王莎莎,沈習(xí)習(xí),李曼曼,沈娟,唐長波,王瑋*

1(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院,江蘇 南京,210095)2(國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)),江蘇 南京,210095)3(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉及肉制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(南京)(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)),江蘇 南京,210095)

有機磷農(nóng)藥(organophosphorus pesticides,OPPs)是一類含有磷原子的有機酯類化合物,因其高效、經(jīng)濟、廣譜、易降解等特點而廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,主要用于防治植物病蟲害[1]。OPPs經(jīng)使用后殘存于環(huán)境和植物體內(nèi),通過食物鏈富集進入動物體內(nèi),可對生鮮肉造成污染[2]。據(jù)報道,OPPs進入人體后,通過抑制膽堿酯酶活性,使機體發(fā)生功能性紊亂,導(dǎo)致機體出現(xiàn)一系列神經(jīng)中毒癥狀,如出汗、震顫、精神錯亂、語言失常等,嚴(yán)重者可導(dǎo)致呼吸麻痹而死亡[3]。因此,我國自2001年起已明令禁止使用對硫磷、久效磷、甲胺磷等高毒有機磷農(nóng)藥,并限制使用毒死蜱、三唑磷、敵敵畏等中毒有機磷農(nóng)藥[4]。世界各國和國際組織也制定了動物源食品中農(nóng)藥最大殘留限量(maximum residue limits,MRLs)。例如,國際食品法典委員會(Codex Alimentarius Commission,CAC)規(guī)定39種動物源產(chǎn)品中1 021項農(nóng)藥MRLs[5]；韓國規(guī)定35種動物源產(chǎn)品中7 941項農(nóng)藥MRLs[6]；我國GB 2763—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定27種動物源產(chǎn)品中903項農(nóng)藥MRLs。

生鮮肉因脂肪、蛋白含量較高,致使其基質(zhì)較為復(fù)雜。因此,為減少農(nóng)藥檢測過程中基質(zhì)干擾現(xiàn)象,選擇合適的樣品前處理方法顯得尤為重要。迄今,生鮮肉中農(nóng)藥殘留檢測的前處理方法主要有固相萃取法[7]、加速溶劑萃取法[8]、凝膠滲透色譜凈化[9]、QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe)[10]等?，F(xiàn)有方法雖各有優(yōu)勢,但也存在著缺點和局限性,如凝膠滲透色譜和加速溶劑萃取法雖能準(zhǔn)確分離出農(nóng)藥殘留組分,但溶劑消耗量大、操作繁瑣、易造成二次污染[11]。QuEChERS法作為近年來新興的樣品前處理技術(shù),因其凈化過程簡單、快速、高效、經(jīng)濟等優(yōu)點,已廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)境、生物等領(lǐng)域[12]。因此,本實驗選擇QuEChERS法對生鮮肉進行前處理。農(nóng)藥殘留的檢測技術(shù)主要有酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)[13]、GC[14]、HPLC[15]、GC-MS、GC-MS/MS[16]、LC-MS/MS[17-18]等。其中,ELISA主要用于大批樣品的初步篩查,抗體有效性短,易出現(xiàn)假陽性結(jié)果[13]；GC與GC-MS檢測范圍有限,不利于揮發(fā)性小、分子質(zhì)量大的樣品檢測[16]；HPLC與LC-MS/MS常用于揮發(fā)性小,熱穩(wěn)定性差的樣品檢測,檢測農(nóng)藥種類少[19]。較之上述方法,GC-MS/MS具有較高靈敏度和抗干擾能力,分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠,適用于痕量物質(zhì)的檢測[20]。因此,本實驗基于QuEChERS前處理方法,建立了一種可同時檢測生鮮肉中18種OPPs的GC-MS/MS方法。該方法的建立為我國生鮮肉中農(nóng)藥殘留的高通量快速檢測以及食品安全監(jiān)管提供科學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉,江蘇省南京市超市和農(nóng)貿(mào)市場；陰性畜禽肉,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉及肉制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(南京)。

