時(shí)海燕，孫 蓉，徐 男

三棱含藥血清對(duì)脂多糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究

時(shí)海燕1，孫 蓉2，徐 男3*

1. 山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（山東省千佛山醫(yī)院）臨床藥學(xué)，山東省兒童藥物臨床評(píng)價(jià)與研發(fā)工程技術(shù)研究中心，山東省醫(yī)藥衛(wèi)生臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014 2. 山東大學(xué) 高等醫(yī)學(xué)研究院，山東 濟(jì)南 250014 3. 山東省中醫(yī)藥研究院 中藥制劑研究所，山東 濟(jì)南 250014

研究三棱含藥血清對(duì)脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）損傷的影響。SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組和三棱組，制備空白血清及含藥血清。建立LPS誘導(dǎo)的HUVEC損傷模型，設(shè)置對(duì)照組、模型組、5%空白血清組和三棱含藥血清（1%、3%、5%）組，采用MTT法檢測(cè)三棱含藥血清對(duì)細(xì)胞活力的影響；采用熒光顯微鏡分析各組細(xì)胞線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）和活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平；采用ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，Caspase-1）活性和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、IL-17、組織因子（tissue factor，TF）、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、凝血酶調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin，TM）水平；采用Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 II（microtubule-associated protein l light chain 3 II），LC3 II）、Beclin-1、Parkin和PINK蛋白表達(dá)情況；采用qRT-PCR法測(cè)定各組細(xì)胞、和NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，）mRNA表達(dá)情況。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞活力、MPP顯著降低（＜0.01），細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高（＜0.01），上清液LDH、Caspase-1活性和TNF-α、IL-6、IL-17、TF、vWF、TM水平均顯著升高（＜0.01），LC3 II、Beclin-1、Parkin和PINK蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01），、和mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）。與模型組比較，三棱含藥血清組細(xì)胞活力、MPP顯著升高（＜0.01），細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低（＜0.05、0.01），上清液LDH、Caspase-1活性和TNF-α、IL-6、IL-17、TF、vWF、TM水平均顯著降低（＜0.01），LC3 II、Beclin-1、Parkin和PINK蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01），、和mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）。三棱含藥血清具有內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用，可以降低LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷和炎癥，降低凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

三棱；含藥血清；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；脂多糖；氧化損傷；炎癥

血栓性疾病已超過(guò)惡性腫瘤成為威脅人類(lèi)健康和生命的重大疾病?，F(xiàn)代抗血栓藥物具有起效迅速的優(yōu)點(diǎn)，但作用機(jī)制單一，長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生藥物抵抗和增加出血風(fēng)險(xiǎn)等不良反應(yīng)。三棱為黑三棱科植物黑三棱Buch.-Ham.的干燥塊莖，具有破血行氣、消積止痛等功效，主要含有苯丙素類(lèi)、黃酮類(lèi)、蒽醌類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、生物堿類(lèi)、甾體類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、二肽類(lèi)等成分[1-3]，被譽(yù)為“破血逐瘀之要藥”“破血之王”。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，三棱水煎劑及其不同炮制品具有顯著的抗血小板聚集、抗凝及抗血栓活性[1]。本課題組前期亦發(fā)現(xiàn)三棱總提取物和醋酸乙酯部位能顯著增加斑馬魚(yú)血栓模型的心臟染色強(qiáng)度，確證了三棱的抗血栓療效[4]，但其抗血栓的作用機(jī)制尚未有研究。本研究從細(xì)胞活性、細(xì)胞自噬、炎癥損傷、氧化應(yīng)激、凝血功能5個(gè)層面，研究三棱含藥血清對(duì)脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）損傷的影響，為抗血栓藥物的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞株

SPF級(jí)SD雄性大鼠20只，體質(zhì)量（300±20）g，4周齡，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，許可證號(hào)SCXK（魯）20190003。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（山東省千佛山醫(yī)院）倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為［2021］動(dòng)倫審字（S845）號(hào)。HUVEC細(xì)胞株購(gòu)自無(wú)錫菩禾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

