秦艷,趙希娟,2*,郭鵬妹,龐雯輝,董超,張耀海,王成秋,趙其陽,焦必寧*

1(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院/西南大學(xué)柑桔研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶),農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑橘類果品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶,400712)2(西南大學(xué) 園藝園林學(xué)院,重慶,400715)

酸橙(CitrusaurantiumL.)為蕓香科柑橘屬植物,廣泛分布于浙江、四川、湖南、江西、福建等省份,可被用于香料、果汁和膳食營養(yǎng)補(bǔ)充劑的加工;在傳統(tǒng)中藥中,酸橙可作為枳實(shí)或者枳殼,治療消化不良和脹氣[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明酸橙具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、抑菌[4]和防止動(dòng)脈粥樣硬化[5]等功效,其良好的健康效應(yīng)與類黃酮、生物堿、類檸檬苦素等多種生物活性成分密切相關(guān)。

目前對(duì)于酸橙的研究較少且主要集中在其枳殼與枳實(shí)中的化學(xué)成分以及藥理學(xué)方面,鄧可眾等[6]利用高效液相色譜建立了酸橙果實(shí)類藥材中8種類黃酮和3種香豆素類化合物的定量分析方法。ANA等[7]利用UPLC-PDA-ESI-MS對(duì)酸橙中的9種酚類化合物(5種類黃酮和4種酚酸)進(jìn)行了分析鑒定。張棟健等[8]通過UPLC-QTOF-MS/MS分析了發(fā)酵炮制過程對(duì)于枳殼中類黃酮和檸檬苦素成分的影響。以上研究?jī)H集中于酸橙中的某一類生物活性成分,或者某一種酸橙品種的生物活性成分,難以反映藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。有研究表明,不同品種及不同部位中含有的生物活性成分往往存在較大差異[9],有必要對(duì)不同品種及不同部位酸橙果實(shí)的生物活性成分進(jìn)行系統(tǒng)研究。從而為酸橙的質(zhì)量評(píng)價(jià)和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為酸橙資源的綜合利用奠定基礎(chǔ)。

本文基于本實(shí)驗(yàn)室前期建立的快速且能同時(shí)篩查柑橘中生物活性物質(zhì)的超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜的方法,同時(shí)結(jié)合數(shù)據(jù)庫、標(biāo)準(zhǔn)品和相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)6個(gè)不同品種以及不同部位的酸橙生物活性物質(zhì)進(jìn)行靶向和非靶向高分辨率篩查,以期為酸橙資源的綜合利用提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

2020年12月于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所國家果樹種質(zhì)資源(重慶)柑橘圃采集6個(gè)品種的酸橙果實(shí),包括小葉酸橙(XY)、代代酸橙(DD)、萬木橙(WM)、蚌柑(BG)、摩洛哥酸橙(MLG)、黃皮酸橙(HP)。在各個(gè)方向上采集發(fā)育良好、無病蟲害、處于成熟期的酸橙果實(shí)(圖1)。

S1-小葉酸橙；S2-代代酸橙；S3-萬木橙；S4-蚌柑；S5-摩洛哥酸橙；S6-黃皮酸橙(下同)

甲酸(色譜純),上海吉至生化科技有限公司。本研究共使用95種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),包括46種類黃酮、9種酚酸、3種類檸檬苦素、8種生物堿、29種香豆素。新北美圣草苷、5-降甲基蜜桔黃素、甲基橙皮苷、地奧司明、香葉木素、香蒲新苷等,成都克洛瑪生物科技有限公司；花椒毒醇、白當(dāng)歸素、珊瑚菜素、蛇床子素、根皮苷、異槲皮苷、槲皮素、異橙黃酮、水仙苷等,上海源葉生物技術(shù)有限公司；辛弗林、N-甲基酪胺、香檸檬亭,美國ChromaDex；甲醇和乙腈(色譜純)、苯腎上腺素、大麥芽堿、酪胺和橙皮油內(nèi)酯,美國Sigma-Aldrich；章魚胺,德國Dr.Ehrenstorfer GmbH。所有標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于95%以上,具體標(biāo)準(zhǔn)品信息參照龐雯輝等[10]的文獻(xiàn)。

