胡鐘姣，鄭露露，許光亞，郭曉恒，時(shí) 政*

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和質(zhì)量源于設(shè)計(jì)理念的梔子豉湯提取工藝研究

胡鐘姣1, 2，鄭露露3，許光亞4，郭曉恒4，時(shí) 政1, 2*

1. 成都大學(xué)附屬醫(yī)院/臨床醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610081 2. 遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 遵義 563000 3. 成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106 4. 成都大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610106

采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討梔子豉湯治療失眠的作用機(jī)制；基于質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（quality by design，QbD）理念，構(gòu)建并驗(yàn)證梔子豉湯提取工藝的設(shè)計(jì)空間。通過(guò)TCMSP、PharmMapper、Drugbank、GeneCards、Therapeutic Target Database、OMIM等數(shù)據(jù)庫(kù)獲取梔子豉湯的成分和對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)；利用STRING、DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)梔子豉湯治療失眠的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行分析。以梔子豉湯提取物中的梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、大豆苷元、染料木素的提取率及干膏得率作為關(guān)鍵質(zhì)量屬性（critical quality attributes，CQAs），Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選關(guān)鍵工藝參數(shù)（critical process parameters，CPPs），Box-Behnken實(shí)驗(yàn)對(duì)CPPs進(jìn)行優(yōu)化，并構(gòu)建梔子豉湯提取工藝的設(shè)計(jì)空間。梔子豉湯的主要活性成分梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、大豆苷元、染料木素等，通過(guò)作用于白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin- 6，IL-6）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、一氧化氮合酶3（nitric oxide synthase 3，NOS3）等核心靶點(diǎn)，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)活性配體-受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、γ-氨基丁酸能突觸（GABAergic synapse）、TNF因子信號(hào)通路（TNF signaling pathway）等信號(hào)通路發(fā)揮治療失眠的作用。梔子豉湯提取工藝的設(shè)計(jì)空間范圍為溶劑用量8～11倍、提取時(shí)間為30～84 min，提取次數(shù)為1～2次。梔子豉湯可能通過(guò)多成分-多靶點(diǎn)-多通路治療失眠?；赒bD理念建立的梔子豉湯提取工藝設(shè)計(jì)空間，穩(wěn)健可靠，可為其制劑的工藝開發(fā)提供參考。

梔子豉湯；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；失眠；分子對(duì)接；質(zhì)量源于設(shè)計(jì)；設(shè)計(jì)空間；提取工藝；梔子苷；京尼平龍膽雙糖苷；大豆苷元；染料木素；白細(xì)胞介素-1β；白細(xì)胞介素-6；雌激素受體1；一氧化氮合酶3

梔子豉湯始載于東漢末年醫(yī)圣張仲景的《傷寒論》太陽(yáng)、陽(yáng)明篇，由梔子和淡豆豉2味中藥組成[1]。梔子，味苦性寒，入心、肺、三焦經(jīng)，具有瀉火除煩的功效，尤其善瀉心火而除煩[2]?！侗静菡份d：“梔子，若用佐使，治有不同：加茵陳除濕熱黃疸，加豆豉除心火煩躁”。淡豆豉，味辛甘微苦性寒，歸肺、胃經(jīng)，具有解表除煩、宣發(fā)郁熱的功效。其氣味輕薄，既能解表宣熱，載梔子上行，又能降胃和中，兩藥合用，共奏清宣胸中郁熱，古代用于治療虛煩不得眠，心中懊惱之癥[3]。現(xiàn)代臨床主要用本方或加味治療失眠、抑郁、更年期綜合征、心血管疾病、胃脘疼痛等[4-5]，療效顯著。中藥具有多成分、多途徑和多靶點(diǎn)協(xié)同作用等特點(diǎn)，在預(yù)防和治療疾病方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但同時(shí)也對(duì)深入研究其治療疾病的作用機(jī)制帶來(lái)困難[6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門新興的學(xué)科，是在系統(tǒng)生物學(xué)與計(jì)算機(jī)技術(shù)高速發(fā)展的背景下發(fā)展起來(lái)的，其通過(guò)揭示中藥化合物的作用和治療機(jī)制來(lái)研究藥物、靶點(diǎn)和疾病之間的關(guān)系，闡明中藥對(duì)疾病的作用機(jī)制[7-9]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的系統(tǒng)性質(zhì)與中醫(yī)的整體觀點(diǎn)相一致，可以為研究中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供新的、有益的技術(shù)支持，在一定程度上反映了中藥研究的新趨勢(shì)[10-12]。

