潘聰桃，張曉燕，廖愛(ài)玲，潘海飛，周超峰，楊 宇*

基于硫氧還蛋白還原酶1探究堆心菊靈對(duì)人前列腺癌細(xì)胞中活性氧產(chǎn)生的影響

潘聰桃1，張曉燕2，廖愛(ài)玲2，潘海飛3，周超峰2，楊 宇2*

1. 溫州市中心醫(yī)院 麻醉手術(shù)科，浙江 溫州 325000 2. 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 泌尿外科，浙江 溫州 325000 3. 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 麻醉手術(shù)室，浙江 溫州 325000

探究堆心菊靈在人前列腺癌細(xì)胞中的抗癌作用及其潛在的作用機(jī)制。人前列腺癌DU145和PC-3細(xì)胞分別以不同濃度的堆心菊靈處理48 h，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率；qRT-PCR法檢測(cè)硫氧還蛋白還原酶1（thioredoxin reductase 1，）mRNA表達(dá)情況。從人類(lèi)蛋白免疫組化表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢測(cè)前列腺癌組織和正常組織中TrxR1蛋白表達(dá)情況；經(jīng)堆心菊靈或活性氧（reactive oxygen species，ROS）抑制劑處理后，采用DCFH-DA染色法檢測(cè)ROS的產(chǎn)生；敲除或過(guò)表達(dá)，經(jīng)堆心菊靈處理后，檢測(cè)2種細(xì)胞中ROS水平。堆心菊靈顯著抑制前列腺癌細(xì)胞存活率和mRNA表達(dá)水平（＜0.05、0.001），呈劑量相關(guān)性。與正常組織相比，TrxR1在前列腺癌組織中高表達(dá)。堆心菊靈顯著誘導(dǎo)了前列腺癌細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，敲除顯著提高了前列腺癌細(xì)胞中ROS水平，過(guò)表達(dá)TrxR1抑制了前列腺癌細(xì)胞中ROS產(chǎn)生；而堆心菊靈可改善TrxR1過(guò)表達(dá)對(duì)ROS產(chǎn)生的抑制作用。堆心菊靈可以通過(guò)靶向人前列腺癌細(xì)胞中的TrxR1來(lái)促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮抗前列腺癌的作用。

堆心菊靈；硫氧還蛋白還原酶1；活性氧；前列腺癌細(xì)胞；抗癌

前列腺癌是中國(guó)男性中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。雄激素剝奪療法是前列腺癌的首選治療方法[2]。然而，一部分前列腺癌患者對(duì)該治療不敏感，限制了該療法在臨床上的應(yīng)用。因此，迫切需要探索用于治療該疾病的新型藥物。

氧化應(yīng)激參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。盡管從正常的生理角度來(lái)看，維持細(xì)胞功能所需的活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平是必要的，但過(guò)量的ROS可能破壞促氧化劑和抗氧化劑的平衡，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡[3]。氧化應(yīng)激水平的提高已成為消除腫瘤細(xì)胞的一種有前景的治療策略。與正常細(xì)胞相比，前列腺癌細(xì)胞中ROS和氧化應(yīng)激水平增加[4]。研究報(bào)道，促進(jìn)ROS的產(chǎn)生可以顯著地殺傷前列腺癌細(xì)胞[5]。硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）系統(tǒng)包含硫氧還蛋白受體（thioredoxin receptor，TrxR）、Trx和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）。研究表明，抑制TrxR1的活性會(huì)破壞細(xì)胞的氧化還原平衡，從而導(dǎo)致ROS的升高[6]。

堆心菊靈是愈創(chuàng)木酚內(nèi)酯的天然產(chǎn)物。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)堆心菊靈具有抗炎[7]、抗氧化應(yīng)激[8]和抗腫瘤[9]等多種藥理活性。然而，堆心菊靈是否能夠治療前列腺癌尚不清楚。此外，堆心菊靈抗癌的作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究旨在探索堆心菊靈對(duì)前列腺癌細(xì)胞的影響，并探討堆心菊靈是否可以通過(guò)靶向TrxR1促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞中ROS產(chǎn)生。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人前列腺癌細(xì)胞系DU145和PC-3購(gòu)自美國(guó)ATCC。

