羅 靜，董 玲，趙 馳，劉鈺穎，郭云建，李 露，李艷琳，陳 旺，楊國華，楊 永，李治華,*，朱永清,*

（1.四川省農業(yè)科學院農產品加工研究所，四川 成都 610066；2.郫都區(qū)農業(yè)農村和林業(yè)局，四川 成都 611730；3.成都鑫鴻望食品有限公司，四川 成都 611730；4.四川省丹丹郫縣豆瓣集團股份有限公司，四川 成都 611730）

郫縣豆瓣醬因產于四川成都郫縣而得名，至今已有300多年的歷史，是四川乃至全國重要的一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品，被譽為“川菜之魂”[1-2]。其制作工藝主要包括制辣椒、制瓣和后熟發(fā)酵3 個階段，由蠶豆（Vicia fabaL.）（四川又稱胡豆）、辣椒（Capsicum annuumL.）、面粉和食鹽按一定比例經較長時間自然發(fā)酵而成[3]。

細菌對郫縣豆瓣獨特風味品質的形成起重要作用[4-6]。研究表明，郫縣豆瓣醬發(fā)酵過程主要細菌有芽孢桿菌、乳酸菌、葡萄球菌等，芽孢桿菌是郫縣豆瓣發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群之一，對郫縣豆瓣醬的品質風味起關鍵作用[7]。有學者對芽孢桿菌影響大醬品質進行了深入研究，有利于韓國大醬過程化控制和品牌提升[8-10]。然而，作為類似產品，目前還鮮有研究郫縣豆瓣醬中芽孢桿菌尤其是耐鹽芽孢桿菌系統(tǒng)進化和特性的報道。

近年來，發(fā)酵食品中存在的抗生素基因引起了全球廣泛關注，其中存在的抗生素基因和耐藥基因可能被人體通過食物攝入體內，產生耐藥性，影響人體健康[11-12]。芽孢桿菌作為郫縣豆瓣發(fā)酵過程優(yōu)勢菌群之一，對其抗生素耐藥性分析能為郫縣豆瓣發(fā)酵菌株的選擇以及相應風險評估提供科學指導。

本研究結合宏基因組和純培養(yǎng)方法，對郫縣豆瓣醬中已分離到的芽孢桿菌進行進化關系研究，并對代表性菌株進行產酶能力和抗生素特性分析，以期加深對郫縣豆瓣醬乃至傳統(tǒng)高鹽發(fā)酵食品中芽孢桿菌多樣性的認識，同時為豆瓣醬中芽孢桿菌的評價和后續(xù)利用提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

郫縣豆瓣醬為郫都區(qū)豆瓣生產廠商制作；土壤微生物提取試劑盒、細菌DNA基因提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

平板計數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g/L、酵母浸粉2.5 g/L、葡萄糖1 g/L、瓊脂15 g/L；平板計數(shù)肉湯（plate count broth，PCB）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、葡萄糖2 g/L；MH（Mueller-Hinton）瓊脂：牛肉粉6 g/L、可溶性淀粉1.5 g/L、酸水解酪蛋白17.5 g/L、瓊脂17 g/L；淀粉培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉5 g/L、可溶性淀粉2 g/L、瓊脂15 g/L；脫脂牛奶培養(yǎng)基：脫脂奶粉15 g/L、瓊脂15 g/L、牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L。

1.1.3 藥敏紙片

藥敏紙片均購買于杭州微生物試劑有限公司。分別為：氨芐西林（10 μg/片）、卡那霉素（30 μg/片）、氯霉素（30 μg/片）、四環(huán)素（30 μg/片）、紅霉素（15 μg/片）、復方新諾明（（23.75 μg SMZ＋1.25 μg TMP）/片）、吉他霉素（15 μg/片）、苯唑西林（1 μg/片）、克林霉素（2 μg/片）、鏈霉素（10 μg/片）、青霉素（10 μg/片）、新霉素（30 μg/片）。

