許繼業(yè),郁萬文*,曹福亮,2,汪貴斌

1(南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京,210037)2(江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái),江蘇 南京,210014)

銀杏葉提取物具有抗氧化、抗疲勞、降血脂、降血壓、增強(qiáng)免疫力、提高缺氧耐受力、抗腫瘤、改善老年人記憶力和心血管疾病等藥理作用[1],而抗氧化能力是體現(xiàn)其功能活性的一類重要指標(biāo)。銀杏葉提取物可直接清除脂質(zhì)自由基、脂質(zhì)過氧化自由基和烷自由基等,終止自由基連鎖反應(yīng),同時(shí)還參與調(diào)節(jié)和提高過氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等的活性。研究表明,許多黃酮類物質(zhì)的抗氧化活性超過維生素C,在體外可抗自由基攻擊[2]。植物體內(nèi)化學(xué)成分較多,且不同個(gè)體間差異較大。有研究表明,不同品種藍(lán)莓的提取液功能成分、抗氧化能力差異顯著[3]。此外,植物提取物同時(shí)包含多種功能成分,且各物質(zhì)間具有一定的互作效應(yīng)[4]。銀杏葉中成分復(fù)雜,主要生物活性成分有類黃酮、萜內(nèi)酯、多糖、原花青素等,其品質(zhì)無法用單一成分量化和直接反映。銀杏葉中的類黃酮、多糖、原花青素等均具有相當(dāng)?shù)目寡趸钚?。DPPH自由基測定快速、簡便,氧自由基吸收能力法(oxygen radical absorbance capacity,ORAC)具有很高的特異性和良好的結(jié)果重現(xiàn)性,是目前國內(nèi)外評價(jià)天然產(chǎn)物抗氧化活性的2種主要方法,但這2種方法都不能全面、準(zhǔn)確地反映天然產(chǎn)物的總抗氧化能力。目前,已有大量關(guān)于葉用銀杏優(yōu)良種質(zhì)選育的報(bào)道[5-10],但基于高抗氧化的葉用銀杏種質(zhì)的篩選還未見報(bào)道。本研究選用4種方法測評23個(gè)銀杏雄株葉提取液的抗氧化能力,同時(shí)測定提取液中功能性組分含量,分析兩者的株間差異和相關(guān)性,篩選出高抗氧化能力的雄株,為高抗氧化銀杏種質(zhì)資源的篩選提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試銀杏葉采自南京林業(yè)大學(xué)資源圃中移栽定植15年的23棵25年生銀杏雄株,于2020年4月1日采集樹冠外圍向陽葉片,裝于信封,烘箱內(nèi)105 ℃殺青15 min,調(diào)至60 ℃烘至恒重,粉碎過80目篩后備用。

1.2 儀器與試劑

Synergy2酶標(biāo)儀,美國伯騰儀器有限公司；JP-100ST超聲波水浴鍋,潔盟清洗設(shè)備有限公司；JK-WB-8A水浴鍋,上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司；藥品均為分析純;水為超純水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 甲醇提取液制備

稱取葉干粉1.000 g,包于直徑12.5 cm的濾紙中,用脫脂棉線捆綁成柱狀濾紙包。先用100 mL石油醚于85 ℃水浴條件下在索氏提取器中對濾紙包除雜2.5 h,取出后于60 ℃烘箱中烘至恒重。再將除雜后的濾紙包用100 mL分析純甲醇于80 ℃水浴條件下索氏提取4.5 h。減壓濃縮后,殘?jiān)梅治黾状级ㄈ葜?5 mL,即得供試樣品提取液。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3.2 抗氧化能力測定

DPPH自由基清除率的測定參考姜愛麗等[3]的方法,吸取0.2 mL提取液與4 mL DPPH-乙醇溶液(0.04 mg/mL)于10 mL比色管,充分混勻,室溫避光靜置30 min后,于517 nm下測定吸光值A(chǔ)樣品。為扣除提取液底色的影響,以等量無水乙醇代替DPPH-乙醇溶液測定吸光值A(chǔ)對照,以等量無水乙醇代替提取液測定吸光值A(chǔ)空白,每個(gè)樣品重復(fù)3次。DPPH自由基清除率按公式(1)計(jì)算:

(1)

·OH清除率的測定參考姚鑫[11]的方法,吸取1 mL FeSO4·7H2O(2.25 mmol/L)置于10 mL離心管,然后加入1 mL水楊酸溶液(2.25 mmol/L),再加入1 mL提取液,最后加入1 mL H2O2(2.2 mmol/L)啟動(dòng)反應(yīng),混勻,37 ℃水浴30 min,在536 nm處測定吸光值A(chǔ)樣品。為扣除提取液底色的影響,以蒸餾水代替雙氧水測定吸光值A(chǔ)對照；以蒸餾水代替樣品提取液測定吸光值A(chǔ)空白,每個(gè)樣品重復(fù)3次?！H清除率按公式(2)計(jì)算:

(2)

(3)

總還原力的測定參考姚鑫[11]的方法,吸取0.3 mL提取液于10 mL試管中,然后加入3 mL FRAP工作液,充分混勻后,37 ℃水浴避光10 min,在593 nm處測定吸光值。以甲醇替代樣品作為空白,每個(gè)樣品重復(fù)3次。以FeSO4·7H2O為標(biāo)準(zhǔn)物,配成不同濃度的FeSO4·7H2O溶液,采用同樣的方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(y吸光值=1.094 2x+0.072 7,r=999 8),計(jì)算總還原力。樣品測定的吸光值代入曲線方程,解得的x值即為樣品總還原力,即以達(dá)到同樣的抗氧化能力時(shí),所需的FeSO4·7H2O物質(zhì)的量。

