項 艷2，李木子2，謝亞萍2，曲曉洋2，譚曉斌2，崔國倩2，朱粉霞2*

苦地丁化學成分和體內代謝產物的LC-MS鑒定

項 艷1,2，李木子1, 2，謝亞萍1, 2，曲曉洋1, 2，譚曉斌1, 2，崔國倩1, 2，朱粉霞1, 2*

1. 南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結合醫(yī)院，江蘇 南京 210028 2. 江蘇省中醫(yī)藥研究院 國家中醫(yī)藥管理局中藥口服釋藥系統(tǒng)重點實驗室，江蘇 南京 210028

研究苦地丁提取物中的化學成分和體內代謝產物，探究其代表性成分質譜裂解規(guī)律。采用高效液相色譜-電噴霧質譜聯(lián)用技術（HPLC-Q-TOF/MS），正離子模式掃描，對苦地丁提取物和大鼠口服苦地丁提取物后不同時間段內的血漿、膽汁、尿液和糞便分別進行檢測分析，通過與對照品和文獻比對保留時間和質譜碎片信息，確定化學成分歸屬及其裂解方式，預測代謝產物的動態(tài)變化。在苦地丁提取物中共鑒定得31個化合物，其中共有21個化合物以原型進入體內；并以紫堇靈為研究對象，在大鼠血漿、膽汁、尿液和糞便中分別發(fā)現(xiàn)3、3、4、4個代謝產物。借助HPLC-Q-TOF/MS方法鑒定了苦地丁體外化學成分和體內以原型存在的化學成分，闡明了代表性成分紫堇靈的代謝產物及代謝規(guī)律，推測苦地丁在體內發(fā)生了I相和II相代謝，其中以II相代謝方式為主（硫酸化、糖基化、甲基化和去甲基化），為闡明苦地丁的藥效物質基礎提供依據(jù)。

苦地丁；HPLC-Q-TOF/MS；代謝產物；紫堇靈；原阿片堿

苦地丁為中醫(yī)和蒙醫(yī)常用藥材，是罌粟科紫堇屬植物地丁草Turcz.的干燥帶跟全草，為《中國藥典》和《衛(wèi)生部藥品標準?蒙藥》收錄品種，其產地分布于遼寧、河北、山東、山西等地?？嗟囟⌒院?、味苦，具有清熱解毒、散結消腫的功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，苦地丁對感冒發(fā)熱、咽喉疼痛等多種炎癥和肝膽病有較好的療效[2]，近年來受到國內外學者的廣泛關注?？嗟囟』瘜W成分主要為生物堿和黃酮[3]，目前，有關其化學成分的研究主要集中在提取分離、鑒定及藥理活性等[4]，對其化學成分的體內代謝研究未有報道。

液質聯(lián)用技術具有高效、快速、靈敏的特點，對于中藥復雜體系的分析有著顯著優(yōu)勢，已被廣泛應用于中藥化學成分及體內代謝產物的高通量分析[5]。本實驗采用超高效液相色譜與飛行時間質譜聯(lián)用（HPLC-Q-TOF/MS）技術，分析苦地丁化學成分的質譜裂解規(guī)律，并應用于其在大鼠體內（血漿、尿液、糞便、膽汁）化學成分和代謝產物的鑒定，建立了苦地丁“體外化學成分群—大鼠體內化學成分群”的研究框架，為明確苦地丁體內藥效物質及其質量控制的研究奠定基礎，也為苦地丁的藥理活性研究以及進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州金壇區(qū)環(huán)宇科學儀器廠）；KQ2200V型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL-16G型高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；RE-5203型旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；Mettler Toledo分析電子天平（Mettler Toledo分析儀器有限公司）；IKA VORTEX GENIUS 3渦旋混合器（德國IKA公司）；SIL-20A型液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；Triple TOF TM 5600 System-MS/MS高分辨四極桿飛行時間質譜儀（美國AB Sciex公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

苦地?。ńK濟川藥業(yè)有限公司，批號20180331）經江蘇省中醫(yī)藥研究院朱粉霞研究員鑒定為罌粟科紫堇屬植物地丁草Turcz.的干燥帶根全草；乙腈、甲醇（德國Merck公司）；氨水（日本Tokyo Chemical Industry公司）；生理鹽水（安徽豐原藥業(yè)股份有限公司）；對照品右旋異紫堇定、血根堿、乙酰紫菫靈、二氫血根堿（寶雞市辰光生物科技有限公司，質量分數(shù)均為98%）、延胡素乙素、原阿片堿（中國食品藥品檢定研究院，質量分數(shù)均為98%）、紫菫靈（實驗室自制，質量分數(shù)98%）；10%水合氯醛溶液（江蘇省中醫(yī)院）。

