Rad)對蛋白質(zhì)信號進(jìn)行分析。

1.7 ELISA試驗(yàn)采用ELISA試劑盒(美國Sigma公司)測定腦組織勻漿或細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)]的釋放量。

1.8 細(xì)胞凋亡采用流式細(xì)胞儀檢測Annexinv-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(美國Sigma公司)檢測細(xì)胞凋亡。用PBS洗滌處理后的BMEC細(xì)胞，加入200 μl結(jié)合緩沖液中再懸浮，然后在黑暗中用10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI雙重染色15 min。用流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司)分析凋亡細(xì)胞。

1.9 熒光素酶活性測定用starBase預(yù)測miR-19a-3p與TALNEC2(全長572 bp，第358～383位堿基存在miR-19a-3p的潛在結(jié)合位點(diǎn))或JNK(全長663 bp，第472～511位堿基存在miR-19a-3p的潛在結(jié)合位點(diǎn))的結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)成對PCR擴(kuò)增引物(TALNEC2 F：5′-AUUUGACUAAGUCAAGUUGCUC UCA-3′，R：5′-UUGGGUAGUACCUUAGAAGAGU-3；JNK F：5′-TCAAAGGGGGAGAGGGGAGAATGTTTG TAACAGGGTAGAGTGGAGGGGTGGGGGGAGCCCT-3′，R：5′-AGGGCTCCCCCCACCCCTCCACTCTACCC TGTTACAAACATTCTCCCCTCTCCCCCTTTGA-3′)，構(gòu)建含有miR-19a-3p應(yīng)答序列的TALNEC2和JNK的3′UTR片段。擴(kuò)增含有野生型(WT)或突變型(MUT)結(jié)合位點(diǎn)的TALNEC2或JNK序列，然后插入pmirGLO載體(美國Promega公司)以構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體(TALNEC2-WT，TALNEC2-MUT，JNK-WT或JNK-MUT)。使用Lipofectamine 3000將20 ng熒光素酶報(bào)告載體、15 ng對照載體和40 nmol/L miR-19a-3p或miR-NC共轉(zhuǎn)染BMEC細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，使用熒光素酶檢測試劑盒(美國Promega公司)測定熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 TALNEC2基因敲低對MCAO模型腦損傷的抑制作用為探討TALNEC2在急性腦梗死中的作用，建立小鼠MCAO模型。在MCAO后1、3、7和14 d，小鼠腦組織中TALNEC2的表達(dá)異常增強(qiáng)(F=38.042，P<0.001)(圖1A),與MCAO+si-NC組比較，MCAO+si-TALNEC2組的TALNEC2豐度降低(圖1B)。觀察各組神經(jīng)損傷情況，結(jié)果顯示:與Sham組比較，MCAO處理增加了梗死體積，降低了神經(jīng)功能評分，而TALNEC2的敲低逆轉(zhuǎn)了這一結(jié)果(圖1C、D)。MCAO組Bcl-2蛋白表達(dá)受到抑制，Bax蛋白表達(dá)增加，而TALNEC2的敲低使其減弱(圖1E)。此外，MCAO組腦組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白水平升高，TALNEC2的敲低使其減弱(圖1F)。

圖1 敲低TALNEC2抑制MCAO模型腦損傷

2.2 miR-19a-3p與TALNEC2結(jié)合為了闡明TALNEC2調(diào)控急性腦梗死的潛在機(jī)制，研究用starBase檢測了TALNEC2的潛在結(jié)合miRNA，并顯示TALNEC2和miR-19a-3p存在結(jié)合位點(diǎn)(圖2A)。隨后，通過熒光素酶活性分析探討了這種相互作用。結(jié)果表明，miR-19a-3p的上調(diào)抑制了轉(zhuǎn)染TALNEC2-WT的BMEC細(xì)胞中的熒光素酶活性，而TALNEC2-MUT組沒有活性變化(圖2B)。