1.2 儀器與設備

GI100DS高壓滅菌鍋 美國Zealway公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學儀器有限公司；5804R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀美國Bio-Rad公司；超低溫冰箱、生物安全柜 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 郫縣豆瓣醬宏基因組DNA提取、測序及微生物物種分類分析

郫縣豆瓣醬宏基因組DNA提取使用生工生物工程（上海）股份有限公司的土壤微生物提取試劑盒提取完成，操作步驟參考說明書，提取完成后使用1%瓊脂糖凝膠電泳確定DNA的完整性。郫縣豆瓣醬宏基因組DNA的文庫構建與測序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。宏基因組物種分類采用Kraken2軟件進行[13]，數(shù)據(jù)庫采用MiniKraken2_v2_8GB_201904（http://ccb.jhu.edu/software/kraken2/index.shtml?t=downloads）。Kraken2是一個基于k-mer算法的高精度序列分類軟件，序列中的每個k-mer被映射到數(shù)據(jù)庫中包含該k-mer基因組的最低共同祖先（lowest common ancestor，LCA），使用k-mers的精確比對，Kraken2能夠快速準確地將測序reads進行物種分類。分類結果和豐度計算采用bracken進行。

1.3.2 菌株分離與純化

參照Barus等[14]的方法并略作修改，具體如下：稱取5 g豆瓣醬樣品，加入25 mL無菌生理鹽水混勻制成樣液，將樣液用生理鹽水10 倍梯度稀釋，分別取10－2、10－3、10－4、10－5四個梯度的稀釋液50 μL均勻涂布在PCA瓊脂培養(yǎng)基上，將涂布好的培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取不同形態(tài)單菌落接種在PCB液體培養(yǎng)基中增菌24 h，用接種環(huán)蘸取菌液劃線接種在PCA固體培養(yǎng)基上，連續(xù)3 次分離純化，挑取單個菌落于PCB培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)，在PCB培養(yǎng)基（含25%甘油）中保存于－80 ℃。

1.3.3 菌株16S rDNA測序鑒定

1.3.3.1 菌株DNA提取

使用生工生物工程（上海）股份有限公司的細菌提取試劑盒。

1.3.3.2 菌株基因序列的PCR擴增

PCR擴增體系：正向序列引物27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；反向序列引物1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT；PCR體系共為50 μL，其中2×TaqPCR MasterMix 25 μL、水19 μL、DNA模板2 μL、引物27F與引物1492R各2 μL。

PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸60 s；30 個循環(huán)；72 ℃末端延伸5 min。擴增結束后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析結果。

1.3.3.3 測序及進化樹構建

將PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙端測序分析，得到的序列采用BioEdit拼接獲得16S rDNA全長序列，在EZBioCloud（https://www.ezbiocloud.net/）數(shù)據(jù)庫進行比對分析，比對結果未分類部分在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上重新比對分析，結果為芽孢桿菌的菌株構建進化樹，首先采用Clustal X 2.0對拼接后的全長序列進行比對，得到*.aln格式的文件，并采用MEGA 6，分析相似性與親緣關系[15]。

1.3.4 代表性菌株產蛋白酶和淀粉酶分析

分別在PCA瓊脂培養(yǎng)基中加入0%、5%、10%的NaCl，將1.3.2節(jié)鑒定為芽孢桿菌到的菌株活化后取50 μL涂布到PCA培養(yǎng)基中，隨后用接種環(huán)挑取單菌落分別接種到上述含NaCl培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，記錄菌株生長情況，將生長良好的芽孢桿菌繼續(xù)進行產酶能力研究。

產蛋白酶菌株篩選實驗參照Barus等[14]的方法，挑選29 株代表菌株用接種環(huán)取單菌落分別接種到NaCl含量為0%、5%和10%的脫脂牛奶培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，分別測定菌株的菌落直徑與透明圈直徑，依據(jù)菌落與透明圈直徑比值判斷菌株在不同鹽分中的產蛋白酶能力。

