陳祥和 劉 波 陸鵬程 仇 嘯 周香香 曾炘瑜

（揚(yáng)州大學(xué)體育學(xué)院，揚(yáng)州225127）

G 蛋白偶聯(lián)受體（G protein couple receptors，GPCRs）的7次跨膜特征和晶體結(jié)構(gòu)由2012年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主Robert J.Lefkowitz 和Brian K.Kobilka 發(fā)現(xiàn)［1］。GPCRs 是含有7 個(gè)跨膜α 螺旋的膜上受體，其跨過(guò)胞膜磷脂雙分子層并響應(yīng)胞外信號(hào)刺激，進(jìn)而以G蛋白解離α亞基作為傳導(dǎo)物觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)部反應(yīng)，介導(dǎo)正?；蛭蓙y的生理反應(yīng)［2］。G蛋白是膜內(nèi)胞漿面的外周蛋白，與鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合并具有GTP酶（GTPase）活性，可將GTP水解，生成與膜受體偶聯(lián)的異源三聚體——GDP［3］。細(xì)胞膜上GPCRs 可特異地與G 蛋白GTPase 區(qū)域結(jié)合，并形成GPCRs、G 蛋白及下游級(jí)聯(lián)信號(hào)途徑（包括腺苷酸環(huán)化酶、磷脂酶C、Ca2+通道、K+通道等）構(gòu)成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［4］，進(jìn)而參與調(diào)控骨代謝、視覺(jué)傳輸、心率失常、癌變等。

骨中成骨細(xì)胞（osteoblast，OB）和破骨細(xì)胞（osteoclast，OC）相互影響、調(diào)控，分別主導(dǎo)骨形成代謝（以下簡(jiǎn)稱(chēng)骨形成）和骨吸收代謝（以下簡(jiǎn)稱(chēng)骨吸收），而GPCRs 可通過(guò)影響調(diào)控OB 和/或OC的信號(hào)途徑、細(xì)胞因子等進(jìn)而影響骨代謝［3，5］。敲除膜上G 蛋白偶聯(lián)受體48 （G protein couple receptor 48，GPR48）、GPR54 后，小鼠骨中環(huán)磷酸 腺 苷 （cyclic adenosine monophosphate，cAMP）/蛋 白 激 酶A （protein kinase A，PKA）/Atf4、JNK/AP-1 等信號(hào)通路被抑制，導(dǎo)致分化產(chǎn)生的OB 減少但OC 卻增多［6］；而敲除另一受體亞型GPR40 后，OB 分化及骨形成增強(qiáng)且OC 分化被抑制，小鼠骨密度（bone mineral density，BMD）增加［7］。上述研究結(jié)果提示，GPCRs 在調(diào)控骨形成和/或骨吸收上扮演重要角色。甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）調(diào)控骨形成的分子機(jī)制與膜上G 蛋白及GPCRs 激活密切相關(guān)［8］。G 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)PTH 刺激進(jìn)而激活靶蛋白β-arrestin/下游多囊蛋白1（polycystin-1，PC-1）/PDZ結(jié)合基序轉(zhuǎn)錄共激活因子（transcriptional co-activator with PDZ binding motif，TAZ）途徑，以及Wnt3和Wnt7b信號(hào)刺激等來(lái)促進(jìn)骨形成并抑制骨吸收［9-10］。后續(xù)研究關(guān)注小G蛋白在骨代謝中的調(diào)控作用，但因有研究發(fā)現(xiàn)G蛋白介導(dǎo)骨代謝是通過(guò)其異源三聚體而非小G 蛋白，所以有關(guān)其骨代謝調(diào)控作用尚存爭(zhēng)議［3］。這可能與對(duì)小G蛋白研究尚不深入且相關(guān)研究集中于OB 和OC 分化有關(guān)。受限于G 蛋白分子結(jié)構(gòu)單一及亞型數(shù)量少，其調(diào)控骨代謝關(guān)注度不高，研究較少。

運(yùn)動(dòng)是影響骨代謝的重要手段，而GPCRs（如GPR48等）作為力學(xué)刺激敏感蛋白在此過(guò)程中具有關(guān)鍵調(diào)控作用。目前，生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)有關(guān)GPCRs 調(diào)控骨代謝的研究較多，但運(yùn)動(dòng)通過(guò)調(diào)控GPCRs 進(jìn)而影響骨代謝的研究較少，其作用機(jī)制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚待揭示。基于此，本文將對(duì)GPCRs調(diào)控骨代謝及運(yùn)動(dòng)通過(guò)影響膜上GPCRs 進(jìn)而影響骨代謝的相關(guān)研究進(jìn)行綜述并予以展望，以期為骨質(zhì)疏松癥等骨代謝疾病診療提供參考，并為運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)骨代謝研究提供一定的理論基礎(chǔ)和新研究靶點(diǎn)。

