馬德坤，王汝華，呂 筱，楊子彤，武淑芬,*，高俊文，陳寶儀，韓 釗，郭慶彬

（1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.天津蘭瑞生物技術(shù)有限公司，天津 300384）

近年來(lái)，植物蛋白基食品浪潮不斷興起，發(fā)展勢(shì)頭迅猛，新型產(chǎn)品層出不窮[1]。動(dòng)物蛋白缺點(diǎn)的暴露以及對(duì)植物蛋白認(rèn)識(shí)的深入使得植物蛋白成為國(guó)內(nèi)外食品領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)。相對(duì)于動(dòng)物蛋白，植物蛋白的生產(chǎn)利用具有綠色安全、環(huán)境友好和可持續(xù)發(fā)展的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)植物種植成本低、生產(chǎn)蛋白能力高效，更加符合社會(huì)發(fā)展需求[2]。從植物源加工工業(yè)的副產(chǎn)品中分離有價(jià)值的蛋白質(zhì)并實(shí)現(xiàn)其高效利用，不僅可以保證生產(chǎn)的成本效益、可持續(xù)性和環(huán)境友好性，而且更能保證食品的安全性[3]。

亞麻籽是亞麻的種子，作為油料作物在我國(guó)廣泛種植，從榨油后的餅粕中提取蛋白質(zhì)，可大大提高亞麻籽的整體利用度。已有研究證明，亞麻籽蛋白及其多肽具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性、抗菌、抗糖尿病等多種生理功效，極具開(kāi)發(fā)潛力和研究?jī)r(jià)值，但目前仍未實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用[4]。成熟的亞麻籽為扁平的長(zhǎng)圓形，由兩個(gè)子葉包圍著一個(gè)薄胚乳和一個(gè)光滑的種皮（外殼）組成[5]。亞麻籽外殼中主要含有亞麻膠、木酚素、膳食纖維和生氰糖苷（機(jī)體攝入后可降解為有毒的HCN）[6]；亞麻仁中主要含有亞麻油和亞麻蛋白[7]。將亞麻籽的殼、仁分離，亞麻仁榨油后的餅粕用于提取蛋白，不僅提高蛋白提取率，同時(shí)還能達(dá)到脫毒目的；從亞麻籽殼中提取亞麻籽膠、木酚素和膳食纖維，如此可使亞麻籽的綜合開(kāi)發(fā)利用走向高效、低耗的良性軌道[8]?，F(xiàn)已有一些物理或化學(xué)方法用于殼仁分離，亞麻仁較易獲取[9-10]。

亞麻籽蛋白的提取方法多樣，包括除鹽沉淀法、堿提酸沉法和超聲法等，目前國(guó)內(nèi)外廣泛使用的是堿提酸沉法[11]，相較于其他方法，該方法可實(shí)現(xiàn)重復(fù)提取。Tirgar等[12]發(fā)現(xiàn)堿提酸沉法提取的亞麻籽蛋白的表面疏水性以及乳化能力明顯高于酶法和酶溶劑萃取法；Kaushik等[13]首先使用水浸提法除膠，然后通過(guò)堿提酸沉獲取蛋白，使用該方法得到的亞麻籽蛋白具有極高的純度（90%以上）和較好的熱穩(wěn)定性，在pH 9.0緩沖液中溶解度可達(dá)76%，并且形成的乳液具有較高的酸穩(wěn)定性；孔惠廣等[14]以冷榨亞麻籽粕為原料，同樣采用堿提酸沉法提取蛋白，并采用冷凍干燥和噴霧干燥兩種方法對(duì)亞麻籽蛋白進(jìn)行干燥，結(jié)果表明，干燥方式也會(huì)對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)功能造成顯著影響；許光映等[15]以脫殼亞麻籽為原料，使用堿提酸沉法提取蛋白，但其只通過(guò)正交試驗(yàn)確定了最佳工藝條件（提取pH值、溫度、料液比和時(shí)間），并未對(duì)所提取蛋白的性質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)分析評(píng)價(jià)。