質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（quality by design，QbD）是一種系統(tǒng)性研究方法，是通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（design of experiment，DoE）來(lái)評(píng)價(jià)關(guān)鍵質(zhì)量屬性（critical quality attributes，CQAs）和關(guān)鍵工藝參數(shù)（critical process parameters，CPPs）間的關(guān)系模型[13-14]。在多響應(yīng)變量下，通過(guò)構(gòu)建設(shè)計(jì)空間來(lái)確定最佳工藝參數(shù)范圍，從而建立穩(wěn)定可靠的生產(chǎn)工藝，最終保障產(chǎn)品質(zhì)量[15]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)梔子豉湯治療失眠的活性成分、潛在作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制，同時(shí)利用分子對(duì)接技術(shù)來(lái)進(jìn)一步預(yù)測(cè)重要活性成分和潛在靶點(diǎn)的結(jié)合能力。此外，以QbD理念為指導(dǎo)，利用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，從多個(gè)影響因素中篩選影響梔子豉湯有效成分提取的CPPs，隨后用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)篩選出的CPPs進(jìn)行優(yōu)化，建立梔子豉湯提取工藝的設(shè)計(jì)空間。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Essentia LC-16高效液相色譜儀，島津儀器（蘇州）有限公司；CP224C電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；十萬(wàn)分之一天平，天津市德安特傳感技術(shù)有限公司；SB-5200DTD超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；JL-UPT-I I-10T實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)，四川金瀾科技有限公司。

1.2 試藥與試劑

對(duì)照品梔子苷（批號(hào)MUST-20102310，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、大豆苷元（批號(hào)MUST-20101107，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；京尼平龍膽雙糖苷（批號(hào)P27S10F96112，質(zhì)量分 數(shù)≥98%）、染料木素（批號(hào)Y19D7C27145，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；乙腈，色譜純，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；冰醋酸（色譜純）、甲醇（分析純），成都市科隆化學(xué)品有限公司；水為超純水。

梔子（批號(hào)20110206，產(chǎn)地江西）、淡豆豉（批號(hào)20110104，產(chǎn)地四川）均購(gòu)自四川國(guó)強(qiáng)中藥飲片有限公司，經(jīng)成都大學(xué)郭曉恒教授鑒定，分別為茜草科梔子屬植物梔子Ellis的干燥成熟果實(shí)、豆科豆屬植物大豆(L.) Merr.的干燥成熟種子（黑豆）的發(fā)酵加工品。

2 方法與結(jié)果

2.1 梔子豉湯網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.1.1 梔子豉湯成分收集 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php）和查閱相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[16-17]對(duì)梔子豉湯中的成分進(jìn)行整理、分析，得到梔子豉湯成分14個(gè)，結(jié)果如表1所示。

表1 梔子豉湯的成分信息

Table 1 Chemical composition information of ZD

來(lái)源成分PubChem CID分子式 梔子西紅花酸5281232C20H24O4 綠原酸1794427C16H18O9 京尼平442424C11H14O5 京尼平苷酸443354C16H22O10 西紅花苷I5281233C44H64O24 梔子苷107848C17H24O10 熊果酸64945C30H48O3 京尼平龍膽雙糖苷3082301C23H34O15 淡豆豉黃豆黃素5317750C16H12O5 大豆苷元5281708C15H10O4 染料木苷5281377C21H20O10 大豆苷107971C21H20O9 染料木素5280961C15H10O5 黃豆黃苷187808C22H22O10