1.2 藥材

三棱購(gòu)自山東百味堂中藥飲片有限公司，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院中藥資源研究室靳光乾研究員鑒定為黑三棱科植物黑三棱Buch.-Ham.削去外皮的干燥塊莖。取三棱藥材1 kg，粉碎至粗粉，用80%乙醇浸提2次，合并提取液，減壓濃縮，聚酰胺柱色譜純化，濃縮定容至100 mL得三棱提取物，主要成分為酚類(lèi)物質(zhì)，其中阿魏酸、對(duì)羥基苯甲酸、原兒茶酸質(zhì)量濃度分別為0.91、0.80、1.22 mg/mL。

1.3 藥品與試劑

LPS（批號(hào)L8880）、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（批號(hào)M8650）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)CA1410）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，Caspase-1）活性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)BC3810）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；SYBR Green PCR試劑盒（批號(hào)F-415XL）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)K1622）購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測(cè)定試劑盒（批號(hào)A020-2）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)BL521A）購(gòu)自Biosharp公司；人組織因子（tissue factor，TF）ELISA試劑盒（批號(hào)YB-TF-Hu）、人血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）ELISA試劑盒（批號(hào)YB-vWF-Hu）、人凝血酶調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin，TM）ELISA試劑盒（批號(hào)YB-TM-Hu）購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司；人腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號(hào)JYM0110Hu）、人白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號(hào)JYM0140Hu）、人IL-17 ELISA試劑盒（批號(hào)JYM0082Hu）購(gòu)自武漢基因美科技有限公司；胎牛血清、青-鏈霉素購(gòu)自上海雙洳生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇購(gòu)自上海國(guó)藥；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 II（microtubule-associated protein l light chain 3 II），LC3 II）兔抗（批號(hào)NB100-2220）購(gòu)自美國(guó)Novus公司；Beclin 1兔抗（批號(hào)ab210498）、Parkin鼠抗（批號(hào)ab77924）、PINK1兔抗（批號(hào)ab23707）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；GAPDH鼠抗（批號(hào)60004-1-Ig）購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)ZB2301）、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（批號(hào)ZB2305）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器

MK3型酶標(biāo)儀、8000型細(xì)胞培養(yǎng)箱、移液器（美國(guó)賽默飛公司）；7500型qRT-PCR儀（美國(guó)ABI公司）；Qilinbeier TS-1000型搖床（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；IX71型倒置拍照顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；TDZ4-WS型低速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；3K15型低溫冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；PS-9型電轉(zhuǎn)儀（大連競(jìng)邁科技有限公司）；HI1210型水浴鍋（德國(guó)Leica公司）；ChemiScope 5300 Pro一體式化學(xué)發(fā)光成像儀（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、給藥及含藥血清的制備

20只SPF級(jí)SD雄性大鼠，隨機(jī)分為空白組（去離子水）和三棱組，每組10只。三棱組ig三棱提取物（5 mL/kg），2次/d，連續(xù)2 d。第4次給藥后2 h，麻醉大鼠，心尖取血，靜置1 h，3000×離心10 min，分離血清，?80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫糜诩?xì)胞給藥前經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)除菌。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HUVEC用含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 三棱含藥血清對(duì)細(xì)胞活力的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC，以1×105/mL接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。設(shè)置對(duì)照組、模型組、5%空白血清組、1%含藥血清組、3%含藥血清組和5%含藥血清組。用完全培養(yǎng)基稀釋LPS，使其終質(zhì)量濃度為1 μg/mL，除對(duì)照組外，其余各組加入LPS；各給藥組加入以含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基稀釋的血清，培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μL MTT，避光孵育3～4 h，棄去上清液，加入150 μL二甲基亞砜，室溫振蕩孵育10 min；采用酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm處的吸光度（）值。

