付麗環(huán)，江小霞，毛更生

腦卒中是全球第二大死亡原因，也是導(dǎo)致成人殘疾的主要原因之一，隨著老齡化到來，其發(fā)病率目前仍在增加[1-2]，其中缺血性腦卒中約占所有腦卒中的85%以上[3]。組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator，t-PA)是目前治療缺血性腦卒中的有效藥物之一[4]，但缺血性腦卒中發(fā)作后腦細胞的快速損傷和死亡使得t-PA必須在發(fā)生缺血性腦卒中后4.5 h內(nèi)使用，所以絕大多數(shù)患者得不到t-PA的及時救治[5]。目前這種局限性無法改變，所以關(guān)于缺血性腦卒中的研究策略已轉(zhuǎn)向神經(jīng)修復(fù)療法，尤其強調(diào)各種干細胞的再生治療。在各種類型的候選干細胞中，骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是修復(fù)缺血性腦卒中的一種很有前途的干細胞類型，移植BMSCs可直接或間接修復(fù)局灶性缺血區(qū)，促進神經(jīng)功能改善[6-7]。但BMSCs治療缺血性腦卒中的機制目前還未完全明朗，亟需進一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠，SPF級，10只體質(zhì)量100～120 g和105只體質(zhì)量250～280 g ，從北京斯貝福公司購買，許可證號為scxk(京)2019-0010 。動物飼養(yǎng)在標準條件下(約24 ℃溫度和48% 濕度)，術(shù)前12 h禁食不禁水。

1.1.2試劑與儀器 含EDTA的0.25%胰酶和α-MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)購自澳大利亞Bovogen公司；FITC-CD90、PE-CD29、PE-CD45抗大鼠流式抗體購自美國Biolegend公司；抗微管相關(guān)蛋白-2(microtubule associated protein-2，MAP-2)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、生長相關(guān)蛋白-43(growth associated protein-43，GAP-43)和Caspase-3抗體均購自英國Abcam公司。日本NiKon倒置熒光顯微鏡；美國Bio-Rad ChemiDocTM成像系統(tǒng) 、美國Invitrogen半干式快速轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、BD流式細胞儀。

1.2 實驗方法

1.2.1BMSCs的分離與鑒定 選取體質(zhì)量100～120 g的SD大鼠，用頸椎脫臼法處死后立即用75%乙醇浸泡10 min，分離出完整的股骨和脛骨，PBS溶液沖洗后，再浸入完全培養(yǎng)基(10% FBS、α-MEM培養(yǎng)基、青-鏈霉素)中，剪去兩端的干骺端，用無菌注射器吸取培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，直到骨髓腔變白。離心、棄掉上清液，用完全培養(yǎng)基以106/ml的細胞濃度接種于培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。3 d后半換液，5 d后全換液，每隔2 d換一次液。當細胞生長達到90%融合時即可傳代，傳至第3代用于后續(xù)實驗。

1.2.2流式細胞儀鑒定BMSCs 選擇生長達90%的P3代BMSCs，用PBS制成細胞濃度為1×107/ml的單細胞懸液。從細胞懸液中分別吸取100 μl至4支無菌EP管中，分別加入FITC-CD90、PE-CD29、PE-CD45流式抗體和PBS各1 μl，各管混勻后在冰上避光孵育30 min；用PBS重懸，混勻后避光置于冰上，用流式細胞儀進行檢測。

1.2.3大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型的建立 改良的Zea Longa線栓法建立MCAO模型：大鼠腹腔麻醉，切開頸動脈中線，顯露左側(cè)的頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)和頸外動脈(external carotid artery，ECA)，剝離動脈鞘，仔細分離CCA、ICA與迷走神經(jīng)；用動脈夾短暫阻斷CCA和ICA，并結(jié)扎ECA遠端，在ECA近端留一活結(jié),在兩線之間的血管上做一切口，將線栓插進ECA中后進入CCA，剪斷ECA上的切口，輕輕地將ECA殘端拉與ICA相平行，順勢插入ICA中，當達到栓線標記點時，固定住線栓。缺血2 h后拔除線栓，縫合傷口。術(shù)中保持大鼠肛溫恒定在37 ℃左右。假手術(shù)組不插入線栓，其余操作與模型組相同。