2.1.2 靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)與篩選 利用TCMSP平臺(tái)、PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.lilab-ecust.cn/ pharmmapper/）對(duì)成分靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，使用UniProt網(wǎng)站（https://www.uniprot.org/）對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行基因名轉(zhuǎn)換、校正。以失眠（insomnia、sleeplessness、wakefulness、agrypnia）為檢索詞，分別在數(shù)據(jù)庫(kù)Drugbank（https://www.drugbank.com/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）、Therapeutic Target Database（http://db.idrblab.net/ttd/）、OMIM（https:// omim.org/）中進(jìn)行檢索，合并并去除重復(fù)靶點(diǎn)，得到582個(gè)失眠相關(guān)靶點(diǎn)。利用微生信在線網(wǎng)站（http://www.bioinformatics.com.cn/）繪制成分靶點(diǎn)與失眠相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖，如圖1所示，得到51個(gè)梔子豉湯治療失眠的潛在作用靶點(diǎn)。

2.1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將得到的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），選擇物種為Homo sapiens，得到靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)信息，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行拓?fù)浞治?。如圖2所示，該網(wǎng)絡(luò)涉及48個(gè)節(jié)點(diǎn)和223條邊，度值（degree）的中位數(shù)為5，介度中心度（betweenness centrality）的中位數(shù)為16.845 9，緊密中心度（closeness centrality）的中位數(shù)為22.725。在此PPI網(wǎng)絡(luò)中度值較高的靶點(diǎn)有白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6，度值24）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF，度值21）、一氧化氮合酶3（nitric oxide synthase 3，NOS3，度值18）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β，度值18）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1，度值17）。度值越高，表明與其他靶點(diǎn)的相互作用越強(qiáng)，對(duì)疾病的影響也就越大。故可推測(cè)梔子豉湯中的活性成分可能作用于上述靶點(diǎn)而發(fā)揮治療失眠的作用。

圖1 梔子豉湯靶成分靶點(diǎn)與失眠相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.1.4 基因本體（gene ontology，GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 將靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行GO和KEGG富集分析，以＜0.05為篩選條件，得到相關(guān)分析結(jié)果。利用Bioinformatics（http:// www.bioinformatics.com.cn/）和Sangerbox（http:// sangerbox.com/index）在線網(wǎng)站分別對(duì)GO和KEGG結(jié)果進(jìn)行可視化。GO分析表明，梔子豉湯可能通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）級(jí)聯(lián)的正向調(diào)節(jié)（positive regulation of MAPK cascade）、γ-氨基丁酸信號(hào)通路（γ- aminobutyric acid signaling pathway）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction）等生物過(guò)程發(fā)揮治療作用，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 潛在靶點(diǎn)的GO富集分析

KEGG富集通路分析表明，梔子豉湯中的活性成分可能通過(guò)神經(jīng)活性配體-受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、γ-氨基丁酸能突觸（GABAergic synapse）、TNF因子信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）等通路發(fā)揮治療失眠的作用，見(jiàn)圖4。

2.1.5 分子對(duì)接驗(yàn)證 靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)通過(guò)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）獲取，化合物3D結(jié)構(gòu)通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/）獲取。利用Pymol軟件刪除蛋白質(zhì)分子中的無(wú)關(guān)小分子，并導(dǎo)入AutoDock Tools軟件進(jìn)行刪除水分子、加氫及設(shè)置原子類型操作。用ChemBio3D軟件對(duì)化合物進(jìn)行能量最小化，用AutoDock Tools軟件刪除水分子并添加原子電荷、分配原子類型。將處理后的化合物作為小分子配體，蛋白靶點(diǎn)作為受體，通過(guò)AutoDock vina軟件進(jìn)行對(duì)接。如表2所示，梔子豉湯中的活性成分除熊果酸與ESR1外，其余成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能均小于?5 kJ/mol，表明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合。其中黃豆黃苷、大豆苷、西紅花酸、染料木苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、京尼平苷酸與所選核心靶點(diǎn)的結(jié)合性均優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥。梔子豉湯的主要活性成分與核心靶點(diǎn)的對(duì)接情況表明，梔子豉湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)以上靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用。

2.2 梔子豉湯活性成分含量測(cè)定方法的建立

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取對(duì)照品梔子苷12.33 mg、京尼平龍膽雙糖苷10.03 mg、大豆苷元10.18 mg、染料木素11.51 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，分別精密移取上述對(duì)照品溶液適量，加甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密吸取梔子豉湯水提液1 mL，加甲醇定容至5 mL，搖勻，即得。