產淀粉酶菌株篩選實驗參照Tallapragada等[16]的方法，分別在含0%、5%和10% NaCl的淀粉培養(yǎng)基上用接種環(huán)接種29 株代表菌株，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，采用盧戈氏碘液染色產生透明圈，測量菌株的菌落直徑與透明圈直徑并計算比值（D/d），以此判斷在不同NaCl含量下菌株的產淀粉酶能力。

1.3.5 代表性菌株抗生素耐藥性評價

抗生素耐藥實驗根據(jù)美國臨床和實驗標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的K-B紙片擴散法進行操作。挑取單個菌落于生理鹽水中，制成麥氏濁度為0.5的菌懸液，取50 μL菌懸液用滅菌徹底的涂布棒均勻涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基平板表面，將抗生素紙片貼在涂布有菌液的MH瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后測定抑菌圈直徑。實驗結果按照WS/T 639—2018《抗菌藥物敏感性試驗的技術要求》要求判定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Excel軟件處理，圖形繪制采用Origin軟件，MEGA 6軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 郫縣豆瓣醬中芽孢桿菌相對豐度

采用宏基因組測序分析郫縣豆瓣醬中微生物物種分類情況，其中芽孢桿菌分類結果如表1所示。宏基因組測序共鑒定出24 種芽孢桿菌，其中蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）占到細菌總數(shù)的51.36%，占芽孢桿菌總數(shù)的97.75%。根據(jù)宏基因組物種分類結果，對郫縣豆瓣醬中的芽孢桿菌進行分離鑒定并開展后續(xù)研究，以期為郫縣豆瓣醬中芽孢桿菌的認識提供基礎。

表1 郫縣豆瓣醬中芽孢桿菌相對豐度Table 1 Relative abundance of Bacillus in Pixian broad bean paste %

2.2 郫縣豆瓣醬中芽孢桿菌鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

圖1 郫縣豆瓣醬中芽孢桿菌的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Bacillus in Pixian broad bean paste

依據(jù)在EZBioCloud（https://www.ezbiocloud.net/）數(shù)據(jù)庫的比對結果，有66 株為芽孢桿菌，分別屬于14 個種（其中1 株unclassified），結果如表2所示。為更明確顯示所分離菌株的分類學地位和系統(tǒng)發(fā)育關系，對66 株芽孢桿菌使用MEGA 6軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用最大似然法統(tǒng)計分類，可聚為3 類，第1類主要為B. australimaris、B. safensis、B. pumilus、B. altitudinis、B. cereus、B. horneckiae、B. aryabhattai，第2類主要為B. velezensis、B. subtilis，第3類主要為B. licheniformis、B. paralicheniformis、B. haynesii、B. oryzaecorticis，結果見圖1。可以看出郫縣豆瓣醬中的芽孢桿菌具有豐富的多樣性。結合表型性狀，從中選擇29 株作為代表菌株進行產蛋白酶、淀粉酶以及抗生素耐藥實驗。

表2 芽孢桿菌16S rDNA序列鑒定結果Table 2 Identification of Bacillus by 16S rDNA sequencing

2.3 產蛋白酶能力評價

圖2 不同NaCl含量培養(yǎng)基中芽孢桿菌產蛋白酶（a）和淀粉酶（b）菌株占比Fig. 2 Percentages of protease-producing (a) and amylase-producing (b)strains of Bacillus in media with different salt contents

如圖2a所示，29 株受試菌株在0% NaCl培養(yǎng)基上共有21 株菌能產蛋白酶，占72%，然而，5% NaCl脫脂牛奶培養(yǎng)基上僅有6 株菌能產蛋白酶，占21%，10% NaCl脫脂牛奶培養(yǎng)基上僅有5 株菌能產蛋白酶，占17%，其中CR27（B. cereus）、LY13、LY3（B. velezensis）、CR29、CR31（B. licheniformis）在0%～10% NaCl中均能夠產生蛋白酶，具體為CR27在0%～10% NaCl中D/d范圍為1.92～1.13，LY13為2.44～1.25，LY3為1.58～1.20，CR29為1.60～1.25，CR31為1.67～1.15（表3），隨著NaCl含量的增加，芽孢桿菌產蛋白酶能力逐漸降低，表明NaCl能夠抑制芽孢桿菌產蛋白酶能力。