1 GPCRs在骨代謝中的調(diào)控作用

1.1 GPCRs在骨形成中的調(diào)控作用

GPCRs 可與G 蛋白結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性，介導(dǎo)cAMP、磷脂酰肌醇等信號(hào)途徑［11］。其以單體、異源二聚體或寡聚體形式存在，刺激轉(zhuǎn)導(dǎo)配體單一激活受體、寡聚復(fù)合物中相鄰的其他受體來(lái)介導(dǎo)下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)［12-13］，調(diào)控阿爾茨海默病、高血壓、心血管疾病、帕金森病等，亦可調(diào)控骨代謝［14-15］。OB膜上GPCRs 大量表達(dá)，且其信號(hào)支架蛋白GPCRs酶相互作用蛋白2 （GPCRs enzyme interaction protein 2，GⅠT2）可將外部刺激傳入胞內(nèi)調(diào)控骨形成代謝［6，16］。GPCRs 種類(lèi)多，以下將詳細(xì)闡述其對(duì)骨形成的介導(dǎo)調(diào)控。

1.1.1 GPR40

GPR40 屬于7 次跨膜α 螺旋結(jié)構(gòu)G 蛋白偶聯(lián)孤兒受體，亦稱(chēng)游離脂肪酸受體1（free fatty acid receptor 1，F(xiàn)FAR1）［17］，由碳鏈長(zhǎng)度大于6 的中長(zhǎng)鏈飽和及多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）活化［18］。GPR40 不僅分布于胰腺細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，也在OB膜上大量表達(dá)［4］。敲除GPR40后，Wnt途徑關(guān)鍵因子β連環(huán)素（β-catenin）磷酸化被抑制，進(jìn)而下調(diào)Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）表達(dá)并作用于Sp7的PST序列區(qū)域，調(diào)節(jié)Fgfr2和Fgfr3來(lái)抑制OB 分化及骨形成［8］。OB 和脂肪細(xì)胞均由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）分化產(chǎn)生，而關(guān)鍵因子過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferatorsactivated receptor γ，PPARγ）受GPR40 調(diào)控，當(dāng)GPR40 被敲除后會(huì)激活PPARγ 表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)BMSCs 向 脂 肪 細(xì) 胞 分 化 并 抑 制OB 分 化［19］。GPR40 不僅調(diào)控脂質(zhì)代謝，亦介導(dǎo)機(jī)體糖代謝。AMP依賴的蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK），作為介導(dǎo)糖代謝的關(guān)鍵蛋白，當(dāng)抑制GPR40 后其表達(dá)下調(diào)，AMP/ATP 比率下降導(dǎo)致其對(duì)細(xì)胞能量代謝脫敏，內(nèi)皮型一氧化氮合酶-一氧化氮（endothelial nitric oxide synthesis-nitric oxide，eNOS-NO）途徑被抑制后Runx2 和鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子（osterix，Osx）去磷酸化不能與骨鈣蛋白啟動(dòng)子區(qū)的成骨細(xì)胞特異性順式作用元件2（osteoblast-specific cisacting element 2，OSE2）結(jié)合，抑制骨鈣蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白（cyclindependent kinase inhibitor，CKⅠ） 調(diào) 控 的OB 分化［20］。并且，GPR40 敲除后胰島素分泌下降，胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factor 1，ⅠGF-1）B功能區(qū)N端16個(gè)氨基酸區(qū)與膜上胰島素樣生長(zhǎng)因子1 受 體（insulin-like growth factor 1 receptor，ⅠGF-1R）結(jié)合，通過(guò)ⅠGF結(jié)合蛋白酪氨酸發(fā)出信號(hào)激酶受體，抑制Norrin及其調(diào)節(jié)的骨祖細(xì)胞增殖和向OB分化［21］。在探究羅格列酮對(duì)顱骨OB增殖及分化的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)GPR40 活化后磷酸化酪氨酸蛋白磷酸酶（Src-homology domain-2 phosphatase1，SHP-1） 并 抑 制 糖 原 合 成 酶 激 酶3β （glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β），磷酸化SHP-1 促進(jìn)激活經(jīng)典Wnt 途徑靶基因β-catenin；GSK-3β 被抑制后激活β-catenin，提高其在核內(nèi)水平，促進(jìn)前成骨細(xì)胞向OB分化［22］。調(diào)控OB分化及骨形成的信號(hào)途徑呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)分布，而GPR40作為膜上受體，是眾多信號(hào)途徑的“發(fā)起點(diǎn)”，除可介導(dǎo)眾多信號(hào)途徑外，對(duì)很多關(guān)鍵因子如血清骨鈣素N端中分子片段（N-terminal middle molecular fragment of osteocalcin，N-MⅠD）、Ⅰ型膠原羧基端肽β 特殊序列（β-C-terminal telopeptide of type Ⅰcollagen，β-CTx）、T-Ⅰ型膠原氨基端前肽（T-procollagen type ⅠN-terminal propeptide，T-PⅠNP）、Dickkopf相關(guān)蛋白1（Dickkopf-related protein-1，DKK-1）和硬化蛋白（selerostin，SOST）等也具有重要調(diào)節(jié)作用，鑒于目前相關(guān)研究較少，其詳細(xì)調(diào)控機(jī)制尚待揭示（圖1，表1）。