圖4 潛在靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

表2 活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接

Table 2 Molecular docking of the compound with target

成分結(jié)合能/(kJ?mol?1) IL-1βESR1IL-6NOS3TNF 京尼平苷酸?26.74?38.49?26.65?36.02?31.05 綠原酸?26.40?40.84?27.20?33.68?29.96 西紅花酸?30.75?44.10?26.53?37.28?31.71 大豆苷元?23.64?30.96?24.06?32.38?25.10 大豆苷?30.92?41.05?31.38?38.49?31.84 京尼平龍膽雙糖苷?28.28?39.71?30.12?42.84?36.61 京尼平?22.84?32.05?24.89?27.99?26.74 染料木素?24.39?31.59?27.20?33.39?25.82 染料木苷?28.45?42.26?25.65?37.40?32.26 大豆黃素?25.86?34.98?25.56?34.94?25.61 黃豆黃苷?31.80?41.17?29.62?38.45?31.59 熊果酸?25.65??25.52?35.44?31.05 梔子苷?27.57?39.12?26.90?38.49?31.71 地西泮?23.77?36.32?24.18?34.64?29.04

2.2.3 色譜條件

（1）梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷：色譜柱為Ecosil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（10∶90）；檢測(cè)波長(zhǎng)239 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；體積流量1 mL/min。

（2）大豆苷元、染料木素：色譜柱為Ecosil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈- 1%冰醋酸水溶液（25∶75）；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL；體積流量1 mL/min。

2.2.4 專屬性實(shí)驗(yàn) 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液和“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明，供試品溶液中各組分的色譜峰分離良好，且在對(duì)照品溶液相同的保留時(shí)間處有相同的色譜峰，見(jiàn)圖5。

2.2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取不同質(zhì)量濃度的系列對(duì)照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、大豆苷元、染料木素的回歸方程分別為＝15 871－6 007.6（＝0.999 7）、＝12 420＋32 753（＝0.999 6）、＝65 359－1 396.1（＝0.999 8）、＝89 274－2 331.7（＝0.999 6）。結(jié)果表明，梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、大豆苷元、染料木素分別在49.32～616.50、6.018～50.150、0.814 4～2.850 4、0.460 4～1.611 4 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、大豆苷元、染料木素峰面積的RSD分別0.39%、0.35%、0.58%、1.55%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、大豆苷元、染料木素提取率的RSD分別為3.18%、3.53%、1.07%、1.81%，表明該方法重復(fù)性良好。

圖5 混合對(duì)照品(A)和梔子豉湯樣品(B)的HPLC圖

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，分別在0、2、4、8、12、24 h按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、大豆苷元、染料木素峰面積的RSD分別為0.14%、1.96%、0.98%、0.99%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 樣品測(cè)定及提取率計(jì)算 將“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按照“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并參照文獻(xiàn)方法計(jì)算提取率[18]。

提取率＝各指標(biāo)成分質(zhì)量/總投藥量

2.3 干膏得率的測(cè)定

按干燥失重法進(jìn)行測(cè)定，精密量取梔子豉湯提取液25 mL于干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速稱定質(zhì)量，再于105 ℃干燥1 h，冷卻稱定質(zhì)量，反復(fù)干燥至恒定質(zhì)量（即±0.3 mg），即得水溶性浸出物的干燥品，計(jì)算干膏得率。

干膏得率＝(25)

為25 mL提取液中干浸膏質(zhì)量，為提取液總體積，為藥材質(zhì)量

2.4 梔子豉湯提取工藝優(yōu)化

2.4.1 CQAs和CPPs的確定 結(jié)合前期網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)結(jié)果、文獻(xiàn)研究熱度、具有一定藥理作用以及《中國(guó)藥典》2020年版對(duì)各味中藥指標(biāo)性成分的規(guī)定，將梔子苷（1）、京尼平龍膽雙糖苷（2）、大豆苷元（3）、染料木素（4）提取率和干膏得率（5）作為梔子豉湯的CQAs。