基于以上研究背景，本研究以亞麻仁為原料，通過(guò)機(jī)械冷榨結(jié)合有機(jī)溶劑浸提方法除亞麻油，然后利用堿提酸沉方法提取亞麻蛋白；采用多種分析表征手段，對(duì)所提取的粗蛋白各組分含量、溶解度、分子質(zhì)量、持水性、持油性、乳化性以及氨基酸組成進(jìn)行分析檢測(cè)，同時(shí)借助在線酶解網(wǎng)站分析潛在的活性多肽序列。研究結(jié)果將為亞麻蛋白的高效利用提供參考，并為日后開(kāi)發(fā)應(yīng)用亞麻蛋白及其活性多肽提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫殼亞麻仁購(gòu)于日照孚洽貿(mào)易有限公司；大豆油購(gòu)自當(dāng)?shù)爻小?/p>

正己烷、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸（均為分析純）天津市江天化工技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Alpha-2LDplus真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Charist公司；Kjeltec凱氏定氮儀 福斯（中國(guó)）有限公司；IS50傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）儀美國(guó)尼高利儀器公司；Infinite M200 Pro酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；CS7小型榨油機(jī) 深圳奧斯達(dá)科技有限公司；DYY-8C電泳儀 北京六一儀器廠；TGAQ50熱重分析儀美國(guó)TA儀器公司；90PLUS/BI激光粒度儀 美國(guó)布魯克海文儀器公司。

1.3 亞麻籽蛋白提取

1.3.1 亞麻籽油脂的脫除

采用機(jī)械冷榨與有機(jī)溶劑浸提相結(jié)合的方法，使用小型榨油機(jī)將原料連續(xù)冷榨3 次，將榨油后餅粕磨碎成粉，與正己烷以液料比1∶5（mL/g）混合置于燒杯中，室溫下攪拌（750 r/min、12 h），更換有機(jī)溶劑并繼續(xù)攪拌12 h，最后將除油固體置于培養(yǎng)皿中，在通風(fēng)櫥內(nèi)使殘余有機(jī)溶劑完全揮發(fā)盡，即得到脫脂亞麻籽粉。

1.3.2 亞麻籽蛋白的提取

參考Lan Yang等[16]的方法并稍作修改，采用堿提酸沉法提取亞麻籽蛋白。具體如下：將脫脂亞麻籽粉與水按料液比1∶15（g/mL）混合置于燒杯中，使用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，室溫?cái)嚢? h，同時(shí)維持pH值恒定，攪拌結(jié)束后離心（4 ℃、8 000 r/min、20 min），取上清液置于燒杯中；使用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.2～4.6，離心（4 ℃、5 000 r/min、5 min），取沉淀，真空冷凍干燥即得亞麻籽蛋白。

1.3.3 亞麻籽蛋白理化性質(zhì)測(cè)定

1.3.3.1 蛋白純度及提取率的測(cè)定

參考GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》，采用凱氏定氮法測(cè)定粗提亞麻籽蛋白以及脫殼亞麻仁中的氮含量。亞麻籽蛋白純度、提取率及得率分別按式（1）～（3）計(jì)算：

1.3.3.2 SDS-PAGE分析

根據(jù)孫媛[17]的改良Osborne分級(jí)法從亞麻籽粗蛋白中分離提取水溶性蛋白和鹽溶性蛋白。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對(duì)亞麻籽粗蛋白及2 種分級(jí)提取蛋白的分子質(zhì)量進(jìn)行分析。

1.3.3.3 溶解度測(cè)定

分別配制不同pH值的Tris-HCl緩沖溶液（0.1 mol/L，pH 2.0～11.0），取一定質(zhì)量的亞麻籽蛋白分別溶于上述緩沖溶液中，蛋白質(zhì)量濃度0.2 g/100 mL，室溫下振蕩60 min，離心（4 ℃、8 000 r/min、20 min），取上清液；采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，進(jìn)而計(jì)算不同pH值條件下亞麻籽粗蛋白的溶解度。

1.3.3.4 Zeta電位分析

將亞麻籽蛋白溶于0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.6）緩沖液中，蛋白質(zhì)量濃度0.2 g/100 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后均分于8 支試管中，使用0.1 mol/L NaOH溶液或0.1 mol/L HCl溶液分別調(diào)節(jié)各試管pH值為2.0～8.0。使用激光粒度儀測(cè)定各溶液Zeta電位。每組平行3 次。