1.1.2 GPR48

GPR48（亦稱(chēng)LGR4）屬于A 家族糖蛋白激素受體，亦稱(chēng)富含亮氨酸的GPCRs［23］。以往研究中，GPR48 是未發(fā)現(xiàn)其配體的孤兒受體，而近來(lái)發(fā)現(xiàn)Rspondins（Rspo）家族蛋白中的Rspo1 與GPR48可通過(guò)LGRs家族胞外N端作用并開(kāi)啟經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，調(diào)控OB分化及骨形成［24］，但對(duì)cAMP及Ca2+途徑不顯著。提示，GPR48可能存在其他配體來(lái)激活G 蛋白途徑。研究顯示，RANKL-/-小鼠表型與GPR48-/-小鼠類(lèi)似，那么GPR48與RANKL可能存在一定關(guān)系。后續(xù)研究證實(shí)，除核因子κB 受體活化因子（receptor activator for nuclear factorκB，RANK）外，GPR48（LGR4）是核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）的另一膜上受體，能通過(guò)胞外域（ECD）與RANK競(jìng)爭(zhēng)性同RANKL結(jié)合，活化GSK-3β 和Gαq 途徑，抑制核因子激活T細(xì)胞1（nuclear factor activates T cells 1，NFATc1）表達(dá)和活性從而介導(dǎo)OC 分化及骨吸收；LGR4（LGR4 CKO）小鼠顯示OC過(guò)度活化（包括OC數(shù)量、表面積和體積增大）和骨質(zhì)破壞增加［25］。這表明，Rspo1 和RANKL 是GPR48 配體，但關(guān)于其在骨形成中作用仍需進(jìn)一步研究。

隨著基因敲除技術(shù)發(fā)展，GPR48 調(diào)控骨形成作用引起學(xué)者關(guān)注，利用CRⅠSPR-Cas9 將其在OB上特異性敲除后發(fā)現(xiàn)，GPR48-/-小鼠和轉(zhuǎn)錄缺失（保留5%轉(zhuǎn)錄活性）小鼠骨組織出現(xiàn)BMD和骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)退化，同時(shí)骨生長(zhǎng)發(fā)育被阻滯［26-27］。分析其分子機(jī)制，GPR48 與GαS 結(jié)合后激活cAMP，促進(jìn)PKA磷酸化并激活cAMP反應(yīng)單元結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB），后者是重要核蛋白，其調(diào)節(jié)啟動(dòng)子中具有cAMP 反 應(yīng) 單 元（cAMP-response element，CRE） 的基因轉(zhuǎn)錄， 影響磷酸二酯酶（phosphodiesterase 4，PDE4）和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）表達(dá)促進(jìn)OB 分化及骨形成。經(jīng)典Wnt 途徑是調(diào)控OB 分化的關(guān)鍵途徑，GPR48 活化后促進(jìn)其靶基因β-catenin 磷酸化，入核后與T 細(xì)胞因子（T cell factor， TCF）/淋 巴 增 強(qiáng) 結(jié) 合 因 子（lymphoid enhancer factor，Lef）形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1（cell cycle protein D1，CyclinD1）、軸抑制因子2（axis inhibitor 2，Axin2）等靶基因表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)骨形成［28］。并且，Rspondins 通過(guò)其Furin 結(jié)構(gòu)域與GPR48 結(jié)合可調(diào)控下游Wnt/平面細(xì)胞極化（planar cell polarity，PCP）途徑［29］；而敲除GPR48會(huì)抑制Wnt/PCP途徑［30］。Luo等［25］發(fā)現(xiàn)GPR48 缺失導(dǎo)致骨長(zhǎng)度變小，這與胚胎期骨形成延遲有關(guān)，與軟骨成熟和增殖無(wú)關(guān)；GPR48 通過(guò)調(diào)節(jié)OB 分化、增殖及骨形成能力來(lái)達(dá)成這一功能。綜上發(fā)現(xiàn)，GPR48調(diào)控骨形成由介導(dǎo)的OB分化及骨形成能力增強(qiáng)實(shí)現(xiàn)，與軟骨細(xì)胞無(wú)關(guān)。但是，后續(xù)在研究PTHrP、PTH 和PTH/PTHrP 受體調(diào)控軟骨發(fā)育時(shí)，發(fā)現(xiàn)GPR48 與PTHrP 作用，將外部刺激信號(hào)傳遞到胞內(nèi)引發(fā)級(jí)聯(lián)信號(hào)反應(yīng)，促進(jìn)原代軟骨細(xì)胞3H-TdR 進(jìn)入S-G2/M 期，使得成熟軟骨細(xì)胞增殖。并且，二者偶聯(lián)后亦可激活Hedgehog途徑，Smo和Ptch1作為該途徑關(guān)鍵跨膜蛋白，通過(guò)雌激素受體（estrogen receptor，ER）/Golgi 分泌途徑進(jìn)行C 端和N 端修飾，形成脂質(zhì)態(tài)的具有高信號(hào)活性的信號(hào)分子物質(zhì)，與Nkx3.2 和Sox9 形成自調(diào)節(jié)環(huán)路，調(diào)控軟骨分化與增殖。另有研究發(fā)現(xiàn)，Hedgehog 途徑激活后抑制OC 分化、融核及骨吸收。這表明，GPR48 促進(jìn)OB 分化同時(shí)，亦可通過(guò)促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化、增殖來(lái)促進(jìn)骨形成，同時(shí)也會(huì)抑制OC 分化、融核及骨吸收（圖1，表1）。