1.3 動物

SD雄性大鼠，體質量（220～250 g），由江蘇省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心提供，許可證號：SYXK（蘇）2016-0018。動物實驗均按照《中國實驗動物管理立法規(guī)定及一般建議》進行，并經江蘇省中西醫(yī)結合醫(yī)院研究倫理委員會批準（AEWC-20180727-43）。

2 方法

2.1 溶液的配制

（1）對照品溶液的配制：分別精密稱取紫堇靈、乙酰紫堇靈、原阿片堿、延胡索乙素、二氫血根堿、血根堿和右旋異紫堇定對照品適量，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成對照品儲備液；精密吸取對照品儲備液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到含紫堇靈 0.134 mg/mL，乙酰紫堇靈0.120 mg/mL，原阿片堿 0.057 mg/mL，二氫血根堿0.048 mg/mL、延胡索乙素0.038 mg/mL、血根堿0.042 mg/mL和0.055 mg/mL右旋異紫堇定的對照品溶液。

（2）動物給藥藥液的配制：取苦地丁藥材，加10倍量的80%乙醇提取2次，每次1.5 h，減壓濃縮提取液制得苦地丁浸膏。稱取苦地丁浸膏適量，加入一定量的生理鹽水，超聲（250 W、33 kHz）溶解，制得0.1 g/mL的苦地丁提取物，用于動物ig給藥。

（3）供試品溶液的配制：取苦地丁浸膏0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，超聲（250 W、33 kHz）處理30 min，濾過，取續(xù)濾液以0.22 μm微孔濾膜濾過，得到約3 mg/mL的液質供試品溶液。

2.2 動物實驗及樣本收集

2.2.1 動物實驗 取18只SD雄性大鼠，實驗前于SPF級動物房適應性飼養(yǎng)1周，室溫（25±2）℃，濕度60%～70%，12 h晝夜更替。給藥前12 h禁食，不禁水，實驗組大鼠ig給以1 g/kg苦地丁提取物，空白組大鼠ig給予等劑量生理鹽水。

2.2.2 生物樣品采集及制備 于ig給藥2、4、8、12 h后，眼底靜脈叢取血（每個時間點取約0.2 mL）置于含肝素鈉的EP管中，靜置15 min后，3000 r/min離心10 min，分離得血漿；于血漿中加入3倍體積的甲醇渦旋1 min，以12 000 r/min離心10 min，取上清，在45 ℃水浴下氮氣吹干，并儲存在?80 ℃冰箱中。

收集0～4、4～8、8～12 h的尿液，取各時間段內的尿液樣品2 mL，分別加入3倍體積的甲醇進行混合，渦旋震蕩，以12 000 r/min離心10 min，取上清。收集0～12 h內的糞便樣品，取1 g糞便溶于5倍量甲醇中，在25 ℃水浴中超聲處理30 min后，以12 000 r/min離心10 min，取上清。將尿液和糞便上清液在45 ℃水浴下氮氣吹干，并儲存在?80 ℃冰箱中。

膽汁組按照0.5 mL/100 g ip 10%的水合氯醛溶液，待大鼠麻醉后，收集0～4、4～8、8～12 h膽汁樣品。取膽汁樣品2 mL加入到3倍體積的甲醇中進行混合后，渦旋震蕩，以12 000 r/min離心10 min，取上清，在45 ℃水浴下氮氣吹干，并儲存在?80 ℃冰箱中。

在進樣分析之前，向糞便、尿液和膽汁樣品殘渣分別加入1 mL甲醇，血漿樣品殘渣中加入200 μL甲醇復溶，渦旋震蕩，并在12 000 r/min下離心10 min，取上清液注入HPLC-Q-TOF/MS系統(tǒng)進行分析，進樣體積為10 μL。

2.3 色譜條件

色譜柱：Gemini C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國Phenomenex公司）；流動相：乙腈（A）-0.05%氨水（B），洗脫程序：0～35 min，15%～55% A；35～45 min，55%～60% A；45～60 min，60%～75% A；60～63 min，75%～100% A。體積流量1 mL/min，柱溫為35 ℃，進樣體積為10 μL，檢測波長289 nm。

2.4 質譜條件

質譜儀采用電噴霧離子化源（ESI），正離子模式：噴霧電壓（ISVF）5500 V；離子源溫度（TEM）：600 ℃；霧化氣體為氮氣，霧化氣60 L/h；輔助加熱氣60 L/h；氣簾氣速率40 L/h；碰撞能量40 eV，碰撞能量擴展為20 eV。TOF Masses為50～1500；數(shù)據(jù)采集所用軟件為 Analyst TF 1.6 software，數(shù)據(jù)處理軟件為Peakview 1.2。