1.2.4動物分組與移植程序 5分制法：0分:無神經(jīng)損傷癥狀；1分:不能完全伸展對側(cè)前爪 ；2分:向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈 ；3分:向?qū)?cè)傾倒 ；4分:不能自發(fā)行走,意識喪失。再灌注24 h后進行評分，將評分為2～3分的大鼠納入接下來的實驗。動物分為假手術(shù)組(尾靜脈注射PBS 1 ml)、MCAO組(尾靜脈注射PBS 1 ml)、BMSC組(尾靜脈注射含3×106個BMSCs的PBS 1 ml)，每組又分別在移植后的第3、7和14天進行神經(jīng)功能評分和取材。所有注射均在MCAO模型構(gòu)建術(shù)后24 h后進行，尾靜脈緩慢注射。

1.2.5神經(jīng)功能評分 采用mNSS評分法對移植后第3、7和14天的三組動物的運動、感覺、平衡和反射功能進行評分，如果得分的分值越高則說明神經(jīng)功能的損傷情況越嚴重。

1.2.6TTC染色 麻醉后，取出完整腦組織，將腦組織按照2 mm厚切出6片冠狀切片，將切片浸泡在2% TTC溶液中，置于37 ℃孵箱中避光孵育20 min，切片需定期翻轉(zhuǎn)，以確保每片腦組織均勻暴露在染色溶液中，染色后將切片用4%多聚甲醛固定24 h，拍照。用ImageJ軟件計算梗死體積。梗死體積百分率(%)=(正常側(cè)腦組織體積-梗死側(cè)正常腦組織體積)/正常側(cè)腦組織體積×100%。

1.2.7免疫組織化學(xué)染色 心臟灌注取腦后，進行固定和脫水后將其進行包埋，制備出腦組織厚度為8 μm的冰凍切片。先后用1%Triton X-100和3%過氧化氫溶液處理腦片，再用血清封閉液封閉30 min，甩干；將切片在4 ℃下與GFAP抗體(兔抗，1 ∶800)孵育過夜，PBS洗滌后滴加二抗孵育1 h，PBS洗滌后用DAB顯色劑孵育5 min，水洗；蘇木精復(fù)染、脫水、透明，最后用中性樹脂封片；光學(xué)顯微鏡下觀察各組腦組織梗死區(qū)及周圍的GFAP。

1.2.8免疫熒光染色 用1%Triton X-100、3%過氧化氫溶液和血清封閉液處理切片，再將切片在 4 ℃ 下分別與GFAP抗體(兔抗，1 ∶800)、MAP-2抗體(兔抗，1 ∶800)、Caspase-3(兔抗，1 ∶500)和GAP-43(兔抗，1 ∶800)孵育過夜，用PBS洗滌后分別選擇FITC-山羊抗兔IgG和Cy3-山羊抗兔IgG避光孵育1 h，洗滌后用內(nèi)含DAPI的封片液進行封片，用顯微鏡觀察陽性細胞的表達。

1.2.9Western blot 試驗 取缺血區(qū)腦組織50 mg，勻漿在500 μl含蛋白酶抑制劑的蛋白提取液中，冰上研磨后孵育30 min，離心取上清液進行蛋白定量檢測。制備聚丙烯酰胺凝膠，進行電泳和PVDF轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完成后，用5%脫脂牛奶封閉1 h，再分別將膜置于一抗(GFAP、MAP-2、GAP-43、Caspase-3和GADPH)中，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，室溫孵育二抗1 h。再次洗膜后顯影。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs培養(yǎng)過程中的細胞形態(tài)的變化BMSCs原代培養(yǎng)在第3天半換液后，可見有大量的紅細胞和其他造血細胞漂浮在培養(yǎng)基中，隱約可見部分BMSCs貼壁生長(圖1A)。在第5天全換液后，可見大量細胞集落式貼壁生長，以梭形細胞為主，呈放射狀排列，伸出長短不一、粗細不均的突起(圖1B)。在第7～8天左右，BMSCs不斷增殖分化，細胞逐漸融合(圖1C)；在第10～12天左右，細胞排列緊密，呈現(xiàn)旋渦式生長，達90%以上的融合度，達到傳代標準(圖1D)。

圖1 大鼠BMSCs原代細胞的生長情況 ×100

2.2 流式檢測BMSCs 表面標記物流式細胞儀檢測第3代大鼠BMSCs結(jié)果顯示，它們高表達CD29(+)、CD90 (+)，低表達CD45(-)。見圖2。