1.1.3 GPR54

GPR54 是Kiss1 蛋白受體，屬于G 蛋白偶聯(lián)受體視紫紅質(zhì)家族成員［31］。其包含1 197 bp 的開(kāi)放閱讀框，編碼398 個(gè)氨基酸殘基蛋白［32］。Kiss1 基因表達(dá)蛋白產(chǎn)物Kisspeptin，其具有一C端區(qū)域，為一個(gè)Arg-Phe-NHs 模體，由52 個(gè)氨基酸構(gòu)成，RF-酰胺序列變?yōu)锳rg-Tyr-NH2［33］。GPR54 具有介導(dǎo)能量代謝、性腺功能、腫瘤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)功能，有研究證實(shí)，GPR54 在OB 膜上大量表達(dá)。Kisspeptin 通 過(guò)GPR54 誘 導(dǎo) 蛋 白 激 酶C （protein kinase C，PKC）活化和磷酸酶抑制劑MCⅠP-1 表達(dá)，激活PKC/Runx2 通路關(guān)鍵因子Runx2，促進(jìn)BMSCs 向OB 分 化［34］，而GPR54 表 達(dá) 失 活 后β-catenin 去磷酸化，致使OB 功能紊亂［35］。OB 由BMSCs 分化產(chǎn)生，敲除GPR54 后Runx2、Osx 和C/EBPβ 表達(dá)下調(diào)并激活PPARγ，抑制成骨細(xì)胞前體細(xì)胞向成熟OB分化，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)成熟和基質(zhì)礦化紊亂［36］。下丘腦-垂體-性腺（hypothalamuspituitary-gonad，HPG）軸不僅調(diào)控生殖系統(tǒng)發(fā)育和功能發(fā)揮，并且也可通過(guò)“腦-骨”串聯(lián)影響骨代謝。HPG 軸調(diào)控睪酮分泌，下丘腦弓狀核（arcuate nucleus，ARC）和前腹側(cè)腦室周?chē)藞F(tuán)（anterior ventral periventricular nucleus，AVPV）中的Kisspeptin/GPR54信號(hào)通路，可以調(diào)控下丘腦中促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）的分泌、釋放，影響性腺激素的分泌， GPR54 表達(dá)上調(diào)促進(jìn)骨鈣素（osteocalcin，OCN）分泌［37］。而OCN的活化形式羧化不全骨鈣素（uncarboxylated osteocalcin，ucOCN） 激 活 磷 脂 酰 肌 醇 3-激 酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PⅠ3K）后，上調(diào)靶基因蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）表達(dá)并促進(jìn)OB對(duì)Ⅰ型膠原蛋白、骨橋蛋白等有機(jī)質(zhì)分泌，促進(jìn)骨形成。并且，PⅠ3K激活后Akt磷酸化水平升高， OC 中Bax、 Bcl-2、 Caspase-3、 Cleavedcaspase-3 表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)OC 凋亡，降低OC 對(duì)骨組織的侵蝕［38］。上述研究顯示，OB 和OC 均是GPR54 靶細(xì)胞，通過(guò)調(diào)控它們分化及功能發(fā)揮，可促進(jìn)骨吸收（圖1，表1）。