1.2 藥品與試劑

堆心菊靈（批號(hào)236784P）購(gòu)自孟成科技（上海）有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基（批號(hào)25123404）購(gòu)自武漢普諾賽公司；胎牛血清（批號(hào)2085124A）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；F-12K培養(yǎng)基（批號(hào)2173969RP）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；PBS溶液（批號(hào)1036741）購(gòu)自美國(guó)Life Carlsbad公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒（批號(hào)2148751）購(gòu)自上海東仁化學(xué)公司；MiniBEST通用RNA提取試劑盒（批號(hào)2173969RP）購(gòu)自日本Takara公司；Lipofectamine 2000（批號(hào)2036945B）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；ROS檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20210514）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；多聚甲醛（批號(hào)20210311）購(gòu)自上海生工生物工程公司；山羊血清（批號(hào)04569）購(gòu)自北京Beyotime公司；Triton X-100（批號(hào)20210412）、DAPI染液（批號(hào)20210311）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 儀器

熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；全功能微孔板檢測(cè)儀（美國(guó)PerkinElmer公司）；qRT-PCR儀（美國(guó)ABI公司）；細(xì)胞爬片（無(wú)錫NEST公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

DU145細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，PC-3細(xì)胞用含10%胎牛血清的F-12K培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中均含100 U/mL青霉素和鏈霉素，于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 TrxR1過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

利用TrxR1特異性引物將目的基因編碼區(qū)序列（CDS）克隆，包括PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化、限制性?xún)?nèi)切酶酶切，利用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接；轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，進(jìn)行菌落PCR。選取陽(yáng)性樣品進(jìn)行搖菌測(cè)序，比對(duì)正確的菌落保存?zhèn)溆?，并提取質(zhì)粒。

2.3 細(xì)胞存活率檢測(cè)

通過(guò)CCK-8試劑盒檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞的存活率。DU145和PC-3細(xì)胞經(jīng)PBS溶液沖洗后，用胰蛋白酶消化2 min，制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞以8000個(gè)/孔接種到96孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁后，向細(xì)胞中加入不同濃度的堆心菊靈（0、1、2、4、8、12、16、20 μmol/L），培養(yǎng)48 h；加入CCK-8溶液，孵育3 h，加入終止溶液，采用全功能微孔板檢測(cè)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(實(shí)驗(yàn)－空白)/(對(duì)照－空白)

2.4 轉(zhuǎn)染

DU145和PC-3細(xì)胞以1×104/孔接種到6孔板中，培養(yǎng)24 h后，用Liopfectamine RNAiMAX試劑將20 μmol/L si-及無(wú)關(guān)序列（si-NC）轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。siRNA序列：si-#1：5’-GGGGAAGACCCTGGTTGTT-3’；si-#2：5’-CCACTGTATTTACTCCTTT-3’。此外，將編碼TrxR1蛋白的重組質(zhì)粒載體通過(guò)Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染到DU145和PC-3細(xì)胞中。24 h后，采用qRT-PCR評(píng)估轉(zhuǎn)染效果。

2.5 qRT-PCR檢測(cè)

使用RNA提取試劑盒從DU145和PC-3細(xì)胞中提取總RNA。用紫外分光光度計(jì)測(cè)量260/280值。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA：25 ℃、5 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)目標(biāo)基因的表達(dá)。引物序列：人上游引物5’-CCCT- GGTTGTTGGAGCAT-3’，下游引物5’-TCTGA- GTCGGCCTGGTGT-3’；人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，）上游引物5’-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3’，下游引物5’-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3’。

2.6 ROS檢測(cè)

采用ROS檢測(cè)試劑盒檢測(cè)DU145和PC-3細(xì)胞中ROS水平。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以1×104/孔接種到24孔板中，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，用ROS抑制劑-乙酰半胱氨酸（NAC，10 mmol/L）預(yù)處理1 h，然后加入堆心菊靈處理48 h。用無(wú)血清培養(yǎng)基按1∶1000稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L，將細(xì)胞與300 μL DCFH-DA于37 ℃孵育30 min；于PBS溶液中浸泡后，用4%多聚甲醛固定15 min；將載玻片用0.5% Triton X-100于室溫浸透20 min，滴加山羊血清，室溫封閉30 min；加入DAPI染液，避光孵育5 min，用載有抗熒光淬滅劑的固定溶液固定載玻片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。同法檢測(cè)敲除或過(guò)表達(dá)TrxR1后細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 堆心菊靈抑制人前列腺癌細(xì)胞的存活率

用不同濃度的堆心菊靈處理DU145和PC-3 2種前列腺癌細(xì)胞，如圖1所示，隨著堆心菊靈濃度的增加，DU145和PC-3細(xì)胞的存活率逐漸降低。本研究選擇8 μmol/L作為堆心菊靈處理DU145細(xì)胞的最佳濃度[半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）＝6.12 μmol/L]，4 μmol/L作為堆心菊靈處理PC-3細(xì)胞的最佳濃度（IC50＝5.32 μmol/L）。