3 結果

3.1 苦地丁提取物中化學成分的鑒定及其質譜裂解規(guī)律解析

本實驗基于HPLC-Q-TOF/MS技術，采用正離子模式對苦地丁的化學成分進行檢測。結合文獻報道、TCMSP數(shù)據(jù)庫（https://old.tcmsp-e.com）中收載的苦地丁化學成分信息，對照品色譜保留時間，精確相對分子質量、同位素豐度比、分子碎片峰、二級質譜圖等信息，共推斷出31個化合物，其中30個為生物堿成分，1個為黃酮類成分，這與文獻報道一致[6-8]，即生物堿是苦地丁的主要化學成分。總離子流圖如圖1所示，化合物的鑒定信息見表1，化合物結構式見圖2。

3.1.1 苦地丁異喹啉類生物堿質譜裂解規(guī)律 苦地丁中的化學成分大部分屬于異喹啉類生物堿，LC-MS鑒定出的30個生物堿成分中，異喹啉類生物堿有28個，其他生物堿2個。而異喹啉類生物堿按整體結構可分為芐基異喹啉類和簡單異喹啉類，其中芐基異喹啉類生物堿按骨架區(qū)分為苯菲啶型、普羅托品型、小檗堿型等7類，而LC-MS鑒定出的30個中有16個屬于苯菲啶型生物堿，代表性化合物是藥典規(guī)定的指標性成分紫堇靈，也是目前苦地丁中藥理活性研究較多的化合物[9]。延胡索乙素和原阿片堿分別為原小檗堿型和普羅托品型異喹啉類生物堿代表性成分。故詳細解析這3類代表性化合物的質譜裂解規(guī)律。

表1 苦地丁提取物化學成分鑒定信息

Table 1 Attribution of chemical components of extract from C. bungeana

序號tR/min分子離子峰相對分子質量碎片離子分子式化合物名稱誤差(×10?6) 1 3.268327.15328.153 2178.077 4, 165.062 9, 152.061 6, 265.084 7C19H21NO4金黃紫堇堿0.4 2 3.312327.41328.154 2297.113 1, 265.085 2, 237.090 0C19H21NO4異波爾定?0.2 3 3.389327.40328.152 0297.111 9, 235.073 0, 191.084 3, 222.067 2, 235.073 0C19H21NO4紫堇塊莖堿0.4 4 5.507339.40340.154 3309.136 9, 192.057 9C20H21NO4四氫小檗堿0.4 5 6.325313.38314.136 7177.053 2, 145.028 0, 121.064 9C18H19NO4N-反式-阿魏酰酪胺0.6 6 9.917391.38392.111 3332.090 5, 318.076 0C22H17NO6spallidamine0.9 719.819286.00286.142 7269.116 1, 107.049 0C15H10O6山柰酚?0.8 825.194299.40300.158 7191.086 5, 107.049 1, 177.079 4C18H21NO3衡州烏藥堿0.8 925.517381.40382.128 0333.076 4, 275.070 5, 247.075 5, 189.069 2, 135.043 7C21H19NO68-氧紫堇靈0.7 1027.371395.40396.180 4209.093 4, 111.044 8, 286.143 7C23H25NO5白僵菌黃色素?0.9 1128.699383.43384.143 4353.054 4, 335.113 5, 277.092 8C21H21NO612-羥基紫堇靈0.2 1228.793325.30326.137 2311.114 9, 178.084 9, 151.075 2, 91.055 2C19H19NO4碎葉紫堇堿0.9 13*28.885341.41354.133 2324.123 5, 249.089 5, 247.076 4, 149.059 0C20H23NO4右旋異紫定堿0.1 1431.399367.36368.116 0249.190 0, 277.307 0, 177.017 9, 190.084 9C20H17NO6比枯枯靈堿?1.0 1534.448347.34348.153 2333.063 0, 305.067 3C20H13NO5氧化血根堿1.0 16*34.570355.43356.140 0191.089 0, 190.084 3, 161.059 9C21H25NO4延胡索乙素?6.5 17*35.789354.40355.367 9336.123 1, 320.091 5, 188.069 3, 189.075 4, 190.084 8,149.058 7, 91.055 2, 165.055 4, 275.069 0, 206.080 1C20H19NO5原阿片堿?0.3 1836.688365.38366.132 2317.079 1, 289.084 6, 206.080 2, 147.044 1C21H19NO5紫堇洛星堿?0.7 1936.873367.43368.136 2337.104 4, 190.084 8, 307.060 0, 277.051 0C21H21NO5紫堇文堿?0.9 20*37.585332.30333.288 0317.068 8, 274.085 6, 246.090 5, 218.090 4, 189.069 2C20H14NO4血根堿?9.4 2138.488367.43368.406 1319.094 7, 289.084 4, 177.053 3C21H21NO513-表紫堇靈?0.9 22*38.580367.43368.149 8319.095 9, 289.085 6, 261.090 3, 231.079 7, 177.053 7C21H21NO5紫堇靈?0.9 2338.881393.42394.127 1319.085 3, 290.081 3, 334.109 0C22H19NO6地丁紫堇堿0.7 2440.703323.34325.126 5174.054 6, 175.058 0, 149.059 5, 177.073 7C19H17NO4四氫黃連堿0.6 25*48.921409.15410.158 3350.136 9, 289.084 7, 261.089 2, 162.055 0C23H23NO6乙酰紫堇靈?0.5 2649.242368.40369.406 1289.083 9, 261.091 9, 177.054 4C21H21NO511-表紫堇靈?0.9 2749.358409.15410.160 6348.123 5, 321.112 2, 337.106 0, 190.085 9, 176.069 8C23H23NO6乙酰異紫堇靈?0.5 2849.569317.31318.075 3290.080 9, 261.079 5, 201.057 7, 174.046 4C19H11NO4去甲血根堿0.5 2952.629337.40338.137 6163.054 9, 176.070 0, 149.059 6, 135.044 4C20H19NO4紫堇薩明0.8 30*53.892333.10334.107 9319.082 8, 261.079 2C20H15NO413,14-二氫血根堿?0.4 3164.153339.16340.067 3192.102 9、149.077 3C20H21NO4四氫表小檗堿0.4