1.1.4 其他

研究發(fā)現(xiàn)，除上述闡述GPCRs 外，尚有其他GPCRs 可調(diào)控OB 分化及骨形成［39］。與ER 不同，GPR30 作為新發(fā)現(xiàn)的ER，其在骨中OB、OC 等細(xì)胞膜上大量表達(dá)［40］。當(dāng)骨中GPR30 活化后，去卵巢大鼠骨轉(zhuǎn)換率提升，BMD和生物力學(xué)性能升高，骨流失和骨組織形態(tài)微細(xì)結(jié)構(gòu)退化改善［41］。在探究補(bǔ)骨脂素改善骨質(zhì)疏松的研究中，小鼠骨中GPR30 被激活［42］后會(huì)活化ERK1/2 信號(hào)途徑后并降低ANP 和β-MHC 表達(dá)，導(dǎo)致PSMD11 蛋白快速合成，進(jìn)而介導(dǎo)雌激素調(diào)控MC3T3-E1分化產(chǎn)生的OB 線粒體自噬水平，保護(hù)OB 活性［43］。當(dāng)利用GPR30 特異性激動(dòng)劑G1 和特異性拮抗劑G15 來(lái)調(diào)控GPR30/GPER1 在全身表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)骨形成關(guān) 鍵 途 徑（cAMP/PKA/CREB、 MAPK （p38、JNK） 及PⅠ3K/Akt） 均 被 抑 制［44］。 這 表 明，GPR30 與以上途徑存在密切級(jí)聯(lián)反應(yīng)，但有關(guān)GPR30介導(dǎo)以上途徑進(jìn)而調(diào)控OB分化或骨形成的相關(guān)研究尚待補(bǔ)充。GPR40和GPR120均是長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸受體，將其敲除或轉(zhuǎn)錄缺失后，出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂、胰島素抵抗（insulin resistance，ⅠR）水平升高、大腦中海馬區(qū)去甲腎上腺素水平升高等。而雌激素是治療骨質(zhì)疏松（ssteoporosis，OP）的最直接手段，BMSCs 膜上GPR40 受雌激素影響并調(diào)控OB分化，去卵巢大鼠骨中GPR40表達(dá)被抑制；將其敲除后，雌激素改善去卵巢GPR40-/-小鼠骨質(zhì)疏松的作用缺失。這與GPR40 功能缺失后，Wnt/β-catenin 途徑的關(guān)鍵因子β-catenin 去磷酸化，進(jìn)而抑制OB分化及骨形成有關(guān)。另外，GPR40是通過(guò)Wnt/β-catenin 途徑激活雌激素誘導(dǎo)OB 分化的內(nèi)源性促進(jìn)劑，該研究首次為GPR40 是通過(guò)Wnt/β-catenin 途徑來(lái)正向調(diào)節(jié)骨形成提供了直接證據(jù)［45］。當(dāng)用羅格列酮治療2 型糖尿?。╰ype 2 diabetic mellitus，T2DM）時(shí)，發(fā)現(xiàn)羅格列酮抑制OB增殖作用僅通過(guò)GPR40來(lái)實(shí)現(xiàn)，一旦GPR40功能缺失，其下游TLR4/JNK/NF-κB 途徑將被抑制，那么GPR40 生物學(xué)作用將缺失［46］。長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸受體GPR120作為近來(lái)研究熱點(diǎn)，在探究亞油酸抑制MC3T3-E1向OB分化及其骨形成能力時(shí)，發(fā)現(xiàn)亞油酸抑制MC3T3-E1 膜上GPR120 表達(dá)，下調(diào)β-arrestin2表達(dá)導(dǎo)致調(diào)控OB分化靶基因TAK1去磷酸化［47］（圖1，表1）。隨著骨形成研究逐漸深入，相信更多GPCRs會(huì)被研究發(fā)現(xiàn)。