圖2 P3代BMSCs的表面抗原鑒定

2.3 大鼠神經(jīng)功能評分移植前和移植后第3、7和14天的mNSS評分，假手術(shù)組均為0分，BMSC組[(13.0±0.7)、(9.8±0.8)、(8.0±0.7)、(5.2±0.5)分]與MCAO組[(13.4±0.6)、(12.2±0.8)、(10.0±0.7)、(8.2±0.8)分]比較，移植前分數(shù)最高且差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而移植后均降低(F=77.65，P<0.01)，MCAO組和BMSC組移植后的mNSS評分與移植前比較，分值均下降，且隨著移植時間的延長，mNSS評分逐漸降低，說明神經(jīng)功能恢復(fù)越好。見圖3。

圖3 各組大鼠的mNSS評分

2.4 大鼠的腦梗死體積采用TTC染液對腦組織進行染色，肉眼觀假手術(shù)組整個腦組織未顯現(xiàn)出蒼白區(qū)，MCAO組腦組織可見梗死側(cè)大面積出現(xiàn)白色，BMSC組較少局部可見白色(圖4A)，白色即梗死區(qū)域。MCAO組移植后第3、7和14天的大鼠腦組織梗死體積百分比分別為(44.9±1.2)%、(38.5±0.7)%、(28.2±0.8)%，與假手術(shù)組比較顯著增高(P<0.01)，而BMSC組移植后第3、7和14天的大鼠腦組織梗死體積百分比分別為(42.0±0.8)%、(33.4±0.9)%、(19.5±0.6)%，較MCAO組降低(F=623.79，P<0.01),且隨著移植時間的延長，梗死體積逐漸縮小(圖4B)。

圖4 各組大鼠的TTC染色和梗死體積百分比

2.5 免疫組化染色檢測GFAP的表達各組移植后第7天腦組織的GFAP免疫組化染色結(jié)果見圖5。GFAP組化學(xué)染色呈現(xiàn)放射狀的形態(tài)(圖5D)，在假手術(shù)組大鼠皮層區(qū)腦組織中GFAP陽性細胞數(shù)為(2.0±0.7)個，MCAO組為(6.0±1.0)個，BMSC組為(13.2±0.8)個，與MCAO組比較，BMSC組缺血區(qū)的GFAP陽性細胞增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=219.64，P<0.01，圖5E)。

圖5 各組移植后第7天腦組織的GFAP免疫組化染色

2.6 GFAP、MAP-2、Caspase-3和GAP-43的熒光表達三組大鼠移植后第7天的腦組織切片，用GFAP、MAP-2、Caspase-3、GAP-43分別與DAPI共染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：① GFAP陽性細胞呈現(xiàn)星型狀，關(guān)于大鼠腦組織缺血及周圍區(qū)的GFAP陽性細胞數(shù)，假手術(shù)組中為(9.6±1.1)個，MCAO組為(24.0±1.6)個，BMSC組為(27.4±2.2)個，MCAO組高于假手術(shù)組，BMSC組高于MCAO組(F=155.74，P<0.01，圖6)；② MAP-2陽性細胞在MCAO組[(9.2±0.8)個]低于假手術(shù)組[(22.8±1.6)個]，BMSC組[(18.8±1.3)個]與MCAO組相比較，表達上調(diào)(F=143.69，P<0.01，圖7)；③ Caspase-3陽性細胞在假手術(shù)組、MCAO組、BMSC組的表達分別為(3.4±1.1)、(27.4±2.1)和(7.2±1.9)個，在假手術(shù)組中少見，在MCAO組中增多，BMSC組中其表達低于MCAO組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=268.41，P<0.01，圖8)；④ GAP-43陽性細胞在MCAO組[(33.8±1.3)個]中多于假手術(shù)組[(24.4±1.1)個]，而BMSC組[(44.4±1.1)個]中其表達上調(diào)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=349.26，P<0.01，圖9)。