標(biāo)準(zhǔn)品：敵敵畏(dichlorvos)、蟲螨磷(insecticidal phosphorus)、速滅磷(mevinphos)、二嗪磷(diazinon)、三唑磷(triazophos)、滅線磷(ethoprophos)、皮蠅磷(fenchlorphos)、殺螟硫磷(fenitrothion)、毒死蜱(chlorpyrifos)、倍硫磷(fenthion)、對硫磷(parathion)、乙硫磷(ethion)、地蟲硫磷(fonofos)、甲拌磷(phorate)、久效磷(monocrotophos)、馬拉硫磷(malathion)、乙拌磷(disulfoton)、特丁硫磷(terbufos),質(zhì)量濃度均為100 μg/mL,上海安譜實驗科技股份有限公司。

試劑：乙腈、正己烷、乙酸乙酯,丙酮,均為色譜純,MgSO4、NaCl、CH3COONa,均為分析純,上海安譜實驗科技股份有限公司；N-丙基乙二胺(primary secondary amine,PSA)、十八烷基鍵合硅膠(C18),粒徑均為40 μm,美國安捷倫科技有限公司；實驗所用水均為一級水。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ 8000 EVO三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司；DB-1701色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),美國安捷倫科技有限公司；D-16C高速冷凍離心機、arium?advance EDI純水儀,德國Sartorius公司；N-EVAP型氮吹儀,美國Organomation公司；Vortex Genius漩渦混勻器,德國IKA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

提?。簻?zhǔn)確稱取5.00 g(精確至0.01 g)均質(zhì)樣品于50 mL離心管中,加入10 mL飽和正己烷的乙腈溶液提取,渦旋混勻1 min；加入1 g MgSO4和1.5 g CH3COONa,渦旋混勻1 min,4 ℃下10 000 r/min離心5 min。

凈化：轉(zhuǎn)移上清液,置于裝有凈化材料(1 g MgSO4、0.15 g PSA、0.15 g C18)離心管中,渦旋振蕩1 min,4 ℃下10 000 r/min離心5 min；轉(zhuǎn)移上清液于新的50 mL離心管中,35 ℃氮吹至近干,加入1 mL乙酸乙酯復(fù)溶；復(fù)溶液過0.22 μm濾膜,供GC-MS/MS分析檢測。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：將18種質(zhì)量濃度為100.0 mg/L的OPPs標(biāo)準(zhǔn)品,根據(jù)其理化性質(zhì)和測定條件以丙酮為溶劑稀釋定容至各農(nóng)藥質(zhì)量濃度為5.00 mg/L,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：精確移取一定量標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,用丙酮稀釋定容至質(zhì)量濃度為1.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：精確移取一定量標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,用丙酮稀釋至各質(zhì)量濃度為0.005、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.3 GC-MS/MS方法的建立

氣相色譜條件：色譜柱：Agilent DB-1701(30 m×0.25 mm,0.25 μm)；載氣：高純氦氣(99.999%)；流速1.0 mL/min；進樣方式：不分流進樣；進樣量1 μL；進樣口溫度280 ℃；升溫程序：初始溫度50 ℃保持2 min,以30 ℃/min升溫至180 ℃,再以10 ℃/min升溫至260 ℃。

質(zhì)譜條件：電離方式：電子轟擊源(electron impact ion source,EI)；電離能量70 eV；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度270 ℃；掃描離子范圍50～500 u；掃描方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(multi-reactive ion monitoring,MRM)。

1.3.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(matrix effects,ME)是指樣品中除分析物以外的其他成分對待測物產(chǎn)生干擾,從而引起待測組分信號抑制或增強[21]。實際工作中ME通常以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線兩者斜率(k)之比來進行評估,即ME=k基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線/k純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)ME>1時,為基質(zhì)增強效應(yīng)；ME<1為基質(zhì)減弱效應(yīng)；ME=1,則不存在基質(zhì)干擾現(xiàn)象。一般認(rèn)為,當(dāng)ME比值為0.8～1.2時,為弱基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME>1.2或<0.8時,ME較強[22]。