2.4 三棱含藥血清對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）的影響

按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和給藥，培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)液，PBS溶液沖洗1遍，分別加入2 μmol/L JC-10（線粒體膜電位熒光探針），37 ℃避光孵育30 min，PBS溶液洗滌細(xì)胞3次，DAPI染核，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 三棱含藥血清對(duì)細(xì)胞ROS的影響

按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和給藥，培養(yǎng)48 h。按1∶1000用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA探針，使終濃度為10 μmol/L，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入DCFH-DA，37 ℃孵育20 min，用10%胎牛血清洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，于熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 三棱含藥血清對(duì)細(xì)胞上清液LDH、Caspase-1活性和TNF-α、IL-6、IL-17、TF、vWF、TM水平的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC，以1×105/mL接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。設(shè)置對(duì)照組、模型組、5%空白血清組和5%含藥血清組。用完全培養(yǎng)基稀釋LPS，使其終質(zhì)量濃度為1 μg/mL，除對(duì)照組外，其余各組加入LPS；各給藥組加入以含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基稀釋的血清，培養(yǎng)48 h。收集上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定LDH、Caspase-1活性和TNF-α、IL-6、IL-17、TF、vWF、TM水平。

2.7 三棱含藥血清對(duì)細(xì)胞LC3II、Beclin-1、Parkin和PINK蛋白表達(dá)的影響

收集“2.6”項(xiàng)下各組細(xì)胞，提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，加入5×SDS上樣緩沖液，混合均勻后，沸水浴5 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，37 ℃封閉2 h；分別加入LC3II、Beclin-1、Parkin、PINK和GAPDH抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST沖洗3次，1 min/次，加入相應(yīng)二抗（1∶5000），37 ℃孵育l h；TBST沖洗3次，5 min/次，加入ECL發(fā)光液顯影，采用一體式化學(xué)發(fā)光儀拍攝。

2.8 三棱含藥血清對(duì)細(xì)胞IL-1β、IL-18和NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）mRNA表達(dá)的影響

按“2.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和給藥，收集細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

引物序列(5’-3’) IL-1βF: GAATCTGTACCTGTCCTGCGTGTTG R: GTCAGTTATATCCTGGCCGCCTTTG NLRP3F: AGCACTAATCAGAATCTCACGCACC R: ACTTCACAGAACATCATGACCCCCA IL-18F: GTATAAAGATAGCCAGCCTAGAGGT R: TTTCAAAATGAGTTTAAAAAGGTCT GAPDHF: AGAAGGCTGGGGCTCATTTG R: AGGGGCCATCCACAGTCTTC

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 三棱含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞活力的影響

如表2所示，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞活力顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，含藥血清組細(xì)胞活力均顯著升高（＜0.01），且呈劑量相關(guān)性。

3.2 三棱含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞MMP的影響

MMP較高時(shí)，JC-10聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光；MMP較低時(shí)，JC-10不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-10為單體，呈現(xiàn)綠色熒光。MMP下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。如圖1所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞MMP顯著下降（＜0.01），主要呈現(xiàn)綠色熒光。與模型組比較，含藥血清組細(xì)胞MMP呈現(xiàn)不同程度地升高（＜0.01），紅色熒光逐漸增強(qiáng)，綠色熒光逐漸減弱，且呈劑量相關(guān)性。

表2 三棱含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞活力的影響(, n = 3)

Table 2 Effect of Sparganii Rhizoma-containing serum on cell viability induced by LPS(, n = 3)

組別A值 對(duì)照0.849±0.015 模型0.493±0.010** 5%空白血清0.499±0.015 1%含藥血清0.535±0.014## 3%含藥血清0.641±0.013## 5%含藥血清0.740±0.012##