3.2 TrxR1在前列腺癌組織中高表達(dá)

從人類(lèi)蛋白免疫組化表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www. proteinatlas.org/）中搜索了TrxR1在人前列腺癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況。如圖2所示，TrxR1在人前列腺癌組織中染色較深，并且多位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上（棕黃色）；在細(xì)胞核（藍(lán)色）上沒(méi)有染色；而在癌旁正常組織中沒(méi)有著色現(xiàn)象。表明與癌旁正常組織相比，TrxR1在人前列腺癌組織中顯著高表達(dá)，并且TrxR1主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上表達(dá)。

與堆心菊靈（0 μmol·L?1）組比較：***P＜0.001

圖2 TrxR1在人前列腺癌和癌旁正常組織中的表達(dá)情況

3.3 堆心菊靈抑制TrxR1在人前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

用不同濃度的堆心菊靈處理DU145和PC-3 2種前列腺癌細(xì)胞，采用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平。如圖3所示，隨著堆心菊靈濃度的增加，DU145和PC-3細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平逐漸降低。表明堆心菊靈可以抑制在人前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，且呈劑量相關(guān)性。

與堆心菊靈（0 μmol·L?1）組比較：*P＜0.05 ***P＜0.001

3.4 堆心菊靈促進(jìn)人前列腺癌細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生

進(jìn)一步分析堆心菊靈是否可以調(diào)節(jié)人前列腺癌細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的凋亡。如圖4所示，與對(duì)照組相比，堆心菊靈能夠升高DU145和PC-3細(xì)胞中ROS水平；2種前列腺癌細(xì)胞經(jīng)ROS抑制劑NAC預(yù)處理1 h可以明顯減弱堆心菊靈誘導(dǎo)的ROS升高。表明堆心菊靈促進(jìn)人前列腺癌細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生。

3.5 沉默TrxR1表達(dá)促進(jìn)人前列腺癌細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生

為了沉默的表達(dá)，設(shè)計(jì)了2個(gè)靶向TrxR1的siRNAs并分別轉(zhuǎn)染到DU145和PC-3細(xì)胞中。qRT-PCR結(jié)果（圖5-A、B）表明，2個(gè)siRNAs均有效地抑制了2種細(xì)胞中的表達(dá)，其中si-#1敲除效果更佳。因此，選取si-#1用于接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)。敲除后，通過(guò)DCFH-DA染色檢測(cè)DU145和PC-3細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，如圖5-C所示，與si-NC組相比，si-1組2種前列腺癌細(xì)胞ROS水平明顯升高。表明沉默促進(jìn)人前列腺癌細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生。

3.6 堆心菊靈通過(guò)靶向TrxR1促進(jìn)人前列腺癌細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生

為了過(guò)表達(dá)DU145和PC-3細(xì)胞中的TrxR1，將編碼TrxR1蛋白的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到前列腺癌細(xì)胞中。qRT-PCR結(jié)果（圖6-A、B）顯示，TrxR1在DU145和PC-3細(xì)胞中被過(guò)表達(dá)。DCFH-DA染色結(jié)果（圖6-C）顯示，TrxR1過(guò)表達(dá)明顯抑制了前列腺癌細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，堆心菊靈能夠明顯改善前列腺癌細(xì)胞中由于TrxR1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的ROS減少。表明堆心菊靈通過(guò)靶向TrxR1促進(jìn)人前列腺癌細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生。

圖4 堆心菊靈促進(jìn)人前列腺癌細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生

qRT-PCR法檢測(cè)DU145 (A) 和PC-3細(xì)胞(B) 中siRNAs靶向TrxR1的敲除效果 經(jīng)si-NC或者si-TrxR1轉(zhuǎn)染后，DCFH-DA染色法檢測(cè)DU145 (C) 和PC-3細(xì)胞(D) 中ROS的產(chǎn)生 與si-NC組比較：***P＜0.001

4 討論

堆心菊靈在人類(lèi)多種癌細(xì)胞中均表現(xiàn)出有效的抗癌效果，但其對(duì)前列腺癌的作用及機(jī)制尚不清楚。本研究考察了堆心菊靈在DU145和PC-3細(xì)胞2種前列腺癌細(xì)胞中的抗癌作用，發(fā)現(xiàn)堆心菊靈可以通過(guò)靶向TrxR1促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮抗癌作用，表明堆心菊靈可能是一種有前景的抗前列腺癌藥物。