1.3.3.5 熱重分析

借助熱重分析考察亞麻籽蛋白的熱穩(wěn)定性。稱取8 mg亞麻籽蛋白樣品置于坩堝中，設(shè)置溫度量程為20～600 ℃，升溫速率為10 ℃/min。以溫度（℃）為橫坐標(biāo)，樣品質(zhì)量損失率（%）為縱坐標(biāo)，記錄樣品在加熱過(guò)程中質(zhì)量（m）隨溫度（T）的變化，從而得到熱重曲線，并對(duì)質(zhì)量損失率求一階導(dǎo)（dΔm/dT）得到質(zhì)量損失率的變化速率曲線。

1.3.3.6 FTIR光譜表征

采用FTIR和曲線擬合方法分析蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。測(cè)試光譜區(qū)域400～4 000 cm－1，分辨率4 cm－1。使用Omnic軟件對(duì)譜圖進(jìn)行平滑，然后利用Peakfit軟件選取1 600～1 700 cm－1（酰胺I帶）區(qū)域求得二階導(dǎo)，進(jìn)行高斯擬合，根據(jù)各區(qū)域峰面積計(jì)算4 種二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量。

1.3.3.7 持水力與吸脂力評(píng)價(jià)

將0.5 g亞麻籽蛋白置于預(yù)先稱質(zhì)量的離心管中，添加5 g蒸餾水，于2 500 r/min條件下渦旋振蕩5 min，室溫靜置30 min后離心（5 000 r/min、10 min），小心倒出上清液，并再次稱量帶有沉淀物的試管質(zhì)量，測(cè)定亞麻籽蛋白持水力。稱取0.5 g 亞麻籽蛋白加入5 g大豆油按照上述步驟測(cè)定亞麻籽蛋白吸脂力。持水力與吸脂力分別按式（4）、（5）計(jì)算：

1.3.3.8 EAI和ESI測(cè)定

乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳液穩(wěn)定性指數(shù)（emulsifying stability index，ESI）是評(píng)價(jià)乳液形成能力和穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。參考葉鳳凌等[18]的方法并稍作修改。以磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0、50 mmol/L）配制亞麻籽蛋白溶液（1.0 mg/mL），將大豆油分散于蛋白溶液（1∶4，V/V）中，室溫下經(jīng)乳化（10 000 r/min、1 min）和均質(zhì)（500 bar、1 次），制備水包油型乳液。分別在均質(zhì)后0 min和10 min，距離離心管底部5 mm處取40 μL乳液，分散于4 mL 0.1% SDS溶液中，室溫靜置10 min，于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，分別記為A0和A10，以SDS溶液作空白。亞麻籽蛋白乳液的EAI和ESI分別按式（6）、（7）計(jì)算：

式中：ρ為乳化前蛋白溶液質(zhì)量濃度/（g/mL）；φ為油相體積分?jǐn)?shù)（20%）；n為稀釋倍數(shù)（100）。

1.3.4 亞麻籽蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

1.3.4.1 氨基酸組成分析

氨基酸組成分析委托杭州研趣信息技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4.2 一級(jí)序列（部分）分析

結(jié)合酶解和高分辨生物質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)蛋白樣品進(jìn)行分析，該工作委托杭州景杰生物科技有限公司完成；利用NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)和MaxQuant軟件分析樣品蛋白一級(jí)序列（部分）片段。

1.3.4.3 活性多肽片段預(yù)測(cè)

借助BioPD數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/biopep）提供的在線酶解功能與活性多肽數(shù)據(jù)庫(kù)，分別采用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶單獨(dú)酶解以及復(fù)合酶解的方式，分析潛在的活性多肽片段。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行顯著性差異分析，以P＜0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用Origin 8.5進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻籽蛋白純度與提取率