1.2 儀器

KQ5200DE超聲波清洗儀,昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q AdvantageA10超純水系統(tǒng),美國Millipore；3K15離心機(jī),美國Sigma-Aldrich；PB3002-S/FACT分析天平(感量0.01 g),瑞士梅特勒-托利多公司；有機(jī)相針式濾器(13 mm,0.22 μm),上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；Acquity UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)色譜柱,美國Waters公司；Nexera X2 UPLC超高效液相色譜,日本島津公司；SCIEX X500R QTOF四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜儀,美國AB SCIEX公司。

1.3 樣品準(zhǔn)備

樣品采摘后用去離子水洗凈擦干。參照GB/T 8210—2011《柑桔鮮果檢驗(yàn)方法》樣品前處理方法。

分別稱取5.0 g鮮重樣品(果皮、果肉、果汁)于50 mL離心管中,加入10 mL甲醇,其中果肉加入5 mL甲醇,超聲提取30 min(25 ℃,200 W),轉(zhuǎn)速為10 000 r/min,離心5 min,取上清液置于50 mL離心管中。上述提取和離心步驟再重復(fù)3次后,合并上清液,并用甲醇定容到50 mL,果肉定容到25 mL,將上述提取液用0.22 μm微孔有機(jī)濾膜過濾后放置于進(jìn)樣小瓶,上機(jī)檢測(cè)。

1.4 UPLC-Q-TOF-HRMS測(cè)定

本研究采用IDA模式在正、負(fù)2種離子模式下,通過AB SCIEX X500R QTOF高分辨四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)。色譜質(zhì)譜條件采用龐雯輝等[10]的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

將UPLC-Q-TOF-HRMS數(shù)據(jù)平臺(tái)采集得到的數(shù)據(jù)信息導(dǎo)入SCIEX OS軟件,建立未知化合物的鑒定流程,設(shè)立偏差值為5.0×10-6,匹配得分>80,對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取和峰對(duì)齊,并將提取得到的色譜峰進(jìn)行分子式擬合,結(jié)合中草藥數(shù)據(jù)庫和SCI Finder數(shù)據(jù)庫、標(biāo)準(zhǔn)品和相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行對(duì)比,從而進(jìn)行化合物的分析與鑒定,采用Origin 2017繪制總離子色譜圖和層次聚類熱圖。

2 結(jié)果分析

2.1 酸橙果皮的總離子色譜圖

使用UPLC-Q-TOF-HRMS系統(tǒng)對(duì)6種酸橙品種的果皮、果肉以及果汁的甲醇提取物進(jìn)行分析。共鑒定出化合物84種,包括類黃酮44種,酚酸8種,類檸檬苦素2種,香豆素22種,生物堿8種。圖2為正負(fù)離子模式下6個(gè)酸橙品種的果皮提取液的色譜圖。

圖2 六種酸橙果皮總離子圖

通過比較色譜出峰可以發(fā)現(xiàn),正負(fù)離子模式下,6種果皮提取液的色譜峰型和出峰數(shù)量具有一定的差異,表明不同酸橙品種的生物活性成分存在差異。

2.2 化合物的鑒定及裂解規(guī)律

2.2.1 類黃酮

化合物83,在ESI-模式下,準(zhǔn)分子離子峰m/z為343.082 1[M-H]-。二級(jí)質(zhì)譜中,連續(xù)經(jīng)過脫去15 Da的CH3、28 Da的CO,產(chǎn)生特征碎片離子m/z分別為328.059 3的[M-H-CH3]-、313.035 4[M-H-2CH3]-、298.011 9[M-H-2CH3-CO]-,或發(fā)生RDA裂解重排后,失去—C2H2O產(chǎn)生m/z為163.002 7(0,4B--C2H2O),通過與數(shù)據(jù)庫對(duì)比和文獻(xiàn)[16]對(duì)比,初步推斷該化合物為異澤蘭黃素,該化合物在酸橙中首次報(bào)道。