1.3.5 線性范圍的確定

基于已建立的GC-MS/MS方法,分別以陰性豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉為基質(zhì),配制7個不同梯度(0.005～0.50 mg/L)的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。經(jīng)檢測,最低點濃度出峰狀況良好,最高點濃度也在儀器檢測范圍之內(nèi),能夠滿足本實驗對不同組分相關(guān)系數(shù)的要求。以定量離子質(zhì)量色譜圖峰面積為縱坐標(biāo)(Y),對應(yīng)溶液質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)(X),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算平方相關(guān)系數(shù)(square of correlation coefficient,R2)。

1.3.6 檢出限和定量限

分別以陰性豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉的低濃度添加水平(5.00 μg/kg)進行測定,平行測定10份樣品。以信噪比S/N=3和S/N=10所對應(yīng)濃度,分別計算出各組分在5種基質(zhì)中的檢出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ)[23]。

1.3.7 準(zhǔn)確度和精密度試驗

分別以陰性豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉為基質(zhì)進行低、中、高3個水平(5.00、10.00、20.00 μg/kg)的加標(biāo)回收試驗,每個水平平行測定6次,計算平均加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.3.8 方法的實際應(yīng)用

選用市售生鮮肉30份,其中豬、牛、羊、雞、鴨各6份,15份購自超市,15份購自農(nóng)貿(mào)市場,參照1.3.1和1.3.3節(jié)進行樣品前處理和上機測定,以此評價該方法的實際應(yīng)用效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的優(yōu)化

鑒于18種OPPs的分子極性差異,本試驗分別采用乙腈、飽和正己烷的乙腈溶液、V(乙腈)∶V(水)=4∶1、丙酮、乙酸乙酯作為樣品提取溶劑。在其他試驗條件相同情況下,分別向5種陰性基質(zhì)中添加20 μg/kg OPPs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以18種農(nóng)藥回收率為指標(biāo),比較5種不同提取劑的提取效果。由表1可知,飽和正己烷的乙腈溶液在5種基質(zhì)中均呈現(xiàn)出最佳的提取效果,其回收率最高。因此,本試驗選擇飽和正己烷的乙腈溶液作為樣品提取劑。

表1 提取溶劑對18種農(nóng)藥回收率的影響

2.1.2 緩沖體系的優(yōu)化

樣品經(jīng)提取后,向提取液中加入緩沖體系能使其整體狀態(tài)更加均一,同時利用鹽析作用,經(jīng)離心后可使水相、有機相更易分層。本試驗分別考察了4種緩沖體系組合對提取效果的影響,在其他試驗條件相同情況下,分別向5種陰性基質(zhì)中添加20 μg/kg OPPs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以18種農(nóng)藥回收率為指標(biāo),比較不同緩沖體系的萃取效果。由表2可知：緩沖體系(1 g MgSO4+1.5 g CH3COONa)在5種基質(zhì)中的萃取效果最佳,回收率最高。因此,本試驗選擇1 g MgSO4和1.5 g CH3COONa作為緩沖體系。

表2 緩沖體系對18種農(nóng)藥回收率的影響

2.1.3 吸附劑用量的優(yōu)化

生鮮肉種類繁多,其基質(zhì)也較為復(fù)雜,因此需根據(jù)樣品基質(zhì)類型,選擇合適配比的凈化材料。本試驗分別考察了4種吸附劑組合對凈化效果的影響,在其他試驗條件相同情況下,分別向5種陰性基質(zhì)中添加20 μg/kg OPPs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以18種農(nóng)藥回收率為指標(biāo),比較不同吸附劑的凈化效果。由表3可知,吸附劑(0.15 g PSA+0.15 g C18+1 g MgSO4)在5種基質(zhì)中的凈化效果最佳,回收率均為60%～120%。因此,本試驗選擇吸附劑(0.15 g PSA+0.15 gC18+1 g MgSO4)組合對樣品進行凈化。