圖6 三組大鼠移植后第7天腦組織的GFAP免疫熒光染色

圖7 三組大鼠移植后第7天腦組織的MAP-2免疫熒光染色

圖8 三組大鼠移植后第7天腦組織的Caspase-3免疫熒光染色

圖9 三組大鼠移植后第7天腦組織的GAP-43免疫熒光染色

2.7 Western blot檢測Caspase-3、GAP-43、GFAP和MAP-2蛋白的表達Western blot結(jié)果分析：① 與假手術(shù)組比較，MCAO組腦組織高表達Caspase-3，而BMSC組在移植第7天和第14天時Caspase-3表達比MCAO組同時段下調(diào)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=249.05，P<0.05)，而第3天未出現(xiàn)下調(diào)(圖10A、B)；② 與假手術(shù)組比較，MCAO組GAP-43的表達上調(diào)，BMSC組較MCAO組也增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=158.07，P<0.05)，在移植BMSCs后的第7天表達最高(圖10A、C)；③ 與假手術(shù)組比較，MCAO組GFAP的表達增強，BMSC組較MCAO組也增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=474.84，P<0.05，圖10A、D)；④ 與假手術(shù)組比較，MCAO組MAP-2表達降低，而BMSC組腦組織在移植后第3、7和14天表達均出現(xiàn)上調(diào)趨勢，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=160.25，P<0.05，圖10A、E)。

圖10 Caspase-3、GAP-43、GFAP和MAP-2在三組腦組織中不同時間點的表達

3 討論

BMSCs普遍高表達CD29和CD90，低表達造血干細胞標記物CD45，這與大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的細胞表面標志物圖譜相一致[8]。BMSCs有在非造血組織中自我更新的能力，也具有向各種組織分化的多能性，即分化為脂肪細胞、軟骨細胞和骨細胞等中胚層細胞，除了中胚層系外，BMSCs還被證明了向神經(jīng)細胞等神經(jīng)外胚層譜系和肝細胞、胰腺細胞等內(nèi)胚層譜系的轉(zhuǎn)分化潛能，正是這種獨特的分化為靶細胞的能力，突出了BMSCs在再生醫(yī)學(xué)背景下的重要性。

本研究過程中發(fā)現(xiàn)BMSC組的大鼠的mNSS評分和腦梗死面積均低于MCAO組，說明BMSCs對腦梗死帶來的神經(jīng)功能損害有一定的治療作用。另外發(fā)現(xiàn)梗死過程中可能存在一定的自我修復(fù)作用，因為隨著時間的延長，腦卒中大鼠的神經(jīng)功能得到了改善。MAP-2存在神經(jīng)元的胞體和樹突中，它對于腦缺血的反應(yīng)比較敏感[9]。在本研究中，腦缺血時MAP-2表達減少，BMSCs移植后使其表達增強，這說明神經(jīng)元系統(tǒng)的生長與修復(fù)的過程中，BMSCs可以通過增強MAP-2對缺血性腦卒中進行神經(jīng)修復(fù)。星形膠質(zhì)細胞一種標志性的特征就是GFAP蛋白，GFAP能夠有效的參與到細胞骨架形成的過程中，并能夠平衡張力[10]。腦缺血會使得星形膠質(zhì)細胞的表達情況增強，并出現(xiàn)細胞增生的情況[11]。本研究中GFAP呈現(xiàn)星型或放射狀，在腦缺血時高表達，且出現(xiàn)在缺血區(qū)周圍，可能是在GFAP在腦缺血時反應(yīng)性增多，參與自我修復(fù)過程。GAP-43是一種神經(jīng)特異性的蛋白質(zhì)，它維持突觸穩(wěn)定性和促進軸突再生的啟動[12]。腦缺血時GAP-43表達增加，在缺血早期它處于病變的中心，隨后在半影區(qū)表達，這表明GAP-43在組織的拯救和再生中起著早期的作用[13]，而BMSCs移植后其表達上調(diào)，說明BMSCs有可能是通過調(diào)節(jié)GAP-43來修復(fù)缺血組織的。Caspase-3的激活在神經(jīng)元凋亡中起著極其重要的作用，是一種促凋亡蛋白[14]。MCAO大鼠患側(cè)梗死區(qū)腦組織大面積組織溶解和細胞壞死，呈現(xiàn)缺血區(qū)的凋亡趨勢，MCAO大鼠Caspase-3表達較假手術(shù)組上調(diào)，熒光染色可見Caspase-3陽性細胞數(shù)增多，這些均說明缺血性腦卒中梗死區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)細胞的凋亡，而BMSC組的梗死區(qū)Caspase-3陽性細胞數(shù)減少，說明BMSCs移植具有抑制神經(jīng)細胞凋亡的作用。

綜上所述，BMSCs治療缺血性腦卒中有成效，表現(xiàn)在梗死面積減小、神經(jīng)行為改善、凋亡細胞受到抑制、局部軸突再生和神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生等。本研究僅為臨床上治療缺血性腦卒中提供了理論依據(jù)，要想完全闡明其神經(jīng)修復(fù)機制，還需進一步研究。