2.2.2 酚酸

酚酸類化合物是具有一個(gè)羧酸基團(tuán)的酚類化合物,主要以酰胺、酯或糖苷鍵的結(jié)合方式存在。分為基本骨架為C6—C3肉桂酸型和基本骨架為C6—C1苯甲酸型及其衍生物[17]。在二級(jí)質(zhì)譜裂解過程中,容易丟失小分子基團(tuán)如CO2,H2O,CH3,HCOOH等,產(chǎn)生[M-H-44]-、[M-H-18]-、[M-H-15]-、[M-H-46]-的碎片離子[18]。本實(shí)驗(yàn)在ESI-離子模式下共鑒定了8種酚酸,其中6種酚酸根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和數(shù)據(jù)庫靶向篩查進(jìn)行鑒定?；衔?1和72在ESI-模式下,準(zhǔn)分子離子峰m/z均為353.089[M-H]-,二者在二級(jí)質(zhì)譜裂解的規(guī)律基本一致,其主要的結(jié)構(gòu)區(qū)別在于咖啡酸處于C—3位和C—5位。因此,可以根據(jù)不同的離子峰強(qiáng)度差異用于推斷咖啡酸在奎寧酸上的取代位置。二級(jí)質(zhì)譜中,其特征碎片離子m/z191.057[M-H-C9H6O3]-、179.034 8[M-H-C7H10O5]-以及135.045 1[M-H-C7H12O6-CO2]-,通過標(biāo)準(zhǔn)品、數(shù)據(jù)庫與文獻(xiàn)[19]對(duì)比初步鑒定化合物71和72分別是綠原酸和新綠原酸。

2.2.3 生物堿

化合物2,ESI+模式下,準(zhǔn)分子離子峰m/z為144.100 9[M+H]+,經(jīng)過分子擬合,分子式為C7H13NO2,其特征碎片離子m/z為84.080 5[M+H-COOH-CH3]+以及質(zhì)譜響應(yīng)值較高的碎片58.064 7(CH3CH2N),后者為典型的季胺堿類生物堿的裂解特征。通過結(jié)合Sci Finder數(shù)據(jù)庫并查閱相關(guān)文獻(xiàn)[21],初步鑒定該化合物為水蘇堿。按照同樣的方法,鑒定化合物1為六氫吡啶羧酸。

化合物4,ESI+模式下,準(zhǔn)分子離子峰m/z為268.104 0[M+H]+,分子擬合式為C10H13N5O4,丟失了1分子132 Da的呋喃核糖殘基產(chǎn)生碎片離子m/z136.061 8[M+H-C5H8O4]+特征離子碎片。根據(jù)數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻(xiàn)[22]對(duì)比,初步推斷該化合物為腺苷。

2.2.4 類檸檬苦素

類檸檬苦素是一類高度含氧的三萜類物質(zhì),主要以2種形式存在,一種是游離糖苷的形式,主要存在于柑橘種子中,另一種是以β-D-葡萄糖苷類形式,主要存在于柑橘果皮和果肉中[24]。酸橙中類檸檬苦素的種類較少,本實(shí)驗(yàn)僅篩查到2種類檸檬苦素,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì),化合物68和69分別被鑒定為檸檬苦素和諾米林。

2.2.5 香豆素

香豆素指含有苯駢α-吡喃酮母核的肉桂酸型衍生物,具有芳香氣味。根據(jù)取代基不同分為4大類：簡(jiǎn)單香豆素、呋喃香豆素、吡喃香豆素以及其他香豆素[25]。盡管香豆素環(huán)上的取代位點(diǎn)和取代基不同,但它們的斷裂模式具有一定的規(guī)律。香豆素的基本骨架很難被裂解,主要通過丟失—CH3、—CO、—CO2和H2O等小分子基團(tuán)來產(chǎn)生碎片離子。本實(shí)驗(yàn)共鑒定了22種香豆素,其中20種香豆素根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和相關(guān)文獻(xiàn)鑒定。

化合物64在ESI+模式下,準(zhǔn)分子離子峰m/z為203.033 8[M+H]+,二級(jí)質(zhì)譜中,連續(xù)丟失28 Da的CO,分別產(chǎn)生m/z為175.042 9[M+H-CO]+和m/z147.044 1[M+H-2CO]+的碎片離子。再失去17 Da的OH產(chǎn)生m/z131.049 7的[M+H-2CO-OH]-。根據(jù)數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻(xiàn)[26],推斷該化合物為花椒毒酚。