Plackett-Burman設(shè)計(jì)法是一種經(jīng)濟(jì)而有效的2水平實(shí)驗(yàn)方法，可以通過(guò)較少的實(shí)驗(yàn)快速?gòu)谋姸鄬?shí)驗(yàn)中篩選出顯著的影響因素，為后續(xù)的工藝優(yōu)化提供支持。以浸泡時(shí)間（1）、溶劑用量（2）、提取時(shí)間（3）、提取次數(shù)（4）作為篩選因素。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Minitab 18軟件進(jìn)行Plackett- Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)安排及結(jié)果見(jiàn)表3。

分別以1～5對(duì)1～5進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程：1＝37.110－0.1831＋1.8852＋3.0943＋8.0134，2＝3.110 6－0.044 61＋0.120 12＋0.681 73＋1.396 74，3＝0.318 31－0.004 141＋0.022 262＋0.035 013＋0.110 224，4＝ 0.168 33－0.005 001＋0.013 332＋0.021 673＋0.065 004，5＝5.47＋0.005 081＋0.2542＋0.058 803＋4.9504。

對(duì)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。由表可知，浸泡時(shí)間1的值均大于0.05，表明其對(duì)1、2、3、4、5的影響不顯著，而溶劑用量2或提取時(shí)間3、提取次數(shù)4對(duì)1、2、3、4、5有顯著影響。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的pareto圖，見(jiàn)圖6，最終確定溶劑用量2、提取時(shí)間3、提取次數(shù)4為CPPs。

2.4.2 Box-Behnken優(yōu)化提取工藝 根據(jù)Plackett- Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以溶劑用量（2）、提取時(shí)間（3）、提取次數(shù)（4）為自變量，以梔子苷（1）、京尼平龍膽雙糖苷（2）、大豆苷元（3）、染料木素（4）、干膏得率（5）為響應(yīng)值，對(duì)梔子豉湯提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。利用軟件Design-Expert 12，設(shè)計(jì)3因素3水平實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)安排與結(jié)果見(jiàn)表5。

2.4.3 設(shè)計(jì)空間的建立及驗(yàn)證 采用Matlab（2018b）軟件提供的Monte Carlo方法，其中計(jì)算步長(zhǎng)為0.02，達(dá)標(biāo)概率為0.9，模擬次數(shù)為1萬(wàn)次[19]，計(jì)算得到梔子豉湯的設(shè)計(jì)空間，見(jiàn)圖7，隨機(jī)選取4個(gè)點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)平行2次，以提取液中梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、大豆苷元、染料木素的提取率和干膏得率的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)（綜合評(píng)分＝梔子苷提取率×30/最大梔子苷提取率＋京尼平龍膽雙糖苷提取率×20/最大京尼平龍膽雙糖苷提取率＋大豆苷元提取率×20/最大大豆苷元提取率＋染料木素提取率×20/最大染料木素提取率＋干膏得率×10/最大干膏得率）。其中1～4號(hào)為黃色區(qū)域內(nèi)的點(diǎn)，5～8號(hào)為黃色區(qū)域外的點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，黃色區(qū)域內(nèi)工藝點(diǎn)的綜合評(píng)分優(yōu)于黃色區(qū)域外工藝點(diǎn)的綜合評(píng)分，因此最終確定提取工藝的最優(yōu)設(shè)計(jì)空間為溶劑用量8～11倍、提取時(shí)間為30～84 min，提取次數(shù)為1～2次。

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Table 3 Experimental design and results of Plackett-Burman

編號(hào)X1/minX2/倍X3/minX4Y1/(mg?g?1)Y2/(mg?g?1)Y3/(mg?g?1)Y4/(mg?g?1)Y5/% 10890349.635.270.450.2428.48 201230130.111.420.210.1015.71 30830341.533.320.360.2023.98 460830123.851.170.170.0815.67 5601290137.492.320.260.1319.45 6601230344.484.160.390.2124.69 760890128.312.010.200.1016.96 801290347.685.560.500.2928.40 90830122.370.970.150.0713.31 1060890345.665.210.440.2428.10 11601230341.773.830.420.2225.60 1201290132.452.390.260.1418.75