與對(duì)照組比較：**＜0.01；與模型組比較：##＜0.01，下表同

**< 0.01control group;##< 0.01model group, same as below tables

3.3 三棱含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞ROS的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，含藥血清組細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)不同程度地降低（＜0.05、0.01），且呈劑量相關(guān)性。

3.4 三棱含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞上清液LDH、Caspase-1活性和TNF-α、IL-6、IL-17、TF、vWF、TM水平的影響

如表3所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞上清液LDH、Caspase-1活性和TNF-α、IL-6、IL-17、TF、vWF、TM水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，含藥血清組細(xì)胞上清液中LDH、Caspase-1活性和TNF-α、IL-6、IL-17、TF、vWF、TM水平均顯著降低（＜0.01）。

3.5 三棱含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞LC3 II、Beclin-1、Parkin和PINK蛋白表達(dá)的影響

如圖3和表4所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞LC3 II、Beclin-1、Parkin和PINK蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，含藥血清組細(xì)胞LC3 II、Beclin-1、Parkin和PINK蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01）。

3.6 三棱含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞IL-1β、IL-18和NLRP3 mRNA表達(dá)的影響

如表5所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞、和mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，含藥血清組細(xì)胞、和mRNA表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01）。

與對(duì)照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：##P＜0.01

與對(duì)照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

表3 三棱含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞上清液LDH、Caspase-1活性和TNF-α、IL-6、IL-17、TF、vWF、TM水平的影響(, n = 3)

Table 3 Effect of Sparganii Rhizoma-containing serum on LDH, Caspase-1 activities and TNF-α, IL-6, IL-17, TF, vWF, TM levels in supernatant of cells induced by LPS(, n = 3)

組別LDH/(U·L?1)Caspase-1/%TNF-α/(pg·mL?1)IL-6/(ng·L?1) 對(duì)照217.95±11.13100.00174.24±5.2481.09±3.13 模型376.41±12.44**176.12±11.53**286.04±9.55**150.46±2.38** 5%空白血清380.51±7.59173.59±7.05288.13±7.51153.54±3.73 5%含藥血清257.95±7.27##119.55±4.01##229.10±9.39##117.66±2.84## 組別IL-17/(pg·mL?1)TF/(ng·L?1)vWF/(U·L?1)TM/(μg·L?1) 對(duì)照187.08±10.3682.46±3.00254.61±4.1923.57±1.91 模型409.06±11.97**124.52±3.72**332.39±10.05**32.90±0.75** 5%空白血清405.19±13.15125.71±3.15335.17±7.2633.11±0.56 5%含藥血清282.49±8.74##108.45±3.90##289.06±3.47##28.84±0.71##

圖3 三棱含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞LC3II、Beclin-1、Parkin和PINK蛋白表達(dá)的影響

表4 三棱含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞LC3 II、Beclin-1、Parkin和PINK蛋白表達(dá)的影響(, n = 6)

Table 4 Effect of Sparganii Rhizoma-containing serum on LC3 II, Beclin-1, Parkin and PINK protein expressions of cells induced by LPS(, n = 6)

組別蛋白相對(duì)表達(dá)量LC3 IIBeclin-1ParkinPINK 對(duì)照1.00±0.081.00±0.061.00±0.061.00±0.05 模型3.08±0.08**2.03±0.06**2.78±0.06**1.95±0.06** 5%空白血清3.11±0.081.98±0.062.82±0.061.85±0.05 5%含藥血清1.73±0.09##1.54±0.07##1.74±0.07##1.54±0.06##

表5 三棱含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞IL-1β、IL-18和NLRP3 mRNA表達(dá)的影響(, n = 6)

Table 5 Effect of Sparganii Rhizoma-containing serum on IL-1β, IL-18 and NLRP3 mRNA expressions of cells induced by LPS(, n = 6)

組別mRNA相對(duì)表達(dá)量 IL-1βNLRP3IL-18 對(duì)照1.00±0.071.01±0.121.00±0.03 模型3.75±0.19**4.94±0.16**3.67±0.12** 5%空白血清3.87±0.224.92±0.363.78±0.09 5%含藥血清1.70±0.18##2.28±0.17##1.97±0.22##