經(jīng)凱氏定氮分析與計(jì)算，去殼亞麻籽仁蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.82%，經(jīng)除油、提取所得蛋白純度為98.86%，提取率為47.20%。Lan Yang等[16]使用堿溶酸沉法從亞麻籽餅粕中提取亞麻籽蛋白，純度不足65%；Tirgar等[12]使用堿性分離結(jié)合纖維素酶處理和乙醇沉淀法提取的亞麻籽粗蛋白仍含有10%的非蛋白雜質(zhì)。而本實(shí)驗(yàn)提取的亞麻籽蛋白具有更高的純度和較高的提取率。其原因可能在于使用亞麻仁為原料，排除了亞麻籽外殼中大部分糖類物質(zhì)對(duì)蛋白提取的干擾，機(jī)械榨油和有機(jī)溶劑結(jié)合的兩步除油法也使油脂去除率較高。高純度的蛋白意味著極低的油脂含量，這在工業(yè)應(yīng)用中具有重要意義，因?yàn)檫@可減少蛋白制品中殘余油脂氧化變質(zhì)帶來(lái)的感官及質(zhì)量上的不良影響，延長(zhǎng)產(chǎn)品保質(zhì)期。此外，研究證實(shí)亞麻籽蛋白自身作為功能食品成分具有抗氧化活性，可進(jìn)一步抑制變質(zhì)，保護(hù)食品感官品質(zhì)并提供自身營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[19]。

2.2 亞麻籽蛋白亞基組成

針對(duì)亞麻籽粕蛋白的結(jié)構(gòu)已進(jìn)行了相關(guān)研究。例如，Oomah等[20]通過(guò)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)亞麻籽蛋白中含有4 種主要條帶（分別位于14、24、25 kDa和34 kDa）；Tirgar等[12]報(bào)道亞麻籽蛋白主要條帶分布于25～30 kDa及35～40 kDa，并提出20～27 kDa的條帶對(duì)應(yīng)蛋白堿性亞基，30～39 kDa的條帶對(duì)應(yīng)蛋白酸性亞基。不同品種亞麻籽蛋白亞基組成并非完全相同[21]。如圖1所示，在亞麻籽蛋白的SDS-PAGE圖譜中，21 kDa和33 kDa的譜帶較為強(qiáng)烈，分別對(duì)應(yīng)蛋白酸性亞基和堿性亞基，Nwachukwu等[22]研究結(jié)果中也有相似分子質(zhì)量的2 條強(qiáng)烈譜帶。全蛋白、水溶性蛋白和鹽溶性蛋白條帶沒(méi)有明顯差異，可能是由于樣品在提取以及電泳前處理過(guò)程中，加樣幾乎為水溶性蛋白。然而三者條帶強(qiáng)度存在差異，這種差異可能與蛋白含量及溶解度有關(guān)。此外，蛋白預(yù)處理也會(huì)導(dǎo)致蛋白電泳圖譜的差異，例如，Perreault等[23]使用高靜水壓進(jìn)行蛋白預(yù)處理，促使亞麻籽蛋白大小亞基結(jié)合形成聚集體，導(dǎo)致了高分子質(zhì)量電泳譜帶強(qiáng)度明顯提高。

圖1 亞麻籽蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig. 1 SDS-PAGE profile of flaxseed proteins

2.3 亞麻籽蛋白溶解度分析

蛋白質(zhì)的溶解性與pH值密切相關(guān)，不同pH值通過(guò)影響蛋白顆粒的凈電荷量以及顆粒之間的靜電斥力，進(jìn)而影響蛋白的溶解穩(wěn)定性，溶解度最低時(shí)的pH值被認(rèn)為是蛋白等電點(diǎn)（pI）。如圖2所示，pH 4.0附近，蛋白溶解度最低，這是因?yàn)殪o電排斥作用減弱，蛋白顆粒穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致蛋白顆粒聚集或沉淀，表明亞麻籽蛋白pI約為4.0；當(dāng)pH值遠(yuǎn)離pI時(shí)，隨pH值的升高蛋白溶解度不斷增加，pH 11.0溶解度高達(dá)68%，絕大部分蛋白處于溶解狀態(tài)。蛋白溶解度曲線基本符合“V”字形，且蛋白在堿性條件下溶解性較酸性條件更優(yōu)。