表4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果

Table 4 Results of variance analysis of Plackett-Burman experimental design

來(lái)源Y1Y2Y3 平方和均方FP平方和均方FP平方和均方FP 模型928.499 0232.125 032.540 00.000 029.184 17.296 068.470 00.000 00.166 7 0.041 7185.660 00.000 0 X10.404 00.404 00.060 00.819 00.023 90.023 90.220 00.650 00.000 20.000 20.920 00.370 0 X242.661 042.661 05.980 00.044 00.173 10.173 11.620 00.243 00.006 00.005 926.490 00.001 0 X3114.855 0114.855 016.100 00.005 05.577 05.577 052.340 00.000 00.014 70.014 765.540 00.000 0 X4770.580 0770.580 0108.020 0 0.000 023.410 123.410 1 219.700 00.000 00.145 80.145 8649.680 00.000 0 誤差49.936 0 7.134 0 0.745 90.106 6 0.001 60.000 2 失擬項(xiàng)46.278 0 7.713 0 2.110 0 0.483 00.544 50.090 80.450 00.813 00.001 30.000 20.730 00.712 0 合計(jì)978.436 0 29.930 0 0.168 2 來(lái)源Y4Y5 平方和均方FP平方和均方FP 模型0.058 80.014 7128.550 00.000 0334.793 083.698 0115.240 00.000 0 X10.000 30.000 32.620 00.149 00.279 00.279 00.380 00.555 0 X20.002 10.002 118.670 00.003 03.091 03.091 04.260 00.078 0 X30.005 60.005 649.290 00.000 037.343 037.343 051.410 00.000 0 X40.050 70.050 7443.630 00.000 0294.081 0294.080 0404.890 00.000 0 誤差0.000 80.000 1 5.084 00.726 0 失擬項(xiàng)0.000 80.000 80.000 11.930 04.667 00.778 01.860 00.509 0 合計(jì)0.0596 339.878 0

圖6 標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的pareto圖

3 討論

失眠屬中醫(yī)學(xué)“不寐”“不得眠”“目不瞑”等范疇，病因多與情志不遂、飲食不節(jié)、久病體虛等有關(guān)，病位主要在心，但與肝、膽、脾、胃、腎的陰陽(yáng)氣血失調(diào)相關(guān)。目前臨床治療失眠的藥物有苯二氮類、非苯二氮類、有鎮(zhèn)靜作用的抗抑郁類、褪黑素受體激動(dòng)劑類等，短期內(nèi)，這些藥物能顯著改善睡眠，但長(zhǎng)期使用容易對(duì)人體產(chǎn)生很多不利的影響，如地西泮，長(zhǎng)期連續(xù)用藥可產(chǎn)生依賴性和成癮性[20-21]。梔子豉湯是臨床常用的治療失眠的經(jīng)典方劑之一，由該方劑組成或衍生的多種方劑對(duì)治療各種類型的失眠均表現(xiàn)出較好的療效，但其藥效物質(zhì)和作用機(jī)制仍不明確。

表5 實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果

Table 5 Experimental arrangement and results

編號(hào)X2/倍X3/minX4Y1/(mg?g?1)Y2/(mg?g?1)Y3/(mg?g?1)Y4/(mg?g?1)Y5/% 18 (?1)90 (+1)2 (0)45.803.810.330.1925.22 212 (+1)90 (+1)2 (0)45.854.390.380.2225.85 38 (?1)30 (?1)2 (0)35.942.150.270.1519.81 48 (?1)60 (0)3 (+1)47.344.950.390.2326.48 512 (+1)30 (0)2 (0)38.602.380.290.1721.29 610 (0)30 (?1)3 (+1)42.603.300.370.2024.52 710 (0)90 (+1)3 (+1)49.725.500.430.2628.32 810 (0)60 (0)2 (0)42.153.500.340.2024.16 98 (?1)60 (0)1 (?1)27.521.650.160.0914.74 1010 (0)60 (0)2 (0)40.563.450.340.1923.66 1112 (+1)60 (0)3 (+1)45.434.650.450.2726.65 1210 (0)60 (0)2 (0)38.653.300.340.2023.14 1310 (0)60 (0)2 (0)37.143.430.340.1922.74 1410 (0)60 (0)2 (0)40.133.180.330.2023.84 1510 (0)30 (?1)1 (?1)23.211.140.170.0914.25 1612 (+1)60 (0)1 (?1)32.751.830.200.1117.74 1710 (0)90 (+1)1 (?1)32.512.510.210.1117.99