表3 0%～10% NaCl條件下芽孢桿菌產蛋白酶能力（以D/d值表示）Table 3 D/d value for protease-producing ability of Bacillus at different salt contents

2.4 產淀粉酶能力評價

29 株典型芽孢桿菌在不同NaCl含量培養(yǎng)基中產淀粉酶菌株占比不一，結果如圖2b所示。13 株在0% NaCl條件下能產淀粉酶，9 株在5% NaCl環(huán)境能產淀粉酶，僅有5 株能在10% NaCl含量培養(yǎng)基中產淀粉酶。同時，在0%～10% NaCl條件下耐鹽菌株LY3、LY13（B. velezensis）、WB48（B. subtilis）、CR29、CR31（B. licheniformis）均能夠產生淀粉酶，具體為LY13在0%～10% NaCl中D/d范圍為3.00～1.67，WB48為1.37～1.19，LY3為3.60～1.67，CR29為1.67～1.20，CR31為2.33～1.33（表4）。說明NaCl能夠抑制芽孢桿菌產淀粉酶能力，且NaCl含量越高，抑制作用越強。

表4 0%～10% NaCl條件下芽孢桿菌產淀粉酶能力（以D/d值表示）Table 4 D/d value for amylase-producing ability of Bacillus at different salt contents

2.5 芽孢桿菌抗生素耐藥性實驗

采用K-B紙片擴散法對29 株受試菌株進行抗生素耐藥性檢測，氨芐西林、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、紅霉素、復方新諾明、吉他霉素、苯唑西林、克林霉素、鏈霉素、青霉素、新霉素共12 種抗生素的耐藥性，檢測結果見表5。

從郫縣豆瓣中分離得到的芽孢桿菌對氨芐西林（19/29）、卡那霉素（2/29）、四環(huán)素（3/29）、氯霉素（3/29）、紅霉素（11/29）、復方新諾明（2/29）、吉他霉素（1/29）、苯唑西林（11/29）、克林霉素（18/29）、鏈霉素（2/29）、青霉素（18/29）均表現(xiàn)不同程度的耐藥，對新霉素（0/29）全部表現(xiàn)出敏感。29 株芽孢桿菌的耐藥情況為氨芐西林＞青霉素＞克林霉素＞苯唑西林＞紅霉素＞四環(huán)素＞氯霉素＞鏈霉素=復方新諾明=卡那霉素＞吉他霉素＞新霉素。

大多數(shù)芽孢桿菌表現(xiàn)出多重抗生素耐藥性，結果如表6所示。不同芽孢桿菌對抗生素的耐受情況不一，大多對氨芐西林（66%）、青霉素（62%）和克林霉素（62%）耐受。WB91（B. haynesii）、CR27（B. cereus）、WB104（B. paralicheniformis）、WB1（B. aryabhattai）具有較強的抗生素耐藥性，LJ34（unclassified）、LJ1（B. australimaris）對12 種抗生素均敏感。

