馬倩,趙晨陽,吳振,陳嘉,葉發(fā)銀,趙國華,3*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,重慶,400715)2(重慶市中藥研究院,中藥健康學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶,400065)3(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心,重慶,400715)

兩親性聚合物的疏水鏈段能通過疏水作用力形成一個(gè)疏水性內(nèi)核,其親水鏈段在水性介質(zhì)中能自組裝成親水性外殼,形成的核-殼結(jié)構(gòu)膠束對(duì)脂溶性成分具有良好的增溶作用、靶向遞送、生物利用率提高和穩(wěn)態(tài)化作用,為難溶性抗癌活性化合物和食品脂溶性成分的高效利用提供優(yōu)異載體[1-2]。完全合成的兩親性嵌段共聚物在水溶液中能夠形成規(guī)則的核殼膠束,受到廣泛關(guān)注,但出于安全性考慮,其在食品中的應(yīng)用受到限制。經(jīng)過適度疏水改性的兩親性多糖基聚合物具有良好的自組裝能力、可降解性、生物相容性和安全性,但與完全合成的嵌段共聚物不同,疏水化多糖形成的膠束結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜(圖1-a),容易受到制備方法、自身結(jié)構(gòu)因子、外界環(huán)境條件及共存組分的影響[3-6]。更為重要的是,兩親性聚合物在其自聚集過程中單體分子與膠束處于熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)平衡狀態(tài)[7],因此,在聚合物膠束的應(yīng)用過程中食品組分及其所處環(huán)境條件極易影響其穩(wěn)定性。但目前關(guān)于制備方法、結(jié)構(gòu)因子、環(huán)境條件及共存組分對(duì)聚合物膠束的影響主要集中于pH敏感型和熱敏性聚合物膠束[8-9],而關(guān)于食品組分及加工條件對(duì)疏水化多糖膠束穩(wěn)定性影響的研究較少。

辛烯基琥珀酸酐(octenyl succinic anhydride,OSA)作為常用的親脂性酯化劑,常用于多糖進(jìn)行疏水化改性,合成的OSA多糖能夠作為食品脂溶性成分封裝壁材、乳化劑、抗菌或可食膜材料、功能性食品配料[10-13],其中辛烯基琥珀酸燕麥β-葡聚糖酯(octenylsuccinated oat β-glucan,OSβG)所形成的核殼膠束能夠增溶、靶向遞送和控釋食品脂溶性成分(如β-胡蘿卜素等)[14]；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),糖鏈內(nèi)部結(jié)構(gòu)因子(如分子質(zhì)量、取代度)[15]、環(huán)境因子(如溫度和pH)[3]均會(huì)影響其自聚集,但關(guān)于食品組分的影響規(guī)律尚不清楚。此外,食品組分可能會(huì)對(duì)聚合物膠束帶來積極或消極的影響。已有研究發(fā)現(xiàn)氨基酸[16]、肽[17]、蛋白質(zhì)[18]、多糖[19]和無機(jī)鹽[16]等會(huì)影響表面活性劑的自聚集特性,主要取決于它們的性質(zhì)、濃度和環(huán)境條件等。

氨基酸作為蛋白質(zhì)的組成單元,也是具有酸堿性、親疏水性及極性等多重性質(zhì)的重要食品組分之一,在不同pH條件下氨基酸電離情況各異,根據(jù)環(huán)境pH條件,可電離出陰離子、雙陰離子、陽離子、雙陽離子和兩性離子等,特別是多氨基或多羧基的酸性或堿性氨基酸就更加復(fù)雜。研究氨基酸對(duì)不同pH條件下OSβG自聚集行為的影響,對(duì)其在具體真實(shí)食品體系中的應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。鑒于OSβG自聚集行為主要與其親/疏水性和所帶的負(fù)電荷密度有很大關(guān)系,推測(cè)不同酸堿性和親疏水性的氨基酸對(duì)OSβG自聚集行為有不同的影響?；诖诉x擇了酸性(谷氨酸)、中性(異亮氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和絲氨酸)和堿性氨基酸(賴氨酸)；同時(shí),這7種氨基酸可劃分為親水性(谷氨酸、賴氨酸和絲氨酸)和疏水性(異亮氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和丙氨酸)氨基酸2組(根據(jù)Eisenberg疏水值)[20]。本文以這7種氨基酸(分子結(jié)構(gòu)見圖1-b)作為食品氨基酸的代表,通過研究不同pH(3、6、10)條件下7種氨基酸對(duì)OSβG臨界膠束濃度(critical micelle concentration,CMC)、OSβG膠束的粒徑、多分散系數(shù)(polydispersity index,PDI)和Zeta電位的影響；進(jìn)一步評(píng)價(jià)了其中的5種中性氨基酸(異亮氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和絲氨酸)在pH 6時(shí)對(duì)荷載姜黃素OSβG膠束的影響,旨在揭示食品組分氨基酸與其所處pH條件對(duì)OSβG自聚集行為的影響,為構(gòu)建兩親性多糖膠束的穩(wěn)定化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