1.2 GPCRs在骨吸收中的調(diào)控作用

OC主導(dǎo)骨吸收，而OC的a3（116 ku）跨膜亞基電質(zhì)子泵突變導(dǎo)致OC分化、融核紊亂和骨吸收異常升高［31］。膜上受體GPCRs 介導(dǎo)的信號(hào)途徑或關(guān)鍵因子調(diào)控OC分化、融核及骨吸收能力。體外研究中，GPR1 表達(dá)上調(diào)后促進(jìn)環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）與RANKL 胞外結(jié)構(gòu)域的TAAT 啟動(dòng)子原件作用，激活RANK 及下游NFATc1 等靶基因，促進(jìn)OC 分化、融核［48］，上調(diào)造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）膜上GPR1受體表達(dá)后會(huì)抑制chemerin-CMKLR1-PPARγ途徑，進(jìn)而上調(diào)其靶基因adiponectin 并促進(jìn)其向OC分化［49］。GPR30作為新型膜雌激素受體，其調(diào)控OC 分化與骨吸收，敲除GPR30 后通過(guò)上調(diào)ⅠGF-1表達(dá)促進(jìn)雌性小鼠骨組織生長(zhǎng)發(fā)育被顯著抑制［50］。林紫微［51］研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷的抗骨質(zhì)疏松作用機(jī)制與膜上GPR30 表達(dá)上調(diào)后抑制CTSK、NFATc1、c-Fos、Dc-stamp 等調(diào)控的OC 分化及骨吸收能力密切相關(guān)。而作為脂肪酸受體的GPR40，當(dāng)利用CRⅠSPR-Cas9技術(shù)將其在小鼠OC上特異性敲除后，NF-κB信號(hào)通路中的κB酶抑制劑（ⅠKKα/β）被抑制且下調(diào)OC 核內(nèi)NFATc1 表達(dá)從而抑制OC 分化及其骨吸收能力［52］。其分子機(jī)制與GPR40-/-小鼠骨中NF-κB 途徑及其靶基因NFATc1表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)，當(dāng)NFATc1 表達(dá)上調(diào)后促進(jìn)破骨細(xì)胞前體向OC 分化［53］。并且，OC 與OB 之間并非獨(dú)立存在，兩者之間借Runx2來(lái)相互影響、調(diào)控。將OB 膜上GPR40 特異性敲除后，OB 分化被抑制的同時(shí)Runx2 表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而激活PⅠ3K/Akt途徑，上調(diào)AP-1、c-myc、c-Src等靶基因表達(dá)，促進(jìn)OC 分化［45］。然而，作為GPCRs 另一關(guān)鍵亞型的GPR48，將其全身敲除后骨生長(zhǎng)發(fā)育被抑制，后續(xù)發(fā)現(xiàn)RANKL是其配體，可激活RANK及其介導(dǎo)的Gαq-GSK-3β途徑，促進(jìn)OC 分化及融核［25］（圖2，表2）。

Fig.1 Schematic diagram of the molecular mechanisms of GPCRs regulating bone formation圖1 GPCRs調(diào)控骨形成的分子機(jī)制總結(jié)示意圖

Table 1 Summary of molecular mechanisms of GPCRs regulating bone formation表1 GPCRs調(diào)控骨形成的分子機(jī)制匯總表

GPR54作為GPCRs的關(guān)鍵亞型，其缺失后OC封閉圈染色更亮，肌動(dòng)蛋白環(huán)結(jié)構(gòu)變大［36］。并且，GPR54 介導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)途徑（如：磷脂酶C（phospholipase C，PLC） β 異 構(gòu) 體 的 活化 和磷脂酰肌醇-4,5-雙磷酸（phosphatidylinositol-4,5-diphosphate，PⅠP2））的水解。而PⅠP2被水解成ⅠP3和DAG 兩個(gè)第二信使后，引起下游Ca2+動(dòng)員并作用于花生四烯酸釋放，磷酸化ERK1/2 和p38 MAPK［32］，下調(diào)NFATc1 表達(dá)［54］；而p38MAPK 的活化會(huì)激活c-Fos途徑及關(guān)鍵因子TRAF6表達(dá)，促進(jìn)OC分化［55］。并且，ERK1/2與p38MAPK之間亦相互作用，p38MAPK抑制劑磷酸化ERK1/2，進(jìn)而抑制OC 分化、融核［56］。而Kiss1 基因編碼的肽類(lèi)激素Kisspeptin-10（Kp-10）可刺激過(guò)表達(dá)GPR54 CHO細(xì)胞張力絲的形成，而此效應(yīng)被外酶C3負(fù)向調(diào)控，此刺激效應(yīng)通過(guò)激活小G蛋白R(shí)ho亞家族來(lái)進(jìn)行調(diào)控。其C端結(jié)構(gòu)域與c-Src SH3 結(jié)構(gòu)域相結(jié)合后，抑制RANKL 蛋白表達(dá)和激活Kp-10 誘導(dǎo)的c-Src 磷酸化，形成RANK/avp3 復(fù)合物基團(tuán)來(lái)激活Syk-Vav3-Rac1 信號(hào)通路，調(diào)控OC 分化和骨吸收［57］（圖2，表2）。受限于GPCRs 調(diào)控骨吸收代謝的相關(guān)研究較少，導(dǎo)致其相關(guān)分析有限且不深入，但確信GPCRs 將是未來(lái)生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究靶點(diǎn)和熱點(diǎn)。