4 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能異常，均可使凝血和抗凝血平衡發(fā)生紊亂，啟動(dòng)血栓形成，血小板繼而在損傷的血管內(nèi)膜外黏附、聚集，導(dǎo)致血小板活化及釋放反應(yīng)。血栓形成和炎癥傳統(tǒng)上被視為是不同的互補(bǔ)過(guò)程，認(rèn)為血栓是過(guò)度的止血反應(yīng)導(dǎo)致形成閉塞的血凝塊，炎癥是對(duì)有害刺激的復(fù)雜保護(hù)性免疫反應(yīng)，然而，隨著炎癥刺激血栓形成，進(jìn)而血栓形成促進(jìn)炎癥形成的不斷認(rèn)識(shí)，血栓與炎癥的功能依賴(lài)已經(jīng)變得逐漸明確[5]。

本課題組前期采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了三棱抗血栓形成的分子靶標(biāo)，主要包括蛋白激酶Cδ（protein kinase Cδ，PRKCD）、磷酸腺苷激活的蛋白激酶α2催化亞基（adenosine monophosphate-activated protein kinase catalytic aubunit α2，PRKAA2）、Na+,K+三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶1α1亞基（Na+,K+ATPase α1，ATP1A1）、細(xì)胞色素C氧化酶亞基7C（cytochrome C oxidase subunit 7C，COX7C）等[6]。PRKAA2與PRKCD可激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號(hào)通路，AMPK進(jìn)一步負(fù)性調(diào)控哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）[7]，UNC-51樣激酶1（uncoordinated 51 like kinase 1，ULK1）被激活，磷酸化Beclin-1的Ser14位點(diǎn)，由此提高空泡分選蛋白34（vacuolar protein-sorting 34，VPS34）復(fù)合體活性，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。ATP1A1可以激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路，同時(shí)Akt又是FOXO3a的上游調(diào)控關(guān)鍵因子，激活FOXO3a可負(fù)性調(diào)控mTOR，進(jìn)一步誘導(dǎo)自噬[8]。適度的自噬有利于維持機(jī)體細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，以適應(yīng)外環(huán)境的變化，而超負(fù)荷的刺激將誘發(fā)機(jī)體過(guò)度自噬，導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂，嚴(yán)重者甚至引發(fā)炎癥的瀑布性放大作用[9-11]。COX是參與機(jī)體氧化應(yīng)激的重要蛋白。本研究結(jié)果顯示，三棱含藥血清可以顯著降低LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度，并呈劑量相關(guān)性，5%含藥血清抑制作用最為明顯；三棱含藥血清可以顯著下調(diào)線粒體自噬相關(guān)蛋白LC3 Ⅱ、Beclin-1、Parkin和PINK的表達(dá)，表明三棱含藥血清可以調(diào)控氧化應(yīng)激及線粒體自噬。

線粒體自噬主要由線粒體氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS激活，同時(shí)，ROS亦是調(diào)控NLRP3炎癥小體活化的關(guān)鍵信號(hào)[12]，線粒體自噬調(diào)控線粒體質(zhì)量，減少受損線粒體數(shù)目，從而防止ROS誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化[13-14]。NLRP3炎癥小體亦可調(diào)控細(xì)胞自噬，Caspase-1可通過(guò)切割自噬底物來(lái)負(fù)調(diào)控自噬水平[15]。同時(shí)，炎癥小體激活是導(dǎo)致血液凝結(jié)的觸發(fā)器，并誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，上調(diào)凝血相關(guān)蛋白酶表達(dá)，產(chǎn)生凝血和炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，三棱含藥血清可顯著抑制細(xì)胞上清液中Caspase-1活性，下調(diào)、mRNA表達(dá)水平，顯著降低炎性因子TNF-α、IL-6、IL-17、IL-18和促栓因子TF、vWF、TM水平，提示三棱含藥血清經(jīng)胃腸道吸收進(jìn)入體內(nèi)后的代謝產(chǎn)物可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞線粒體自噬-炎癥小體NLRP3通路，修復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，降低促栓因子表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Protective effect of-containing serum on lipopolysaccharide-induced human umbilical vein endothelial cells injury