表3 吸附劑組合對18種農(nóng)藥回收率的影響

2.2 GC-MS/MS條件優(yōu)化

通過優(yōu)化GC條件,18種OPPs用DB-1701色譜柱均能實現(xiàn)較好地分離,且響應(yīng)高,無雜峰。因此,本試驗在1.3.3節(jié)選定的色譜條件下,對每種農(nóng)藥進行全掃描分析,得到18種OPPs標(biāo)準(zhǔn)工作溶液總離子流圖(圖1)。從總離子流圖中確定每種農(nóng)藥的保留時間,并選擇質(zhì)荷比較大、豐度高的特征離子作為母離子。對選定的母離子用選擇離子方式進行掃描,從二級質(zhì)譜圖中選擇1～2個離子作為子離子,在MRM模式下,進行碰撞能量優(yōu)化,優(yōu)化結(jié)果見增強出版附表1。

附表1 18種OPPs保留時間、定量離子、定性離子

圖1 18種OPPs標(biāo)準(zhǔn)工作溶液總離子流圖

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

由增強出版附表2可知,18種農(nóng)藥在5種基質(zhì)中均呈現(xiàn)出基質(zhì)增強效應(yīng)。本實驗雖通過優(yōu)化前處理方法減少了其基質(zhì)干擾,但仍有部分農(nóng)藥ME較強(ME>1.2)。因此,為克服基質(zhì)效應(yīng)和確保分析方法的準(zhǔn)確性,本試驗最終采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進行校正。

附表2 18種OPPs的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限、定量限、基質(zhì)效應(yīng)

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限

本試驗采用空白基質(zhì)提取液配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,共設(shè)置7個濃度點,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由增強出版附表3可見,每種農(nóng)藥在1～100 μg/kg均呈現(xiàn)良好線性關(guān)系(R2>0.990 0),檢出限為0.02～0.74 μg/kg,定量限為0.08～2.48 μg/kg。

附表3 18種OPPs的加標(biāo)回收率和RSD(n=6)

2.4.2 方法添加回收率和精密度

根據(jù)GB 2763—2021規(guī)定,生鮮肉中農(nóng)藥殘留限量一般在10 μg/kg。因此,本試驗選取1/2限量、限量及2倍限量對每種基質(zhì)進行低、中、高3個水平(5、10、20 μg/kg)的加標(biāo)回收試驗。由表6可知,樣品平均回收率為76%～106%,RSD為0.50%～7.9%。

2.5 方法實際應(yīng)用評價

為證實本方法的實際應(yīng)用價值,分別在超市和農(nóng)貿(mào)市場隨機選取30份生鮮肉作為研究對象,采用本試驗建立的方法進行檢測。由表4可知,在1份牛肉中檢出馬拉硫磷(0.8 μg/kg),1份羊肉中檢出倍硫磷(0.6 μg/kg)。

表4 市售產(chǎn)品中農(nóng)藥檢測結(jié)果 單位：μg/kg

3 討論

GC-MS/MS法具有靈敏度好、準(zhǔn)確度高,定性性能強等優(yōu)點,能夠?qū)崿F(xiàn)多種農(nóng)藥殘留的高通量快速檢測。本文采用GC-MS/MS法檢測生鮮肉中18種OPPs殘留,所有檢測目標(biāo)物分離良好,重現(xiàn)性好,并基于優(yōu)化的QuEChERS法進行樣品前處理,可有效降低畜禽肉中脂肪、蛋白質(zhì)及色素等基質(zhì)干擾,提高目標(biāo)物回收率,其中豬肉、羊肉因脂肪含量高,基質(zhì)效應(yīng)強,其回收率略低于其他肉類。

本研究建立了一種QuEChERS結(jié)合GC-MS/MS檢測生鮮肉中18種OPPs殘留的分析方法。18種OPPs的檢出限可達0.02～0.74 μg/kg,定量限0.08～2.48 μg/kg,均低于文獻[24-26]的報道。低、中、高3個濃度水平的加標(biāo)回收率在76%～106%,RSD為0.50%～7.9%,方法的回收率和精密度符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》對回收率和精密度的要求。該方法在實際應(yīng)用中簡單、快速、高效,可滿足生鮮肉中18種OPPs殘留的高通量快速檢測,對加強生鮮肉在整個流通環(huán)節(jié)的追蹤和監(jiān)控以及保障我國食品安全具有重大意義。