圖2 不同pH值下亞麻籽蛋白的溶解度Fig. 2 Solubility of flaxseed protein at different pH values

2.4 亞麻籽蛋白Zeta電位分析

Zeta電位可以反映蛋白顆粒的帶電性質(zhì)，其絕對(duì)值越高，顆粒間的斥力越大。如圖3所示，當(dāng)pH值在4.0以下時(shí)，蛋白氨基發(fā)生質(zhì)子化現(xiàn)象，蛋白顆粒帶正電荷。在pH 4.0～5.0，Zeta電位達(dá)到0 mV附近，這與溶解度結(jié)果一致，再次說(shuō)明亞麻籽蛋白pI位于此區(qū)間。隨著pH值由pI持續(xù)升高，蛋白羧基基團(tuán)電離強(qiáng)度隨之增加，導(dǎo)致蛋白顆粒所帶負(fù)電荷量顯著增加[24]。

圖3 不同pH值下亞麻籽蛋白的Zeta電位Fig. 3 Zeta potential of flaxseed protein at different pH values

2.5 亞麻籽蛋白熱穩(wěn)定性分析

如圖4所示，亞麻籽蛋白主要有3 個(gè)熱降解階段。第1階段位于20～150 ℃，質(zhì)量損失約6.45%，在50 ℃左右出現(xiàn)一個(gè)明顯的失重峰，這是由樣品失水造成的。經(jīng)過(guò)冷凍干燥，樣品中的自由水很容易被去除，而結(jié)合水仍保留在干燥樣品中，并且因干燥樣品多孔結(jié)構(gòu)而更容易吸濕，所以在加樣過(guò)程中會(huì)吸收部分游離水，因此這一階段的失水包括大部分的結(jié)合水和一部分游離水[25]。第2個(gè)熱降解階段位于200～500 ℃，此階段質(zhì)量損失約57.63%，失重峰出現(xiàn)于320 ℃左右，這一溫度區(qū)間質(zhì)量損失加快，說(shuō)明在此過(guò)程中樣品中的主要成分蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)結(jié)構(gòu)降解。第3階段位于500～600 ℃，質(zhì)量損失約7%，此階段的質(zhì)量損失可能由于碳化導(dǎo)致的。

食品加工過(guò)程中經(jīng)常使用熱處理，而溫度的控制則顯得尤為重要，溫度低時(shí)，達(dá)不到加工所需預(yù)期效果，溫度高時(shí)，則可能造成某些物質(zhì)分解，影響有效成分含量、產(chǎn)品品質(zhì)及產(chǎn)生有害物質(zhì)等。對(duì)亞麻籽蛋白進(jìn)行熱重分析，可以了解其熱穩(wěn)定性，結(jié)果表明，亞麻籽蛋白熱穩(wěn)定性良好，在300 ℃下不易分解，與展海軍等[26]對(duì)大豆蛋白熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果相比，亞麻籽蛋白的熱穩(wěn)定性較好，更適于工業(yè)熱加工處理。

圖4 亞麻籽蛋白熱重分析圖Fig. 4 Thermogravimetric analysis of flaxseed protein

2.6 亞麻籽蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法有很多，其中FTIR光譜適用范圍廣，對(duì)樣品蛋白純度、質(zhì)地、樣品量等要求較低[27]。本實(shí)驗(yàn)所提取的蛋白在低pH值下溶解度較低，更適于在固體狀態(tài)下使用FTIR光譜進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。紅外譜圖中的酰胺I帶（1 600～1 700 cm－1）和酰胺III帶（1 220～1 330 cm－1）常被用于分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，目前對(duì)于酰胺I帶經(jīng)過(guò)譜峰擬合后各子峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)關(guān)系的研究較為成熟。紅外光譜中酰胺I帶區(qū)域的吸收光譜主要是由C=O伸縮振動(dòng)引起，蛋白質(zhì)中含有豐富的C=O雙鍵，其二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化會(huì)引起酰胺I帶吸收光譜的變化，以1 600～1 639 cm－1為β-折疊，1 640～1 650 cm－1為無(wú)規(guī)卷曲，1 651～1 660 cm－1為α-螺旋，1 661～1 700 cm－1為β-轉(zhuǎn)角作為定量指標(biāo)，進(jìn)而可以準(zhǔn)確分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息[28]。