SHI Hai-yan1, SUN Rong2, XU Nan3

1. Shandong Medicine and Health Key Laboratory of Clinical Pharmacy, Shandong Engineering and Technology Research Center for Pediatric Drug Development, Department of Clinical Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University & Shandong Provincial Qianfoshan Hospital, Jinan 250014, China 2. Institute of Advanced Medical Sciences, Shandong University, Jinan 250014, China 3. Institute of Traditional Chinese Medicine Preparation, Shandong Research Academy of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, China

To study the effect of Sanleng (, SR) medicated serum on lipopolysaccharides (LPS)-induced injury of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC).SPF male SD rats were randomly divided into blank group and SR group, blank serum and drug-containing serum were prepared. LPS-induced HUVEC injury model was established, and were divided into control group, model group, 5% blank serum group and SR medicated serum (1%, 3%, 5%) group, MTT method was used to detect the effect of SR medicated serum on cell viability. Fluorescence microscopy was used to analyze the mitochondrial membrane potential (MMP) and reactive oxygen species (ROS) levels of cells in each group; ELISA was used to detect lactate dehydrogenase (LDH), cystein-asparate protease-1 (Caspase-1) activities and tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), IL-6, IL-17, tissue factor (TF), von Willebrand factor (vWF), thrombomodulin (TM) in supernatant of cells in each group. Western blotting was used to detect the protein expressions of microtubule-associated protein l light chain 3 II (LC3 II), Beclin-1, Parkin and PINK of cells in each group; qRT-PCR was used to detect the mRNA expressions of,and NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3 () of cells in each group.Compared with control group, cell viability and MPP in model group were significantly decreased (< 0.01), level of intracellular ROS was significantly increased (< 0.01), activities of LDH and Caspase-1 in the supernatant and TNF-α, IL-6, IL-17, TF, vWF, TM levels were significantly increased (< 0.01), LC3 II, Beclin-1, Parkin and PINK protein expression levels were significantly increased (< 0.01),,andmRNA expression levels were significantly increased (< 0.01). Compared with model group, cell viability and MPP in SR drug-containing serum group were significantly increased (< 0.01), level of intracellular ROS was significantly decreased (< 0.05, 0.01), activities of LDH and Caspase-1 in the supernatant and TNF-α, IL-6, IL-17, TF, vWF, TM levels were significantly decreased (< 0.01), protein expressions of LC3 II, Beclin-1, Parkin and PINK were significantly decreased (< 0.01),,andmRNA expression levels were significantly decreased (< 0.01).SR medicated serum has the protective effect of endothelial cells, which can reduce LPS-induced oxidative damage and inflammation, and reduce the coagulation cascade.

; medicated serum; human umbilical vein endothelial cells; lipopolysaccharide; oxidative damage; inflammation

R285.5

A

0253 - 2670(2022)07 - 2064 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.07.015

2021-11-22

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（ZR2015HL117）；山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2017-165）；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017CXGC1308）；山東省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（ZR2020KH017）；山東省高校中藥質(zhì)量控制與全產(chǎn)業(yè)鏈建設(shè)協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目（CYLXTCX2020-03，CYLXTCX2021-02）

時(shí)海燕，博士，主任藥師，從事中藥藥效物質(zhì)與藥動(dòng)學(xué)研究。E-mail: shihaiyan123@163.com

徐 男，博士，副研究員，從事中藥新藥開(kāi)發(fā)與藥效物質(zhì)研究。E-mail: 93679706@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]