化合物47,ESI+模式下,準(zhǔn)分子離子峰m/z為293.05的[M+H]+連續(xù)丟失—CO和—CH3,其碎片離子m/z133.027[M+H-CO2-CH3]+,同時(shí),失去CH3產(chǎn)生m/z178.025的[M+H-CH3]+,繼續(xù)失去CO產(chǎn)生m/z150.030 Da的[M+H-CH3-CO]+和m/z122.038 7的[M+H-CH3-2CO]+。根據(jù)數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻(xiàn)[27],推斷該化合物為異東莨內(nèi)酯。

2.3 酸橙中生物活性成分的分布

在生物活性成分種類方面,如附表1所示,本研究共鑒定了84種生物活性成分,包括44種類黃酮、8種酚酸、22種香豆素、2種類檸檬苦素、8種生物堿,其中小葉酸橙、代代酸橙、萬木橙、蚌柑、摩洛哥酸橙和黃皮酸橙分別篩查鑒定出72、71、68、71、71和66種生物活性成分。6個(gè)酸橙品種類黃酮種類篩查鑒定排序如下：小葉酸橙(41種)>代代酸橙(40種)>摩洛哥酸橙(39種)=蚌柑(39種)>萬木橙(38種)>黃皮酸橙(33種)。44種類黃酮中,包括12種黃酮、14種多甲氧基黃酮、3種黃酮醇、15種黃烷酮。其中29種類黃酮在6個(gè)酸橙品種中均有檢出,分別為9種黃酮(異葒草素、木犀草素、香葉木素、牡荊素等),9種多甲氧基黃酮(桔皮素、川陳皮素等),10種黃烷酮(新橙皮苷等)以及1種黃烷醇(香蒲新苷)。而牡荊素-2-O-鼠李糖苷僅小葉酸橙和黃皮酸橙中檢出。3,4,7,8-四甲氧基黃酮、甜橙黃酮等6種多甲氧基黃酮在黃皮酸橙中未檢出,而在其他品種中均有檢出。8種酚酸中,D-奎寧酸、新綠原酸、綠原酸、對(duì)羥基苯甲酸、咖啡酸、芥子酸等8種酚酸均在6個(gè)酸橙品種的果皮中檢出。8種生物堿中,六氫吡啶羧酸、水蘇堿、辛弗林、腺苷、苯腎上腺素、N-甲基酪胺均在6個(gè)酸橙品種的不同部位均有檢出。大麥芽堿、異蓮心堿在小葉酸橙、代代酸橙、蚌柑和摩洛哥酸橙的果皮、果肉均有檢出,而在4種酸橙的果汁中,大麥芽堿均有檢出,異蓮心堿未能檢出。6個(gè)酸橙品種中均能篩查鑒定出檸檬苦素和諾米林。22種香豆素中,其中黃皮酸橙中鑒定出17種香豆素,而其余5種酸橙品種中均鑒定出13種香豆素。蛇床子素、花椒毒酚等8種香豆素在6個(gè)酸橙品種均有檢出。歐前胡素、珊瑚菜素、8-氧甲基異歐前胡內(nèi)酯、異茴芹內(nèi)酯、水合氧化前胡素、濱蒿內(nèi)酯、白當(dāng)歸素等僅在黃皮酸橙中有檢出,而橙皮內(nèi)酯水合物、橙皮內(nèi)酯、6′,7′-二羥基香檸檬亭、6′,7′-環(huán)氧香檸檬僅在其余5種酸橙中檢出。橙皮油內(nèi)酯僅在萬木橙和黃皮酸橙中檢出,香柑醇僅在小葉酸橙、代代、蚌柑以及摩洛哥酸橙中檢出。余柳儀等[26]從代代酸橙的花、莖、葉、果實(shí)中檢測(cè)出了19個(gè)黃酮類化合物、12個(gè)多甲氧基黃酮、4個(gè)香豆素化合物、11個(gè)生物堿以及檸檬苦素,所檢出的9種黃烷醇、9種多甲氧基、4種香豆素、3種生物堿及檸檬苦素與本研究一致。而在余柳儀的研究中未檢測(cè)到大麥牙堿、異鼠李素-3-O-橙皮苷、諾米林等多種物質(zhì),本研究中均能檢出。