1.3.3 功能成分含量測定

總黃酮含量的測定參考符群等[4]的方法，吸取提取液1.0 mL和5 mL 30%乙醇(體積分?jǐn)?shù)，下同)置于10 mL離心管中，然后加入0.3 mL 50 g/L的NaNO2溶液，搖勻靜置5 min，然后加入0.3 mL 100 g/L Al(NO3)3溶液，搖勻靜置6 min，再加入2 mL 1 mol/L 的NaOH溶液并用30%乙醇定容至刻度,搖勻靜置10 min,于510 nm處測吸光值。以30%乙醇溶液替代樣品作為空白,每樣品重復(fù)3次。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)物,用甲醇配成不同濃度的蘆丁溶液,采用同樣的方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(y吸光值=1.330 1x蘆丁+0.010 6,r=0.999 6),計(jì)算總黃酮含量。

萜內(nèi)酯含量的測定參考張渝陽等[13]的方法,吸取提取液1.0 mL置于10 mL離心管,加入0.4 mL堿性羥胺溶液[V(139 g/L氯化羥胺)∶V(3.5 mol/L NaOH)=1∶2],混勻,5 min后加入0.4 mL 3 mol/L 鹽酸,0.2 mL 60 g/L FeCl3·6H2O溶液,混勻,加入5 mL 70%乙醇,混勻,于517 nm處測吸光值,每個(gè)樣品重復(fù)3次。以銀杏內(nèi)酯A對照品為標(biāo)準(zhǔn)物,用甲醇配成不同濃度的銀杏內(nèi)酯A溶液,采用同樣的方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(y吸光值=12.346x銀杏內(nèi)酯A+0.021,r=0.999 4),計(jì)算萜內(nèi)酯含量。

多糖含量的測定參考姜愛麗等[3]的方法,吸取1 mL稀釋20倍的提取液,置于10 mL離心管,加入1 mL 5% 苯酚溶液,搖勻,室溫靜置5 min,然后緩緩加入5 mL濃硫酸,搖勻,40 ℃水浴15 min,于490 nm處測定吸光值。每一樣品重復(fù)3次。以D-葡萄糖(純度≥99%)為標(biāo)準(zhǔn)物,配成0、0.05、0.1、0.15、0.2 mg/mL葡萄糖溶液,采用同樣的方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(y吸光值=4.082 5xD-葡萄糖+0.041 7,r=0.999),計(jì)算多糖含量。

原花青素含量的測定參考喬洪翔等[14]的方法,吸取提取液1.0 mL置于10 mL離心管,加入5 mL顯色劑[將20 g/L香草醛溶液(無水乙醇溶解)和體積分?jǐn)?shù)20%鹽酸(無水乙醇定容)等體積混勻],30 ℃下水浴8 min,于496 nm處測吸光值,每個(gè)樣品重復(fù)3次。以原花青素對照品為標(biāo)準(zhǔn)物,用80%乙醇配成不同濃度的原花青素溶液,采用同樣的方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(y吸光值=0.294 1x原花青素+0.040 5,r=0.999 1),計(jì)算原花青素含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,使用DPS7.04進(jìn)行方差分析、Duncan多重比較、相關(guān)性分析和聚類分析。

2 結(jié)果分析

2.1 不同銀杏雄株葉提取液抗氧化能力比較

表1 銀杏葉提取液抗氧化能力的株間差異分析

2.2 不同銀杏雄株葉提取液功能性組分含量比較

由方差分析和多重比較可知,銀杏雄株葉提取液的總黃酮、萜內(nèi)酯、多糖、原花青素含量在單株間均存在極顯著差異(P<0.01),對應(yīng)功能性組分含量的變異系數(shù)分別為12.10%、9.30%、12.35%和15.63%,對應(yīng)功能成分指標(biāo)最高單株分別是最低單株的1.74、1.46、1.57、1.78倍(表2),表現(xiàn)出一定的變異性?？傸S酮含量高于均值的單株有12個(gè),由高到低依次為6#、16#、11#、2#、12#、9#、10#、21#、1#、3#、15#、5#；萜內(nèi)酯含量高于均值的單株有11個(gè),由高到低依次為21#、3#、22#、11#、23#、20#、9#、10#、2#、16#、17#；多糖含量高于均值的單株有9個(gè),由高到低依次為20#、9#、22#、11#、13#、21#、23#、17#、1#；原花青素含量高于均值的單株有12個(gè),由高到低依次為19#、17#、2#、18#、1#、23#、11#、9#、20#、22#、12#、21#。

表2 銀杏葉提取液功能性組分含量的株間差異分析 單位：mg/g DW

2.3 提取液抗氧化能力與功能性組分含量的相關(guān)分析

表3 功能性組分含量與抗氧化能力的相關(guān)性分析

2.4 基于提取液抗氧化能力與功能性組分含量的聚類分析

圖1 基于提取液抗氧化能力與功能性組分含量的聚類分析

表4 各類群的抗氧化能力與功能性組分含量

3 結(jié)論與討論