Fig.2 Schematic diagram of the mechanism of GPCR regulating bone resorption圖2 GPCR調(diào)控骨吸收的分子機(jī)制總結(jié)示意圖

Table 2 Summary of molecular mechanisms of GPCRs regulating bone resorption表2 GPCRs調(diào)控骨吸收分子機(jī)制匯總表

2 GPCRs在運(yùn)動(dòng)影響骨代謝中的作用機(jī)制

骨以每年約占總骨量10%的速度進(jìn)行更新，這種以“吸收-構(gòu)建”為主要特征的骨動(dòng)態(tài)平衡稱(chēng)為骨重建［58］。OB 和OC 的偶聯(lián)平衡介導(dǎo)骨內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，研究證實(shí)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是改善骨內(nèi)環(huán)境失衡導(dǎo)致代謝紊亂的關(guān)鍵因素。8周跑臺(tái)訓(xùn)練使錳超氧化物歧化酶缺乏雜合小鼠骨形成加快，BMD 增加［59］。對(duì)比跑臺(tái)訓(xùn)練，震動(dòng)訓(xùn)練可顯著上調(diào)大鼠股骨中OPG表達(dá)從而預(yù)防骨質(zhì)疏松發(fā)生［60］。人體研究亦證實(shí)，16 周瑞士球穩(wěn)定運(yùn)動(dòng)使得慢性腰痛患者BMD 增加［61］。綜上，適度運(yùn)動(dòng)促進(jìn)骨形成，改善骨代謝。

OB 和OC 膜上GPCRs 對(duì)力學(xué)刺激敏感，可將運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)骨產(chǎn)生的力學(xué)刺激傳入膜內(nèi)［62］。有關(guān)GPCRs 調(diào)控運(yùn)動(dòng)影響骨代謝的相關(guān)研究較少，其中以GPR48 研究為主。敲除GPR48 后，一方面cAMP/PKA/Atf4 信號(hào)通路活性被抑制，其靶基因Atf4表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致OCN、骨涎蛋白和Ⅰ型膠原蛋白等表達(dá)下調(diào)，降低骨形成［63］，另一方面作為RANKL 受體，GPR48 能通過(guò)胞外域（ECD）與RANK 競(jìng) 爭(zhēng) 性 同RANKL 結(jié) 合，活 化GSK-3β 和Gαq 途徑進(jìn)而抑制OC 分化［64］。在探究運(yùn)動(dòng)對(duì)T2DM OC 分化的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)下坡跑對(duì)T2DM 小鼠骨產(chǎn)生的直接作用力可激活骨中GPR48/RANKL通路，抑制RANK及其下游靶基因胞質(zhì)活化T細(xì)胞核因 子c2 （nuclear factor of activated T cells c2，NFATc2）和組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）表達(dá)， 入核后鞘氨醇磷酸酯（sphingosine 1-phosphate，S1P）失活，抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞（osteoclast precursor cells，OCPs）向OC 分化及融核，且其作用效果優(yōu)于游泳產(chǎn)生的間接作用力［65］。破骨細(xì)胞抑制因子（osteoclastogenesis inhibitory factor，OPG）/RANKL/RANK 分子軸可借助中樞因子腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）調(diào)節(jié)下游CN/NFAT和NF-κB途徑，而運(yùn)動(dòng)借助OPG/RANKL/RANK分子軸和/或其下游CN/NFAT 和NF-κB 途徑可抑制OC分化及骨吸收［66］。說(shuō)明，GPR48 介導(dǎo)下游CN/NFAT 和NF-κB 途徑是運(yùn)動(dòng)抑制OC 分化及骨吸收的分子機(jī)制。并且，該研究還對(duì)其分子機(jī)制網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了初探，認(rèn)為T(mén)RAF6 介導(dǎo)的PⅠ3K/Akt、JNK/AP-1、p38MAPK、ERK1/2、LPS、CD40 等是該偶聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的潛在機(jī)制［67］。GPR48 不僅調(diào)控OC 分化亦可介導(dǎo)OB 分化，并且其作為7 次跨膜受體可調(diào)控cAMP/PKA、Pitx2、Wnt/β-catenin 和BMPs 等信號(hào)途徑并與其形成分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而影響OB分化及骨形成［68］。已有研究證實(shí)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可通過(guò)cAMP/PKA、Wnt/β-catenin 和BMPs 等信號(hào)途徑調(diào)控OB分化。那么我們不禁思考，運(yùn)動(dòng)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的力學(xué)刺激可能就是以膜上GPR48 為媒介，傳入膜內(nèi)來(lái)調(diào)控以上信號(hào)途徑及成核結(jié)合因子（core-binding factor α1， Cbfα1） 、 PPARγ、