在生物活性成分相對(duì)含量方面,如圖3所示,對(duì)6個(gè)不同的酸橙品種以及果實(shí)不同部位中類黃酮、酚酸、生物堿、類檸檬苦素、香豆素的果皮峰面積進(jìn)行層次聚類分析。因各品種果皮的生物活性物質(zhì)種類最為豐富,因此以果皮為代表進(jìn)行分析。不同酸橙品種的類黃酮、酚酸、生物堿、類檸檬苦素、香豆素的代謝具有多樣性。代代酸橙和蚌柑的代謝積累模式接近,因此這2個(gè)品種在聚類分析中被歸為一類,這2種酸橙依次與小葉酸橙、萬木橙、摩洛哥酸橙、黃皮酸橙聚類之后組成更高的分類單元,后4種酸橙代謝物積累模式差異很大。黃皮酸橙的含量明顯高于其他酸橙品種,如歐前胡素、珊瑚菜素、8-氧甲基異歐前胡內(nèi)酯、異茴芹內(nèi)酯、水合氧化前胡素、濱蒿內(nèi)酯、白當(dāng)歸素。結(jié)合附表1篩查鑒定結(jié)果,這些成分僅僅存在于黃皮酸橙中,因此可認(rèn)為是區(qū)別于其他品種的特征成分。萬木橙中異槲皮苷、橙皮油內(nèi)酯、檸檬苦素、傘形花內(nèi)酯、芥子酸、新綠原酸、甜橙黃酮等12種多甲氧基黃酮含量明顯高于其他酸橙品種。對(duì)于不同部位酸橙果實(shí)的類黃酮、酚酸、生物堿、香豆素、檸檬苦素的相對(duì)含量層次聚類研究發(fā)現(xiàn),酸橙中果皮、果肉、果汁這3個(gè)部位的代謝具有組織特異性,其在果肉和果汁中的積累模式接近,而果皮中生物活性成分含量明顯高于果肉和果汁。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,酸橙品種遺傳的多樣性與過氧化物同工酶、GOT等位基因、不同染色體上的單拷貝基因序(single-copy nuclear gene,SCNGS)等相關(guān),表明酸橙具有復(fù)雜的遺傳背景[28]。何發(fā)[29]基于SSR技術(shù)分析酸橙的起源,發(fā)現(xiàn)酸橙的親本來源于柚和寬皮柑橘,在此基礎(chǔ)上,柳俊杰[30]基于全基因組測(cè)序進(jìn)行了不同品種的酸橙非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)聚類分析,表明黃皮酸橙為寬皮柑橘和宜昌橙的雜交品種,不屬于酸橙純種,而代代保留最原始的親本柚的基因組信息,可為不同酸橙品種代謝物積累模式的多樣性提供一定的參考。

a-不同品種酸橙果皮的生物活性成分相對(duì)含量；b-酸橙果實(shí)不同部位中生物活性成分相對(duì)含量

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)使用UPLC-Q-TOF-HRMS技術(shù)并采用靶向和非靶向篩查相結(jié)合的方法,對(duì)6個(gè)酸橙品種中的84種生物活性成分進(jìn)行了分析和鑒定,包括44種類黃酮、8種酚酸、22種香豆素、2種類檸檬苦素、8種生物堿。其中,35種生物活性成分在酸橙中首次報(bào)道,此研究進(jìn)一步豐富了酸橙生物活性成分的數(shù)據(jù)庫。小葉酸橙、代代酸橙、萬木橙、蚌柑、摩洛哥酸橙和黃皮酸橙分別篩查鑒定出72、71、68、71、71和66種生物活性成分。通過對(duì)84種生物活性成分的果皮峰面積層次聚類分析,研究發(fā)現(xiàn)黃皮酸橙果皮中有區(qū)別于其他酸橙品種的特征成分,如歐前胡素、珊瑚菜素、8-氧甲基異歐前胡內(nèi)酯、異茴芹內(nèi)酯、水合氧化前胡素、濱蒿內(nèi)酯、白當(dāng)歸素等。同時(shí)發(fā)現(xiàn)果皮中所含有的生物活性成分的種類和數(shù)量遠(yuǎn)多于果汁和果肉中。此研究為酸橙的深加工和其中含有的多種生物活性成分的綜合利用提供理論依據(jù)。