圖7 梔子豉湯提取工藝設(shè)計(jì)空間

本實(shí)驗(yàn)采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)梔子豉湯治療失眠的成分進(jìn)行了預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、京尼平苷酸、西紅花酸、大豆苷元、染料木素等可能是其發(fā)揮治療作用的活性成分。這些活性成分可能作用于IL-6、TNF、IL-1β、ESR1等核心靶標(biāo)，繼而通過(guò)神經(jīng)活性配體-受體相互作用、MAPK信號(hào)通路、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號(hào)通路、γ-氨基丁酸能突觸、TNF因子信號(hào)通路等多條通路治療失眠。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明梔子苷能顯著縮短實(shí)驗(yàn)動(dòng)物入睡時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物入睡率[22]。但其余成分（如京尼平龍膽雙糖苷、京尼平苷酸、西紅花酸、大豆苷元、染料木素）在失眠中的作用仍缺少相關(guān)報(bào)道。失眠與炎癥息息相關(guān)，常伴隨炎癥因子IL-6、TNF、IL-1β表達(dá)的升高[23-24]，王丹等[25]研究發(fā)現(xiàn)失眠嚴(yán)重程度與IL-6呈正相關(guān)，而TNF?α對(duì)睡眠-覺(jué)醒行為存在特異性效應(yīng)。p38 MAPK是MAPK信號(hào)通路的重要組成部分，p38 MAPK信號(hào)通路被激活后，促炎因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)顯著升高，并伴隨明顯炎癥的反應(yīng)，抑制p38 MAPK通過(guò)后炎癥因子的表達(dá)顯著下降[26-27]，因此梔子豉湯可能通過(guò)調(diào)控MAPK信號(hào)通路，抑制炎癥反應(yīng)，從而治療失眠。ESR1通過(guò)影響空間記憶和突觸可塑性，起到神經(jīng)保護(hù)作用[28]。cAMP被證實(shí)可通過(guò)蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）參與調(diào)節(jié)睡眠和晝夜節(jié)律，其可使慢波睡眠和總睡眠時(shí)間延長(zhǎng)，同時(shí)縮短入睡潛伏期，具有明顯的促睡眠效應(yīng)[29]。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)維持大腦網(wǎng)絡(luò)功能至關(guān)重要[30]。研究發(fā)現(xiàn)失眠患者中樞GABA水平明顯降低[31]。

表6 梔子豉湯提取工藝安排及驗(yàn)證結(jié)果

Table 6 Extraction process arrangement and verification results of ZD

編號(hào)X2/倍X3/minX4Y1/(mg?g?1)Y2/(mg?g?1)Y3/(mg?g?1)Y4/(mg?g?1)Y5/%綜合評(píng)分 1960240.403.610.290.1624.0897.43 2960240.213.730.300.1724.2999.86 31061235.413.260.290.1723.2192.66 41061237.733.480.300.1624.1795.45 51130232.312.670.260.1520.9681.92 61130234.032.320.270.1521.1682.07 71145234.592.790.270.1522.5185.56 81145235.052.820.280.1622.4987.90