研究報(bào)道，MHY440可以通過(guò)ROS依賴(lài)的DNA損傷，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期阻滯[10]；Brosimone I可能通過(guò)ROS介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的凋亡和G1細(xì)胞周期阻滯[11]。本研究結(jié)果顯示，堆心菊靈可以誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，堆心菊靈可以減輕急性肝損傷小鼠中ROS的產(chǎn)生[8]。ROS可作為由堆心菊靈誘導(dǎo)的實(shí)體瘤細(xì)胞死亡的關(guān)鍵介質(zhì)[12]。然而，經(jīng)ROS抑制劑預(yù)處理后，堆心菊靈對(duì)前列腺癌細(xì)胞的抑制作用被減輕。因此，堆心菊靈是否通過(guò)誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生進(jìn)而促進(jìn)前列腺癌的凋亡和細(xì)胞周期阻滯，需要更多的研究來(lái)驗(yàn)證。

TrxR是腫瘤的一個(gè)關(guān)鍵的治療靶點(diǎn)[13]。TrxR1與前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。與正常組織相比，TrxR1在前列腺癌組織顯著高表達(dá)。靶向TrxR1可以改善前列腺癌患者的預(yù)后[14]。本研究結(jié)果顯示，堆心菊靈降低了DU145和PC-3細(xì)胞中的表達(dá)，且呈劑量相關(guān)性。因此，TrxR1可能是堆心菊靈的潛在靶點(diǎn)。研究報(bào)道，抑制TrxR1可以誘導(dǎo)ROS在胃癌細(xì)胞中的積累[15]。敲低后，在DU145和PC-3細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果；過(guò)表達(dá)TrxR1降低了ROS的產(chǎn)生。據(jù)報(bào)道，抑制TrxR1可以刺激乳腺癌[16]和肝細(xì)胞癌[17]的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴(lài)性的細(xì)胞凋亡。因此，堆心菊靈可以通過(guò)降低前列腺癌細(xì)胞中TrxR1的表達(dá)來(lái)促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡。

qRT-PCR法檢測(cè)DU145 (A) 和PC-3細(xì)胞(B) 中TrxR1過(guò)表達(dá)的效果 經(jīng)TrxR1過(guò)表達(dá)質(zhì)?；蛘叨研木侦`處理后，DCFH-DA染色法檢測(cè)DU145 (C) 和PC-3細(xì)胞(D) 中ROS的產(chǎn)生 與空質(zhì)粒組比較：***P＜0.001

綜上所述，堆心菊靈能夠通過(guò)靶向TrxR1發(fā)揮抗前列腺癌作用，其作用機(jī)制可能與ROS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。堆心菊靈可能是一種有前景的抗前列腺癌藥物，值得更深入的研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of helenalin on reactive oxygen species in human prostate cancer cells based on thioredoxin reductase 1

PAN Cong-tao1, ZHANG Xiao-yan2, LIAO Ai-ling2, PAN Hai-fei3, ZHOU Chao-feng2, YANG Yu2

1. Department of Anesthesia Surgery, Wenzhou Central Hospital, Wenzhou 325000, China 2. Department of Urology, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China 3. Department of Anesthesia Surgery, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China

To explore the anticancer effect and potential mechanism of helenalin in human prostate cancer cells.Human prostate cancer DU145 and PC-3 cells were treated with different concentrations of helenalin for 48 h, and cell viability was detected by CCK-8 method, thioredoxin reductase 1 () mRNA expression was detected by qRT-PCR method. The protein expression of TrxR1 in prostate cancer tissues and normal tissues was detected by human protein immunohistochemical expression database; After treated with helenalin or reactive oxygen species (ROS) inhibitors, the production of ROS was detected by DCFH-DA staining; Knockout or overexpression of TrxR1, ROS levels in two kinds of cells after treated with helenalin were detected.Helenalin significantly inhibited the survival rate of prostate cancer cells andmRNA expression (< 0.05, 0.001), with a concentration-dependent manner. Compared with normal tissues, TrxR1 is highly expressed in prostate cancer tissues. Helenalin significantly induced ROS production in prostate cancer cells, knockdown ofsignificantly increased ROS level in prostate cancer cells, and overexpression of TrxR1 inhibited the production of ROS in prostate cancer cells.Helenalin can promote the production of ROS by targeting TrxR1 in human prostate cancer cells, thereby exerting an anti-prostate cancer effect.

helenalin; thioredoxin reductase 1; reactive oxygen species; prostate cancer cells; anticancer

R285.5

A

0253 - 2670(2022)07 - 2078 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.07.017

2021-12-17

溫州市科技計(jì)劃經(jīng)費(fèi)自籌項(xiàng)目（Y20180481）

潘聰桃，主管護(hù)師，本科，研究方向?yàn)槊谀蛳到y(tǒng)腫瘤護(hù)理。E-mail: 435569205@qq.com

楊 宇，主治醫(yī)師，碩士研究生，研究方向?yàn)槊谀蛳到y(tǒng)腫瘤。E-mail: 83292199@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]