如圖5所示，經(jīng)計(jì)算可知，α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量分別為14.58%、28.48%、41.42%、15.52%。本實(shí)驗(yàn)提取的亞麻籽蛋白含有較高比例的β-轉(zhuǎn)角，α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)相對(duì)含量之和略高于β-轉(zhuǎn)角，無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量較低。據(jù)報(bào)道，蛋白質(zhì)分子中α-螺旋和β-折疊能夠形成緊密的無(wú)空腔結(jié)構(gòu)，而與α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)相比，無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的構(gòu)象穩(wěn)定性和緊密程度則相對(duì)較差。因此，亞麻籽蛋白中較低含量的α-螺旋和β-折疊使其分子的無(wú)序性較高，結(jié)構(gòu)更加疏松開(kāi)放，表明亞麻籽蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性一般，這可能是由于除油過(guò)程中螺旋擠壓對(duì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)造成破壞[29]。

圖5 亞麻籽蛋白FTIR譜圖（A）和酰胺I帶曲線擬合圖譜（B）Fig. 5 FTIR spectrum (A) and curve fitting results of amide I band of flaxseed protein (B)

2.7 亞麻籽蛋白持水、持油能力評(píng)價(jià)

蛋白質(zhì)的持油性、持水性和起泡性是蛋糕、肉制品、面包、冰激凌等食品加工過(guò)程中重要的特性和質(zhì)量控制指標(biāo)。蛋白質(zhì)良好的持水性有利于提高焙烤面團(tuán)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，而良好的吸油性能則有利于肉制品、奶制品等的加工生產(chǎn)。

與大豆蛋白等其他植物蛋白相比，亞麻籽蛋白的脂肪吸收能力較高，達(dá)5.288 g/g，這可能是由于其具有更高的親脂性。脂肪吸收能力受到蛋白質(zhì)中非極性氨基酸的影響，非極性氨基酸含量越高，親脂性越強(qiáng)[13]。亞麻籽蛋白的持水力為1.175 g/g，本實(shí)驗(yàn)中亞麻籽蛋白提取后經(jīng)冷凍干燥，親水性相比其他方法要低得多，這可能歸因于亞麻籽黏液的低殘留率。從亞麻仁中提取的蛋白含酚類物質(zhì)較少，這也是蛋白持水能力相對(duì)較差的原因之一[30]。良好的親水性和親油性可以更好地將亞麻籽蛋白作為表面活性成分應(yīng)用于相關(guān)溶液中，有望為食品工業(yè)或者醫(yī)藥加工帶來(lái)新的突破口，也可用于制備新型健康代餐食品。

2.8 亞麻籽蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性分析

蛋白多肽鏈上的兩親性氨基酸側(cè)鏈可以吸附到油水界面上并包裹由均質(zhì)化所形成的油滴，同時(shí)通過(guò)羧基和氨基的解離產(chǎn)生靜電斥力發(fā)揮穩(wěn)定液滴、防止聚集的作用。

由圖6A可知，在pH值小于4.0和大于5.0時(shí)，蛋白顆粒之間的靜電排斥作用阻止了油滴間聚合，提高了蛋白的乳化能力。靜電排斥導(dǎo)致蛋白疏水性增大，這會(huì)導(dǎo)致界面上吸附的蛋白濃度增大，界面張力減小，乳液更穩(wěn)定，同時(shí)足夠多的蛋白分子吸附在油水界面形成高強(qiáng)度界面膜也更利于乳液的穩(wěn)定。高乳化穩(wěn)定性（ESI＞80%，圖6B）表明亞麻籽蛋白具有短期穩(wěn)定食品乳劑的潛力。在pH 4.0～5.0范圍內(nèi)，蛋白顆粒表面凈電荷減少，靜電排斥力減弱導(dǎo)致油滴聚集，EAI和ESI均降低。此外，本研究結(jié)果還顯示亞麻籽蛋白EAI與其溶解度呈正相關(guān)，ESI的變化趨勢(shì)與EAI相似，這與劉娟[31]對(duì)文冠果種子蛋白乳化性的研究結(jié)果一致；但EAI數(shù)值稍低而ESI值明顯高于其他研究結(jié)果[13-14]，這可能是由于蛋白質(zhì)提取條件存在差異，所得蛋白純度以及蛋白微觀結(jié)構(gòu)也不同。