*表示與混合對照品比對的結果

*indicates the comparison of mixed reference materials

（1）苯菲啶型：從苦地丁中鑒定了30種生物堿，其中16個化合物以異喹啉環(huán)上的氮原子的鄰位和間位與萘環(huán)稠而成的苯菲啶型生物堿母核，其母核形成了1個大π系統(tǒng)，故而很難發(fā)生裂解，且異喹啉環(huán)上的氮原子上常常連有甲基，這是苯菲啶類生物堿的特征性結構[10-11]。紫堇靈是苦地丁中苯菲啶類異喹啉型生物堿的代表性成分，也是藥典規(guī)定的苦地丁質量標準指標，在保留時間38.58 min處檢測出紫堇靈。其分子離子峰為368.149 8，化學組成為C21H21NO5，其二級質譜產生350 [M－H2O]+、319 [M－H2O－OHCH2]+、304 [M－H2O－OHCH2－CH2]+、289 [M－H2O－OHCH2－CH2－OHCH2]+、259 [M－H2O－OHCH2－CH2－OHCH2－CH2O]+、177 [M－H2O－OHCH2－(OCH2)2C6H14]+等碎片離子，其二級質譜圖及詳細裂解方式見圖3。

圖2 苦地丁提取物質譜鑒定出的31個化合物結構式

Fig. 2 Structures of 31 known chemical constituents

（2）原小檗堿型：原小檗堿類生物堿是苦地丁另一數(shù)量較多的一類化學成分，本實驗鑒定出7個化合物，分別為1、4、12、16、24、29、31，它們的C環(huán)上易發(fā)生逆-狄爾斯-阿爾德（RDA）反應，也可通過電子轉移和重排使B環(huán)開裂，形成互補的碎片離子[12-13]。本研究選取延胡索乙素為苦地丁原小檗堿型生物堿代表。在保留時間34.57 min處，檢測到延胡索乙素。其分子離子峰為356.140 0，化學組成為C21H25NO4，在正離子模式下，延胡索乙素B環(huán)的5、8位和C環(huán)的11、12位發(fā)生斷裂，再脫去1分子甲氧基形成275 [M＋H－C4H4－OCH3]+碎片離子和190 [M＋H－C4H4－C8H6－(OCH3)2]+，在此基礎上C-N鍵斷裂、脫去1分子水、1分子甲基形成165 [M＋H－C4H4－OCH3－C6H6OH]+、149 [M＋H－C4H4－OCH3－C6H6OH－H2O]+的碎片離子。其詳細二級質譜圖及裂解方式見圖4。

（3）普羅托品型：普羅托品型生物堿的種類較少，在苦地丁中的數(shù)量不多，但在紫堇屬植物中分布最廣。普羅托品型生物堿的母核不存在大π共軛系統(tǒng)，很容易發(fā)生斷裂，進行RDA裂解與α裂解反應形成小片段分子，小分子片段會繼續(xù)失去1分子羥基或者1分子水從而形成[M－17]+或者[M－18]+的碎片峰[14-15]。本研究選取原阿片堿為苦地丁異喹啉普羅托品型生物堿代表。在保留時間35.789 min處，檢測到了原阿片堿。其分子離子峰為354.133 3，化學組成為C20H19NO5。在正離子模式下，原阿片堿脫去1分子水形成336 [M－H2O]+碎片離子，進一步裂解生成306 [M－H2O－2H－CO]+等碎片離子。與此同時原阿片堿母核發(fā)生可發(fā)生α裂解形成190 [M]+、165 [M]+等碎片離子和RDA裂解形成206 [M]+等碎片離子。其詳細二級質譜圖及裂解方式見圖5。