RANKL、OPG 等關(guān)鍵因子表達(dá)，實(shí)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)促進(jìn)OB分化。另一研究發(fā)現(xiàn)，在運(yùn)動(dòng)促進(jìn)骨形成過(guò)程中，GPR48 可通過(guò)與TGF-β/Smads 途徑調(diào)控OB 分化。并且，Norrin 作為GPR48 配體可上調(diào)其表達(dá)，磷酸化BMP-2 的Ser122 和Ser132 位點(diǎn)，使得Smad1/5/8 激活并與Smad4 形成磷酸化基團(tuán)轉(zhuǎn)移入核，上調(diào)靶基因表達(dá)來(lái)介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)促進(jìn)OB 分化［69］（圖3）。

GPR30 作為GPCRs 家族關(guān)鍵成員，其缺失后小鼠血液中骨吸收生化標(biāo)志物CTX和股骨BMD下降［14］。而GPR30可調(diào)控骨形成關(guān)鍵蛋白BMP-6表達(dá)來(lái)發(fā)揮生物學(xué)作用。據(jù)此，當(dāng)對(duì)骨施加運(yùn)動(dòng)力學(xué)刺激時(shí)，其可通過(guò)GPR30/骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein-6，BMP-6）途徑來(lái)磷酸化Smad2、3、4并形成磷酸化復(fù)合基團(tuán)，入核后調(diào)控BMSCs 向OB 的分化及骨形成（圖3）。雖然膜上GPCRs 家族成員較多，但目前運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)有關(guān)運(yùn)動(dòng)通過(guò)膜上GPCRs 介導(dǎo)下游級(jí)聯(lián)信號(hào)反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控OB和/或OC分化及骨代謝的相關(guān)研究尚待探究，這也將會(huì)是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)研究骨細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)或骨代謝平衡分子調(diào)控機(jī)制的新熱點(diǎn)和新靶點(diǎn)。

3 問(wèn)題與展望

隨著有關(guān)GPCRs 生物研究的不斷深入，其在調(diào)控OB和/或OC分化及功能發(fā)揮進(jìn)而影響骨代謝中的關(guān)鍵作用已廣為認(rèn)可。雖已有報(bào)道GPCRs 調(diào)控運(yùn)動(dòng)影響骨代謝，但相關(guān)研究較少。本研究拓展了GPCRs 的一個(gè)新功能，即其在運(yùn)動(dòng)影響OB 和/或OC分化及功能中的作用機(jī)制。國(guó)內(nèi)外體育科學(xué)或運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有關(guān)GPCRs 調(diào)控骨代謝的專(zhuān)題研究較少，仍有很多問(wèn)題亟待澄清，例如：a.還有哪些GPCRs？除已證實(shí)的GPR48 外，GPCRs 數(shù)量眾多，還有哪些GPCRs 在運(yùn)動(dòng)改善骨代謝中發(fā)揮作用，并且相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制網(wǎng)絡(luò)仍待揭示。b.選擇何種運(yùn)動(dòng)方式及強(qiáng)度？前人研究已證實(shí)運(yùn)動(dòng)方式不同對(duì)骨代謝產(chǎn)生的效果迥異，GPCRs 在此過(guò)程中扮演何角色，且同一運(yùn)動(dòng)的強(qiáng)度不同對(duì)骨細(xì)胞產(chǎn)生的力學(xué)刺激差異較大，所以多大強(qiáng)度可激活GPCRs？c.是否調(diào)控OB 與OC 之間“crosstalk”？OB 與OC 之間可借Runx2 等關(guān)鍵因子相互交聯(lián)，那么GPCRs 是否調(diào)控此過(guò)程且在運(yùn)動(dòng)改善骨代謝中是否也具有調(diào)控作用呢？明確以上問(wèn)題，將有助于更加充分的熟知運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下GPCRs 調(diào)控骨代謝的分子機(jī)制網(wǎng)絡(luò)，并為以后體育運(yùn)動(dòng)促進(jìn)骨生長(zhǎng)發(fā)育以及防治骨質(zhì)疏松提供理論依據(jù)和研究靶點(diǎn)。

Fig.3 Schematic diagram of the mechanism of GPCRs in the effect of exercise on bone metabolism圖3 GPCRs在運(yùn)動(dòng)影響骨代謝中的作用機(jī)制示意圖