表5 芽孢桿菌抗生素耐藥性實驗結果Table 5 Analysis of Bacillus antibiotic resistance

表6 芽孢桿菌多重抗生素耐藥性Table 6 Multiple antibiotic resistance of Bacillus

3 討 論

郫縣豆瓣醬是在開放的環(huán)境中自然發(fā)酵而形成的具有獨特風味品質的發(fā)酵食品，其獨特風味主要是在后熟階段形成[17-18]。芽孢桿菌是郫縣豆瓣發(fā)酵階段的優(yōu)勢菌群之一[19-21]，在改善食品風味和提高品質方面有一定積極作用[22]。董丹等[5]從發(fā)酵2 個月的豆瓣中分離得到的芽孢桿菌屬占到總分離菌株數(shù)量的49%；Li Zhihua等[23]通過PCR和變性梯度凝膠電泳相結合的方法和高通量測序在不同品牌郫縣豆瓣中均發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌。但是目前郫縣豆瓣醬中菌株水平的分類還鮮見詳細報道。本實驗采用宏基因組測序分析郫縣豆瓣醬中微生物，共鑒定到24 種芽孢桿菌，而采用純培養(yǎng)分離方法結合16S rDNA全長基因對郫縣豆瓣醬中芽孢桿菌進行鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析，共分離到66 株芽孢桿菌，分屬于13 個種，代表性菌株構建的分子進化樹表明郫縣豆瓣醬中分離到的芽孢桿菌主要分為3 大類，豐富了對郫縣豆瓣醬中芽孢桿菌的認識。

前人研究表明，芽孢桿菌具有的產酶能力，是郫縣豆瓣風味和呈色的重要來源[24-25]。已有文獻報道郫縣豆瓣中多種芽孢桿菌具有產生淀粉酶與蛋白酶能力，如B. subtilis、B. licheniformis、B. safensis、B. cereus等[5]。除豆瓣醬外，多種發(fā)酵食品中芽孢桿菌也具有相當?shù)漠a酶能力，如納豆中芽孢桿菌蛋白酶活性很高，因此芽孢桿菌被廣泛應用于發(fā)酵食品品質的提升[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，B. licheniformis（CR29、CR31）與B. velezensis（LY3、LY13）在10% NaCl條件仍能同時產生兩種酶，而B. cereus（CR27）僅產生蛋白酶，B. subtilis（WB48）僅產生淀粉酶。另外，研究發(fā)現(xiàn)隨著NaCl含量增加，芽孢桿菌產酶能力逐漸下降，NaCl含量不斷增加對酶類的產生有抑制作用，這與醬油曲霉的研究結果類似，低含量NaCl對蛋白酶有激活作用，而高含量NaCl對蛋白酶起抑制作用[28]。因此，在保證食用安全和風味的前提下，適當降低郫縣豆瓣后熟NaCl含量，將有利于發(fā)揮芽孢桿菌的產酶能力，促進微生物產酶代謝活動，從而有可能縮短發(fā)酵周期。

抗生素導致的食品安全問題已經引起全球廣泛關注，耐藥性菌株有可能通過腸道傳遞耐藥基因，從而影響人體健康[29]。Jeong等[11]對韓國發(fā)酵大豆食品中分離到的38 株B. licheniformis進行檢測，63%菌株對氯霉素耐藥，100%的菌株對克林霉素和鏈霉素耐藥，50%對紅霉素耐藥，66%對卡那霉素耐藥，而本實驗郫縣豆瓣中B. licheniformis僅對上述抗生素中克林霉素100%耐藥，20%對紅霉素耐藥，表明郫縣豆瓣中的B. licheniformis對抗生素更敏感，差異可能跟原料和發(fā)酵環(huán)境有關。董丹等[30]從郫縣豆瓣中分離出B. cereus，對鏈霉素、青霉素G、卡那霉素、四環(huán)素、克林霉素、紅霉素、氯霉素等出現(xiàn)耐藥，而對氨芐西林等敏感，同樣地，李研東[31]研究表明蠟樣芽孢桿菌對卡那霉素、四環(huán)素、青霉素等藥物耐受。而本實驗中B. cereus對氨芐西林、紅霉素、復方新諾明、苯唑西林、克林霉素、青霉素均耐藥，原因可能是生產車間環(huán)境和發(fā)酵工藝存在差異。本研究29 株芽孢桿菌對不同抗生素耐藥性表現(xiàn)不一，對氨芐西林和青霉素耐藥率最高，對新霉素敏感，分析芽孢桿菌的抗生素耐藥性為郫縣豆瓣醬的風險評估提供理論基礎。