圖2 miR-19a-3p與TALNEC2結(jié)合

2.3 TALNEC2通過調(diào)節(jié)miR-19a-3p介導(dǎo)OGD誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥損傷OGD處理后，BMEC細(xì)胞中TALNEC2的表達(dá)異常增強(qiáng)，而miR-19a-3p水平呈時(shí)間依賴性下降(F=23.591，P<0.001)(圖3A～C)。為探討TALNEC2介導(dǎo)的急性腦梗死是否與miR-19a-3p相關(guān)，將BMEC細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-19a-3p、miR-19a-3p和pcDNA或TALNEC2，然后用OGD處理。OGD治療后BMEC細(xì)胞凋亡和炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生增多，提示體外成功建立了急性腦梗死模型(圖3D)。miR-19a-3p的上調(diào)抑制OGD誘導(dǎo)的BMEC細(xì)胞凋亡，TALNEC2的加入減弱了這種作用。此外，TALNEC2的加入減弱了miR-19a-3p對OGD處理的BMEC細(xì)胞中IL-1β、IL-6和TNF-α分泌水平的抑制作用。

圖3 TALNEC2通過調(diào)節(jié)miR-19a-3p介導(dǎo)OGD誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥損傷

2.4 miR-19a-3p通過靶向JNK抑制OGD處理的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)為探討miR-19a-3p參與急性腦梗死的機(jī)制，用starBase預(yù)測miR-19a-3p的潛在靶點(diǎn)。圖4A顯示了miR-19a-3p和JNK的假定結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)行了熒光素酶活性測定以證實(shí)這一預(yù)測，在轉(zhuǎn)染JNK-WT的細(xì)胞中，miR-19a-3p的過度表達(dá)導(dǎo)致BMEC細(xì)胞中熒光素酶活性降低；但在JNK-MUT組中它未影響活性(圖4B)。體內(nèi)研究證實(shí)了上述結(jié)果，在MCAO后1、3、7和14 d，小鼠腦組織中miR-19a-3p的表達(dá)明顯減弱(F=27.140，P<0.001)，而JNK的表達(dá)異常增強(qiáng)(F=41.503，P<0.001)(圖4C、D)。經(jīng)OGD處理后，BMEC細(xì)胞中JNK mRNA的表達(dá)呈時(shí)間依賴性異常增加(F=31.764，P<0.001)(圖5A)。此外，經(jīng)OGD處理后，BMEC細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性異常降低(F=46.514，P<0.001)，而Bax蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性異常增加(F=61.802，P<0.001)(圖5B)。為探討JNK是否參與miR-19a-3p介導(dǎo)的急性腦梗死損傷，將BMEC細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-19a-3p、miR-19a-3p和pcDNA或JNK，然后用OGD處理,結(jié)果JNK上調(diào)減弱了miR-19a-3p對OGD處理的BMEC細(xì)胞的保護(hù)作用，并抵消了miR-19a-3p對OGD處理的BMEC細(xì)胞中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的抑制作用(圖5C、D)。

圖4 miR-19a-3p的潛在靶點(diǎn)

圖5 miR-19a-3p通過靶向JNK抑制OGD處理的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)

2.5 TALNEC2通過競爭性地結(jié)合miR-19a-3p促進(jìn)JNK的表達(dá)為了進(jìn)一步闡明TALNEC2處理的潛在ceRNA網(wǎng)絡(luò)，通過轉(zhuǎn)染JNK-WT分析BMEC細(xì)胞中的熒光素酶活性。結(jié)果表明，TALNEC2的引入逆轉(zhuǎn)了miR-19a-3p對細(xì)胞中熒光素酶活性的抑制(圖6A)。此外，Western blot分析顯示，TALNEC2的過度表達(dá)導(dǎo)致JNK蛋白水平增加，而miR-19a-3p的加入減弱了JNK蛋白水平(圖6B)。

圖6 JNK由TALNEC2和miR-19a-3p調(diào)節(jié)

3 討論

lncRNA的異常表達(dá)與多種腦部疾病有關(guān)，如神經(jīng)退行性疾病和腦血管疾病[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，lncRNA轉(zhuǎn)移相關(guān)的肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1具有抗凋亡作用，并影響缺血性卒中后的腦損傷。lncRNA INK4位點(diǎn)反義非編碼RNA在體外保護(hù)細(xì)胞免受OGD治療急性腦梗死模型誘導(dǎo)的損傷[10]。因此，闡明lncRNA在急性腦梗死中的作用是非常有價(jià)值的，可以為其治療提供新的治療靶點(diǎn)。本研究在建立急性腦梗死動物模型和細(xì)胞模型中，發(fā)現(xiàn)TALNEC2在腦組織和BMEC細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，并證明了TALNEC2作為miR-19a-3p的ceRNA來調(diào)節(jié)JNK，在體內(nèi)和體外促進(jìn)急性腦梗死損傷。