此外，本研究基于QbD理念，對(duì)梔子豉湯提取工藝進(jìn)行研究，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)結(jié)果、查閱文獻(xiàn)以及《中國(guó)藥典》2020年版對(duì)各味中藥指標(biāo)性成分的規(guī)定，確定梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、大豆苷元、染料木素為梔子豉湯提取的CQAs，用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出溶劑用量、提取時(shí)間和提取次數(shù)為梔子豉湯提取過(guò)程的CPPs，Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，運(yùn)用 Monte Carlo法計(jì)算梔子豉湯提取工藝的設(shè)計(jì)空間，最終確定提取工藝最佳范圍：溶劑用量8～11倍，提取時(shí)間30～84 min，提取次數(shù)為1～2次。在設(shè)計(jì)空間的建立時(shí)，采用了達(dá)標(biāo)概率法，通過(guò)設(shè)定可接受達(dá)標(biāo)概率，建立確保成功概率的設(shè)計(jì)空間，工藝參數(shù)在設(shè)計(jì)空間內(nèi)運(yùn)行，能夠保證工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)達(dá)標(biāo)[32]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)揭示了梔子豉湯治療失眠的活性成分、潛在靶點(diǎn)及通路，并通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)對(duì)篩選出的核心靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證?？梢酝茰y(cè)梔子豉湯中的活性成分可能通過(guò)作用于IL-6、TNF、IL-1β、ESR1等靶點(diǎn)，調(diào)控神經(jīng)活性配體-受體相互作用、cAMP信號(hào)通路、γ-氨基丁酸能突觸、TNF因子信號(hào)通路等發(fā)揮治療失眠的作用，可為研究梔子豉湯治療失眠的分子機(jī)制提供思路。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接技術(shù)篩選出梔子豉湯的CQAs，運(yùn)用QbD理念對(duì)梔子豉湯的提取工藝參數(shù)進(jìn)行研究，建立設(shè)計(jì)空間，為該方的進(jìn)一步開發(fā)提供了數(shù)據(jù)支持。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Research on extraction process of Zhizichi Decoction based on network pharmacology and quality by design concept

HU Zhong-jiao1, 2, ZHENG Lu-lu3, XU Guang-ya4, GUO Xiao-heng4, SHI Zheng1, 2

1. Affiliated Hospital / Clinical Medical College of Chengdu University, Chengdu 610081, China 2. School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, China 3. College of Food and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China 4. School of Preclinical Medicine, Chengdu University, Chengdu 610106, China

In the present study, we applied network pharmacology to explore the molecular mechanism of Zhizichi Decoction (ZD) in insomnia treatment. To establish and validate the design space for the extraction process of ZD based on the concept of quality by design (QbD).Firstly, the components and corresponding targets of ZD were obtained from TCMSP, PharmMapper, Drugbank, GeneCards, Therapeutic Target Database and OMIM databases. Then, STRING, DAVID database and molecular docking technology were used to analyze potential targets of ZD in the treatment of insomnia. With the extraction yield of geniposide, genipin-1-β--gentiobioside, daidzein, genistein and dry extract yield as critical quality attributes (CQAs). Subsequently, the Placket-Burman experiment design was used to select the critical process parameters (CPPs). The Box-Behnken experiment design was used to optimize the extraction process, and the design space of the ZD extraction process was established.The main active components of ZD, such as geniposide, genipin-1-β--gentiobioside, daidzein and genistein, through acting on the core targets of interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), estrogen receptor 1 (ESR1), nitric oxide synthase 3 (NOS3), and involved in the regulation of neuroactive ligand-receptor interaction, GABAergic synapse, TNF signaling pathway, thereby treating insomnia. The design space of extraction technology of ZD was as follows: The amount of solvent was 8—11 times, the extraction time was 30—84 min, and the number of extraction was 1—2 times.ZD may treat insomnia through multiple components, multiple targets and multiple pathways. The design space of extraction process of ZD based on QbD concept was robust and reliable, which would provide reference for the process development of its formulations.

Zhizichi Decoction; network pharmacology; insomnia; molecular docking; quality by design; design space; extraction process; geniposide; genipin-1-β--gentiobioside; daidzein; genistein; interleukin-1β; interleukin- 6; estrogen receptor 1; nitric oxide synthase 3

R284.2

A

0253 - 2670(2022)07 - 1973 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.07.006

2021-10-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81803561）；四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2020YJ04087）；四川省中醫(yī)藥管理局科研專項(xiàng)課題（2021MS189）；成都市金牛區(qū)醫(yī)學(xué)會(huì)科研課題（JNKY2021-06）；成都大學(xué)附屬醫(yī)院院級(jí)課題（Y2021006）；成都市醫(yī)學(xué)科研課題（2021070）；龍泉驛英才計(jì)劃C類創(chuàng)新人才計(jì)劃；四川省科技廳農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（22NZZH0031）

胡鐘姣（1994—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榕R床藥學(xué)。Tel: 15761639978 E-mail: huzhongjiao219@163.com

時(shí) 政，碩士生導(dǎo)師，教授，主要從事中藥新藥研發(fā)及中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail: drshiz1002@hotmail.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]