圖6 不同pH值下亞麻籽蛋白的EAI（A）和ESI（B）Fig. 6 Emulsification activity index (A) and emulsion stability index (B) of flaxseed protein at different pH values

2.9 亞麻籽蛋白氨基酸組成分析

如表1所示，經(jīng)過(guò)酸解處理，亞麻籽蛋白中共檢出17 種氨基酸，色氨酸在酸解過(guò)程中被破壞，谷氨酰胺和天冬酰胺經(jīng)酸解轉(zhuǎn)換成谷氨酸和天冬氨酸。與大豆蛋白類似，亞麻籽蛋白富含天冬氨酸（9.32%）、谷氨酸（24.10%）、亮氨酸（5.95%）和精氨酸（10.11%），但含硫氨基酸蛋氨酸（1.53%）和半胱氨酸（2.07%）含量較低。就必需氨基酸而言，組氨酸（2.69%）、蘇氨酸（3.40%）、纈氨酸（5.83%）和異亮氨酸（4.64%）均高于聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織（Food and Agriculture Organization/World Health Organization，F(xiàn)AO/WHO）的兒童推薦值（分別為1.9%、3.4%、3.5%、2.8%），亮氨酸（5.95%）、苯丙氨酸（5.76%）、賴氨酸（4.71%）和蛋氨酸（1.53%）含量稍低于FAO/WHO的兒童推薦值（分別為6.6%、6.3%、5.8%、2.8%），而除蛋氨酸外的所有必需氨基酸含量均高于FAO/WHO的成人推薦值（分別為蛋氨酸1.7%、蘇氨酸0.9%、纈氨酸1.3%、異亮氨酸1.3%、亮氨酸1.9%、苯丙氨酸1.9%、賴氨酸1.6%、組氨酸1.6%）。此外，帶負(fù)電荷的氨基酸如谷氨酸和天冬氨酸可通過(guò)螯合金屬鐵離子，抑制鐵誘導(dǎo)的脂質(zhì)氧化，從而有助于防止食品的氧化損傷；高精氨酸/賴氨酸比率（2.15∶1）有助于降低血液膽固醇水平和增強(qiáng)心血管健康；必需氨基酸占總氨基酸的比例高于30%，預(yù)示亞麻籽蛋白作為優(yōu)越蛋白質(zhì)來(lái)源的巨大潛力。由于酸水解造成色氨酸的破壞，因此未檢測(cè)出其含量，但根據(jù)前人研究，亞麻籽蛋白中存在色氨酸且含量約為2%[32]。

表1 亞麻籽蛋白氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of flaxseed protein

2.10 亞麻籽蛋白蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)及在線酶解分析

本研究首先利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)檢索對(duì)提取亞麻籽蛋白中可能存在的蛋白組分進(jìn)行初步鑒定，然后通過(guò)在線酶解并與活性多肽數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，對(duì)潛在活性多肽片段進(jìn)行初步預(yù)測(cè)，為評(píng)估亞麻籽蛋白生理功效提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

表2 亞麻籽蛋白組分初步分析Table 2 Composition of flaxseed meal proteins

由表2可知，通過(guò)BLAST檢索與之相匹配的已知序列蛋白，提取的亞麻籽蛋白可能含有11 種已知序列蛋白組分，蛋白打分值依次降低。有報(bào)道稱，亞麻籽蛋白中貯藏蛋白含量為10%～37%[28]，編號(hào)Q8LPD3和Q8LPD4兩種蛋白片段在數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)應(yīng)一種亞麻籽貯藏蛋白。A0RZJ8、P69315、Q703F2、K4K951這4 種蛋白為部分覆蓋，想要精確獲得覆蓋序列，需利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，將蛋白名稱下的序列全部下載，并利用原始測(cè)序數(shù)據(jù)，在MaxQuant軟件上進(jìn)行分析處理。