研究[5]表明，TALNEC2在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤疾病中上調(diào)，與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的細(xì)胞增殖和自我更新呈負(fù)相關(guān)。此外，TALNEC2能夠獨(dú)立有效地加重H9c2細(xì)胞的心肌缺血損傷[6]。本研究中，在MCAO處理的小鼠和OGD處理的細(xì)胞中，TALNEC2均升高，促進(jìn)了急性腦梗死的細(xì)胞凋亡。此外，本研究還揭示了TALNEC2的抑制作用可減少腦梗死，提高神經(jīng)功能評分，提示TALNEC2的敲低在急性腦梗死中起到了神經(jīng)保護(hù)作用。先前的研究[11-12]證實(shí)了TALNEC2具有加重缺氧損傷的功能，并且與細(xì)胞中的促炎介質(zhì)相關(guān)。因此，本研究假設(shè)TALNEC2也促進(jìn)了急性腦梗死炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TALNEC2對促炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的表達(dá)具有積極的調(diào)節(jié)作用，表明TALNEC2參與了急性腦梗死的炎癥損傷。然而，TALNEC2在急性腦梗死中的潛在作用機(jī)制需要更多的研究。這項(xiàng)工作顯示了lncRNA-miRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)在急性腦梗死后腦組織中的重要性。例如，有報(bào)道[13]稱TALNEC2通過結(jié)合miR-650來調(diào)節(jié)凋亡肽酶激活因子1，從而加重腦缺血/再灌注損傷。為了明確TALNEC2在急性腦梗死中是否作為miRNA海綿，研究對潛在的miRNA進(jìn)行了探索，結(jié)果顯示miR-19a-3p含有假定的結(jié)合位點(diǎn)。隨后，通過熒光素酶活性驗(yàn)證了TALNEC2和miR-19a-3p之間的相互作用。

研究[14-15]表明，miR-19a-3p通過調(diào)節(jié)缺血腦的炎癥和存活而成為神經(jīng)保護(hù)靶點(diǎn)。本研究揭示了miR-19a-3p在MCAO模型腦組織和OGD處理的BMEC細(xì)胞中下調(diào)，并且其上調(diào)減輕了OGD誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥損傷。此外，TALNEC2的加入逆轉(zhuǎn)了miR-19a-3p介導(dǎo)的對急性腦梗死損傷的抑制作用，表明TALNEC2通過結(jié)合miR-19a-3p來調(diào)節(jié)急性腦梗死。已知功能性miRNA可調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)。以往的研究[16]表明，miR-19a-3p在不同的條件下負(fù)調(diào)控JNK的表達(dá)。因此，本研究認(rèn)為miR-19a-3p/JNK的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能在急性腦梗死過程中起關(guān)鍵作用。通過熒光素酶活性證實(shí)了miR-19a-3p和JNK之間的相互作用。研究[17]表明，JNK逆轉(zhuǎn)了miR-150-5p介導(dǎo)的對急性腦梗死神經(jīng)元死亡的抑制作用。此外，JNK通過激活NF-κB誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥，并促進(jìn)神經(jīng)元死亡[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，在MCAO和OGD模型中，JNK表達(dá)升高，與先前的研究一致[19]。JNK的恢復(fù)減弱了miR-19a-3p對急性腦梗死損傷的保護(hù)作用，表明miR-19a-3p通過靶向JNK介導(dǎo)急性腦梗死的進(jìn)展。此外，TALNEC2上調(diào)促進(jìn)了JNK表達(dá)，而miR-19a-3p則削弱了這一作用。表明TALNEC2可能是miR-19a-3p抑制BMEC細(xì)胞中JNK表達(dá)的一種ceRNA。

綜上所述，在體內(nèi)外腦缺血模型中，TALNEC2的表達(dá)均增加。TALNEC2的敲低通過調(diào)節(jié)miR-19a-3p/JNK減輕MCAO或OGD誘導(dǎo)的急性腦缺血損傷，為急性腦梗死的治療提供了一種新的潛在策略。