3.1.2 苦地丁黃酮類成分質譜裂解規(guī)律 黃酮是一類含有2個苯環(huán)通過3個碳原子自相連結構的含氮化合物。在保留時間為19.819 min鑒定出山柰酚，其分子離子峰為286.142 7，化學組成為C15H10O6，在正離子模式下，其母核脫去1分子羥基產生269 [M－OH]+的碎片離子繼而B環(huán)開裂形成237 [M－OH－CH3OH]+的碎片離子，143 [M－C2H7O4－CH3OH]+等碎片離子。其二級質譜圖及裂解方式見圖6。

3.2 大鼠血漿、尿液、糞便及膽汁的原型成分的HPLC-Q-TOF/MS鑒定

任何藥物都是通過與機體的相互作用而發(fā)揮療效。中藥入血移行成分，是了解其藥效物質基礎的基本依據(jù)。為了解苦地丁的體內藥效物質基礎，本研究運用HPLC-Q-TOF/MS技術分別對空白樣本（血漿、尿液、糞便、膽汁）及給藥后不同時間段樣本的代謝物進行分析，通過對比空白與含藥樣品色譜峰的保留時間及質譜數(shù)據(jù)，并結合對照品及苦地丁化學成分的質譜裂解規(guī)律，對苦地丁體內代謝產物進行了鑒定。

在給藥0～2 h后的大鼠血漿中，發(fā)現(xiàn)了17個以原型存在的化合物；給藥2～4 h后的大鼠血漿中，發(fā)現(xiàn)了13個原型化合物；給藥4～8 h后的大鼠血漿中，發(fā)現(xiàn)了11個原型化合物；給藥8～12 h后的大鼠血漿中，發(fā)現(xiàn)了10個以原型存在的化合物，具體信息見表2。在0～12 h內大鼠血漿中共發(fā)現(xiàn)了21個原型成分，其中大部分為生物堿成分，這一發(fā)現(xiàn)與課題組前期研究結果一致[16]，苦地丁中生物堿組分是苦地丁抗炎藥效組分相印證。

為了解苦地丁提取物的主要代謝途徑，本實驗解析了給藥后大鼠在不同時間段膽汁、尿液和糞便中化合物代謝情況。結果表明進入機體的苦地丁提取物主要經膽汁代謝，經尿液排出體外，少量化合物經糞便排泄。

3.3 苦地丁主要成分代謝產物及代謝途徑分析

藥物代謝是影響藥物作用的最關鍵因素之一。通過對苦地丁在體內代謝產物和代謝機制的研究，可進一步了解其臨床應用的安全性、有效性。依據(jù)上述質譜解析結果發(fā)現(xiàn)，苦地丁在大鼠血漿、膽汁、尿液、糞便中的原型成分大多屬于生物堿成分，其中最為顯著的是苯菲啶型生物堿，紫堇靈又為苦地丁中最為典型的苯菲啶型生物堿，也是藥典規(guī)定的指標性成分，且在大鼠血漿、膽汁、尿液、糞便中的含量均較高，故而本實驗以紫堇靈為例解析苦地丁中主要化學成分苯菲啶型生物堿的代謝途徑。

表2 苦地丁提取物在不同時間段大鼠血液、膽汁、尿液、糞便中的分布情況

Table 2 Metabolic distribution of C. bungeana extract in blood, bile, urine and feces of rats at different time periods

序號化合物名稱血液膽汁尿液糞便 0～2 h2～4 h4～8 h8～12 h0～4 h4～8 h8～12 h0～4 h4～8 h8～12 h0～12 h 1金黃紫堇堿＋＋＋????＋?＋? 2異波爾定＋＋???＋＋＋?＋? 3紫堇塊莖堿＋?＋????＋＋?? 4四氫小檗堿??????????? 5N-反式-阿魏酰酪胺＋??????＋＋?? 6spallidamine＋????????＋? 7山柰酚????????＋?? 8衡州烏藥堿?????＋????＋ 98-氧紫堇靈＋＋???＋＋＋＋?? 10白僵菌色素??????????? 1112-羥基紫堇靈＋＋??＋?＋＋＋＋＋ 12碎葉紫堇堿???＋＋＋＋??＋? 13右旋異紫堇靈??????????? 14比枯枯靈堿???＋＋＋＋＋＋＋? 15氧化血根堿???＋＋＋＋??＋? 16延胡索乙素＋＋????????? 17原阿片堿＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ 18紫堇洛星堿＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋? 19紫堇文堿＋?＋?＋?????? 20血根堿＋＋??＋＋＋???? 2113-表紫堇靈＋?＋＋???＋＋?＋

續(xù)表2

＋表示檢出；?表示未檢出

+ indicates detected; ? indicates not detected.