通過(guò)MaxQuant可視化分析得到亞麻籽蛋白一級(jí)序列部分片段，共計(jì)45 條片段序列，分別為：QIQEQDYLRSCQQK、DLPGQCGTQPSR、GGGQQSQHFDSCCDDLK、AVGSSPVR、DLPGQCR、QDIQQQGQQQEVER、DLPGQCGTQPSR、QEIQQQGQQQEVQR、AVFPSIVGR、DSYVGDEAQSK、VAPEEHPVLLTEAPLNPK、DLTDYLMK、GYSFTTTAER、SYELPDGQVITIGNER、EITALAPSTMK、IIAPPER、LSLSATR、VLPELNGKLTGMAFR、VPTANVSVVDLTCR、TLLFGEK、AASFNIIPSSTGAAK、VLPELNGKLTGMAFR、IGLDGFGR、ESTLHLVLR、EGLPPDQQR、EVGQEIQ、YEAGVVPPGAR、ETQPASENLAAAAK、ELIIGDR、EAYPGDVFYLHSR、IINEPTAAAIAYGIDK、AAEQAAR、QLAVETR、VLPELDGK、LTGMAFR、LGATAGLR、LITTWSR、LGINGFGR、TLLFGEK、AASFNIIPSSTGAAK、TLSDYNIQK、ESTLHLVLR、HPVGADSLDQAR、IQDKEGIPVGR、YVTGGHPAGGDSLDQAR。由于樣品處理采用胰蛋白酶酶解，作用位點(diǎn)為精氨酸和賴氨酸，因此對(duì)應(yīng)片段末端氨基酸均為K或R。此外，由于完整序列未知，在使用胰蛋白酶酶解時(shí)，得到的多肽片段長(zhǎng)短不一，由于二級(jí)質(zhì)譜依據(jù)分子質(zhì)量進(jìn)行匹配，片段過(guò)長(zhǎng)過(guò)短都會(huì)影響匹配準(zhǔn)確度，因此匹配范圍設(shè)置為5～25 個(gè)氨基酸片段，小于5 個(gè)或大于25 個(gè)氨基酸的片段都被自動(dòng)忽略。

蛋白樣品在處理過(guò)程中已被胰蛋白酶酶解，對(duì)上述亞麻籽蛋白一級(jí)序列片段分別進(jìn)行在線模擬酶解（http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/biopep），考察胃蛋白酶、木瓜蛋白酶單獨(dú)酶解及二者復(fù)合酶解后產(chǎn)生活性多肽情況。

表3 亞麻籽蛋白酶解后潛在活性多肽片段Table 3 Potential active polypeptide fragments derived from linseed protease hydrolysis

通過(guò)與活性多肽數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，由表3可知，亞麻籽蛋白經(jīng)酶解后產(chǎn)生的潛在活性肽段多達(dá)47 條，均為二肽或三肽，表明亞麻籽蛋白酶解較為徹底。同時(shí)短肽更有利于吸收，這些活性片段具有較為廣泛的生物活性，如降壓、降糖、修護(hù)胃黏膜等，其中具有降糖或降壓活性的多肽占比較大。據(jù)此推測(cè)，亞麻籽蛋白經(jīng)體內(nèi)消化酶解后，可產(chǎn)生多種活性肽段，為后續(xù)蛋白酶解制備活性多肽提供有益指導(dǎo)。

3 結(jié) 論

為實(shí)現(xiàn)亞麻籽蛋白的高效開(kāi)發(fā)利用，本實(shí)驗(yàn)使用亞麻仁為原料，通過(guò)堿提酸沉法獲得了高純度的亞麻籽蛋白。研究表明，亞麻籽蛋白具有良好的熱穩(wěn)定性和作為天然乳化劑的潛力，良好的兩親性和堿溶性等理化特性為其工業(yè)開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。對(duì)蛋白進(jìn)行改性處理，進(jìn)一步提高其乳化活性，將有利于拓寬亞麻籽蛋白的應(yīng)用范圍。亞麻籽蛋白含有人體必需的8 種氨基酸，通過(guò)模擬人體消化系統(tǒng)進(jìn)行在線酶解，證實(shí)其水解產(chǎn)物具有抗高血壓、降血糖、抗氧化等功能活性，其潛在的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具有客觀的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力與吸引力。