3.3.1 紫堇靈代謝產物的分析 紫堇靈符合苯菲啶型生物堿一般裂解規(guī)律，質譜分析發(fā)現(xiàn)，該類生物堿的質譜裂解主要可形成[M－H2O]+、[M－H2O－CH3]+、[M－H2O－NH2CH3]+等碎片離子。本研究運用HPLC-Q-TOF/MS技術，在大鼠血漿、膽汁、尿液、糞便中，均發(fā)現(xiàn)了紫堇靈原型（C0）的存在，同時在大鼠血漿中檢測到3種紫堇靈代謝產物P1、P2、P3，膽汁中檢測到3種紫堇靈代謝產物B1、B2、B3，尿液中檢測到4種紫堇靈代謝產物U1、U2、U3、U4，糞便中檢測到4種紫堇靈的代謝產物F1、F2、F3、F4。具體信息見表3。

表3 紫堇靈在大鼠血漿、膽汁、尿液、糞便中代謝產物分析

Table 3 Analysis of metabolites of corynoline in rat plasma, bile, urine and feces

序號tR/min分子式分子離子峰相對分子質量 (m/z)誤差 (×10?6) C038.58C21H21NO5368.149 8367.395 1?2.3 P17.80C20H23NO5357.278 1357.400 3?3.4 P29.10C21H23NO9S466.317 3465.473 61.8 P39.50C25H29NO13S616.173 3615.646 68.6 C038.58C21H21NO5368.149 5367.395 10.7 B14.70C28H33NO10544.177 5543.562 31.1 B25.60C21H23NO9S466.313 8465.473 61.8 B37.80C27H31NO9514.279 2513.536 31.4 C038.58C21H21NO5368.149 5367.395 10.7 U15.50C20H19NO6370.126 3369.368 02.1 U27.30C23H23NO7426.153 2425.431 21.7 U37.70C28H33NO10544.178 5543.562 31.1 U418.60C21H19NO6382.129 0381.378 72.0 C038.58C21H21NO5368.148 7367.395 1?1.5 F111.20C24H25NO5408.311 3407.459 02.1 F213.80C27H33NO12563.261 6563.550 4?5.1 F318.50C23H27NO10477.269 6477.461 2?4.0 F421.90C18H19NO4S343.194 7343.396 9?5.9

3.3.2 紫堇靈代謝產物代謝途徑分析

（1）紫堇靈在大鼠血漿中代謝途徑分析：在保留時間7.8 min處，檢測到了代謝產物P1。其分子離子峰為357.278 1，化學組成為C20H23NO5，比紫堇靈減少11，是20、25位C-O鍵斷裂分別加上2個氫原子后，再脫去1分子甲基的相對分子質量。其二級質譜產生的碎片離子/339為該代謝產物脫去1分子水所產生的碎片。見圖7。

在保留時間9.1 min處，檢測到了代謝產物P2。其分子離子峰為466.317 3，化學組成為C21H23NO9S，比紫堇靈增加98，恰好是25位C-O鍵斷裂被還原且23位C所連的甲基被硫化后的分子質量。其二級質譜產生的碎片離子/448、430和412為該代謝產物進一步脫水所產生的碎片。/337、319為該代謝產物去硫化后進一步脫甲基和水分子后所產生的碎片。

在保留時間9.5 min處，檢測到了代謝產物P3。其分子離子峰為616.173 3，化學組成為C27H37NO13S，比紫堇靈增加248，恰好是25、26、20位C-O鍵斷裂被還原，2位C被硫化后，8位C所連的羥基被乙?；〈蠹由?分子葡萄糖的分子質量。其二級質譜產生的碎片離子/557為14位C-N鍵斷裂再脫去1分子甲基，18位C-O鍵斷裂脫去1分子甲氧基后所產生的碎片。

（2）紫堇靈在大鼠膽汁中代謝途徑分析：在保留時間4.7 min處，檢測到了代謝產物B1。其分子離子峰為544.177 5，化學組成為C28H33NO10，比紫堇靈增加176，是27位羥基被1分子葡萄糖取代和16位C加上1分子甲基而得。其二級質譜產生的碎片離子/368為紫堇靈原型，/319、177皆為該代謝產物脫去1分子甲基和1分子葡萄糖后，紫堇靈的特征裂解碎片。見圖8。

在保留時間5.6 min處，檢測到了代謝產物B2。其分子離子峰為466.313 8，化學組成為C21H23NO9S，比紫堇靈增加98，是加上1個氧原子并硫化的分子質量。其二級質譜產生的碎片離子/430為該代謝產物脫去2分子羥基和1分子氫氣產生的碎片，/412為該代謝產物脫去1分子水產生的碎片，/337為該代謝產物去硫化后脫去1分子羥基、1分子甲基和3分子氫氣后產生的碎片，/319為該代謝產物進一步脫水產生。

在保留時間7.8 min處，檢測到代謝產物B3。其分子離子峰為514.279 2，化學組成為C27H31NO9，比紫堇靈增加146，是加上1分子葡萄糖并脫去1個氧原子的相對分子質量。其二級質譜產生的碎片離子/496、478、460為該代謝產物脫水后產生的碎片。/335、307為該代謝產物脫去葡萄糖分子后進一步脫去1分子水和1分子甲氧基產生的碎片。

（3）紫堇靈在大鼠尿液中代謝途徑分析：在保留時間5.5 min處，檢測到了代謝產物U1。其分子離子峰為370.126 3，化學組成為C20H16NO6，比紫堇靈增加2，恰好是27位甲基被羥基取代后的分子質量。其二級質譜產生的碎片離子/352為該代謝產物脫去1分子水所產生的碎片，/303為該代謝產物進一步在7位碳原子脫1分子甲氧基后再失1分子水所產生的碎片，/291為該代謝產物進一步脫去1分子甲基所產生的碎片，/190為該代謝產物在/303的基礎上4、12、14和15位C-C鍵斷裂所產生的碎片。見圖9。

在保留時間7.3 min處，檢測到了代謝產物U2。其分子離子峰為426.153 2，化學組成為C23H23NO7，比紫堇靈增加58，恰好是16位C被1分子乙酸取代后的分子質量。其二級質譜產生的碎片離子/408為該代謝產物脫去1分子水所產生的碎片，/366為該代謝產物進一步脫1分子甲基和1分子-CO2所產生的碎片，/348、317為該代謝產物在/366的基礎上進一步脫去1分子水和2分子甲基所產生的碎片。

在保留時間7.7 min處，檢測到了代謝產物U3。其分子離子峰為544.178 5，化學組成為C28H33NO10，比紫堇靈增加176，恰好是加上1分子甲基和1分子葡萄糖的相對分子質量。其二級質譜產生的碎片離子/368為紫堇靈原型，/350、319、289、177和135皆為該代謝產物脫去1分子甲基和1分子葡萄糖后，紫堇靈的特征裂解碎片。

在保留時間18.6 min處，檢測到了代謝產物U4。其分子離子峰為382.129 0，化學組成為C21H19NO6，比乙酰紫堇靈減少28，恰好是脫去2分子甲基后加上2個氫原子的分子質量。其二級質譜產生的碎片離子/333為母核C-O鍵斷裂并失去4個氫原子所產生的碎片，/303為該代謝產物進一步脫去1分子甲氧基所產生的碎片。

（4）紫堇靈在大鼠糞便中代謝途徑分析：在保留時間11.2 min處，檢測到了代謝產物F1。其分子離子峰為408.311 3，化學組成為C24H25NO5，比紫堇靈增加40，恰好是10位C被1分子丙基取代后的分子質量。其二級質譜產生的碎片離子/368為紫堇靈原型，/355為紫堇靈脫1分子甲基后加上1分子氫被還原產生的碎片，/337、319為該代謝產物進一步脫水所產生的碎片。見圖10。

在保留時間13.8 min處，檢測到了代謝產物F2。其分子離子峰為563.261 6，化學組成為C27H33NO12，比紫堇靈增加195，恰好是8、13位C-O鍵斷裂分別加上2個氫原子、26位上的碳原子被羥基取代后加上1分子葡萄糖醛酸的相對分子質量。其二級質譜產生的碎片離子/504為該代謝產物進一步脫去1分子甲氧基、1分子羥基和1分子甲基所產生的碎片，/489為其繼續(xù)脫1分子甲基所產生的碎片。

在保留時間18.5 min處，檢測到了代謝產物F3。其分子離子峰為477.269 6，化學組成為C23H27NO10，比紫堇靈增加109，恰好是25、27位分別失去1分子甲基、26位上的羥基上的氫被1分子葡萄糖醛酸取代產生的碎片。其二級質譜產生的碎片離子/459為該代謝產物脫去1分子水所產生的碎片。

在保留時間21.9 min處，檢測到了代謝產物F4。其分子離子峰為343.194 7，化學組成為C18H19NO4S，比紫堇靈減少25，恰好是1、2、11、21位C-O鍵斷裂，27位上的碳原子脫去1分子甲基后20位碳原子所連羥基被硫化后的分子質量。其二級質譜產生的碎片離子/165為該代謝產物17位氮原子發(fā)生C-N鍵斷裂14位碳原子C-C鍵斷裂所產生的碎片。

4 討論

中藥化學成分和體內代謝產物的分析和鑒定，是研究中藥藥效物質的基礎，對明確中藥化學成分發(fā)揮藥效具有重要意義，是中藥活性成分開發(fā)利用的重要環(huán)節(jié)。李木子等[9]采用UHPLC-ESI-MS/MS技術，對苦地丁70%乙醇提取物進行定性定量分析，對其14種生物堿進行鑒定。Dong等[17]建立了一種UHPLC-MS/MS方法，測定口服苦地丁提取物后比格犬血漿中生物堿成分的藥代動力學。Yang等[18]采取UHPLC-ESI-MS/MS法，研究了大鼠口服苦地丁提取物后，紫堇靈和乙酰紫堇靈的藥動學。本研究建立了一種快速有效的苦地丁化學成分體內代謝產物及其代謝途徑的分析方法，為苦地丁的藥效物質基礎明確鑒定了基礎。

圖10 大鼠糞便中紫堇靈代謝產物二級質譜圖及其代謝途徑

Fig. 10 Secondary mass spectrometry of metabolites of corynoline in rat feces and their metabolic pathways

本實驗運用HPLC-Q-TOF/MS技術，通過對照品保留時間及質譜信息的比對，詳細解析了大鼠口服苦地丁提取物后在不同時間段內的血漿、膽汁、尿液和糞便的原型成分和代謝產物變化，建立了苦地丁“體外化學成分群-大鼠體內化學成分群”的研究框架，進一步了解到苦地丁的體內物質代謝動態(tài)變化。在苦地丁提取物中，鑒定了31種化學物質（生物堿類化合物30個，黃酮類化合物1個），同時鑒定了不同時間段內的苦地丁提取物在血液、膽汁、尿液、糞便的原型成分。結果表明，原阿片堿、紫堇靈、乙酰紫堇靈、13,14-二氫血根堿等化合物在0～2 h內已經入血，并在12 h后仍可在血漿中檢測到，這與苦地丁藥理活性研究結果相匹配。但是在大鼠0～12 h糞便中，僅發(fā)現(xiàn)了衡州烏藥堿、12-羥基紫堇靈、原阿片堿、13-表紫堇靈、紫堇靈這5個化合物，由此說明，苦地丁提取物主要經膽汁代謝，尿液排泄。此項研究進一步明確了苦地丁的體內藥效物質基礎，揭示其體內化學成分群的組成。

本研究中的21個入血成分大部分屬于苯菲啶型生物堿，故而選取紫堇靈為代表，進一步闡明苯菲啶型生物堿在血漿、膽汁，尿液和糞便中的代謝產物及其代謝途徑。從中分別鑒定出3、3、4、4種代謝產物，其代謝反應涉及了Ⅰ相代謝（氧化、還原、開環(huán)）和Ⅱ相代謝（甲基化、脫羥基、脫羧、葡萄糖醛酸化、硫酸酯化），其中以Ⅱ相代謝反應為主，這與文獻報道基本一致[19]。這一發(fā)現(xiàn)為進一步明確苦地丁中苯菲啶型生物堿的代謝途徑提供實驗依據(jù)，為進一步解釋紫堇靈的藥理和活性機理研究提供了實驗依據(jù)，也為闡明苦地丁藥效物質基礎及活性研究提供了實驗依據(jù)，為苦地丁的進一步開發(fā)和臨床合理應用奠定了理論基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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LC-MS identification of chemical constituents and metabolites of

XIANG Yan1, 2, LI Mu-zi1, 2, XIANG Yan1, 2, LI Mu-zi1, 2, XIE Ya-ping1, 2, QU Xiao-yang1, 2, Tan Xiao-bin1, 2, CUI Guo-qian1, 2, ZHU Fen-xia1, 2

1. The Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210028, China 2. Key Laboratory of Oral Drug Delivery System of Traditional Chinese Medicine, Jiangsu Academy of Traditional Chinese Medicine, State Administration of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210028, China

To investigate the chemical components and metabolites in the extract of, and to explore the mass spectrometry cleavage law of its representative components.High-performance liquid chromatography- electrospray ionization mass spectrometry (HPLC-Q-TOF/MS) was used to adopt the positive ion mode scanning the extract and rat substance in different period. The plasma, bile, urine and faeces were separately detected and compared, with the standard and pieces of literature than retention time and mass spectrum information, the attribution of chemical constituents and their cracking mode. The dynamic change of metabolites was detected.A total of 31 compounds were identified in the extract, among which 21 compounds entered the body as the prototype. Besides, 3, 3, 4, and 4 metabolites were found in plasma, bile, urine and faeces of rats.HPLC-Q-TOF/MS was used to identify the chemical constituentsand, and the metabolites and metabolic rules of corydalis were elucidated. It was speculated that the metabolism of Corydalisoccurred in phase I and phase II, and phase II was the main mode (sulfation, glycosylation, methylation, and demethylation). This study provides a basis for elucidating the pharmacodynamic material basis of.

Turcz.; HPLC-Q-TOF/MS; metabolites; corydalis; protopine

R284.1

A

0253 - 2670(2022)07 - 1949 - 15

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.07.004

2021-09-23

國家自然科學基金項目（81473430）；江蘇省醫(yī)學創(chuàng)新團隊項目（CXTDB2017003）

項 艷，女，漢族，江蘇淮安人，碩士研究生，研究方向為中藥藥效物質基礎。E-mail: yanxiang202010@126.com

朱粉霞，女，漢族，陜西人，博士，研究員，主要從事中藥藥效物質基礎研究。E-mail: zfxcjq@126.com

[責任編輯 王文倩]