a-膠束結(jié)構(gòu)示意圖；b-7種氨基酸的分子結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕麥β-葡聚糖(食品級(jí),純度80%,分子質(zhì)量1.68×105g/mol),張家口一康生物科技有限公司；2-辛烯基琥珀酸酐(2-OSA,97%)、芘(光譜純),美國Sigma-Aldrich公司；谷氨酸(Glu)、賴氨酸(Lys)、異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、半胱氨酸(Cys)、丙氨酸(Ala)、絲氨酸(Ser)、姜黃素,上海Adamas試劑有限公司；異丙醇、NaOH(分析純),成都市科龍化工試劑廠；鹽酸、乙醇(分析純),重慶川東化工(集團(tuán))有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA323S電子分析天平,賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；H01-1D數(shù)顯恒溫磁力攪拌器,上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；FE28 pH計(jì),METTLER-TOLEDO儀器有限公司；GL-16G高速離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠；T25高速分散機(jī),德國IKA儀器設(shè)備有限公司；Zetasizer Nano ZS馬爾文激光粒度儀,英國Malvern儀器有限公司；F-2500熒光分光光度計(jì),日本株式會(huì)社日立制作所。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 OSβG及其自聚集膠束的制備方法

OSβG的制備方法及其結(jié)構(gòu)特性參見本課題組前期的研究[15]。將燕麥β-葡聚糖于純水中(1.25 mg/mL),在80 ℃下攪拌2 h使其完全溶解,冷卻后離心(3 000×g,10 min),向上清液中加入OSA,持續(xù)加入30 g/L NaOH,使pH維持在8～10,反應(yīng)結(jié)束后,滴加2 mol/L HCl使溶液pH為6.5,再加入4倍異丙醇使之沉淀(65 ℃、6 h),離心(5 000×g,10 min),將獲得的沉淀物溶于蒸餾水中,透析(MD44-14透析袋,分子截流量14 kg/mol,Union Carbide Co)24 h,冷凍干燥,即得OSβG(取代度為0.018)。將0.05 g OSβG分散于20 mL純水中,加熱至沸騰2 min、使之完全溶解,冷卻后補(bǔ)充體積至20 mL,室溫下磁力攪拌24 h,即得OSβG膠束。

1.3.2 不同pH條件下OSβG膠束與氨基酸混合體系的制備方法

采用30 g/L NaOH和2 mol/L HCl溶液調(diào)整氨基酸溶液和OSβG膠束溶液至相同的pH(3、6或10),向OSβG膠束溶液中加入一定量的相同pH不同種類的氨基酸溶液使得二者混合溶液中氨基酸的最終濃度為0.01 mol/L,在室溫條件下攪拌3 h使兩者充分混合,得到不同pH條件下的OSβG膠束與氨基酸混合體系,立即測(cè)定。

1.3.3 荷載姜黃素OSβG膠束的制備方法

向適量OSβG膠束中添加10 mg姜黃素粉末,采用高速分散器處理2 min(12 000 r/min),將分散液在室溫下攪拌24 h,3 000 r/min離心10 min,向收集的上清液中加入氨基酸,使最終體系中氨基酸濃度為0.1 mol/L,渦旋振蕩器處理2 min后立即測(cè)定。

1.3.4 臨界膠束濃度的測(cè)定

采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定芘標(biāo)記OSβG溶液的熒光光譜,首先配制一系列濃度的OSβG與氨基酸混合溶液(OSβG質(zhì)量濃度分別為1.2、0.6、0.3、0.15、0.075、0.002 5、0.007 5和0.000 75 mg/mL),調(diào)其pH值分別為3、6和10,將適量芘甲醇溶液(0.2 mmol/L)加入到10 mL離心管,氮吹使甲醇完全揮發(fā),向其中加入10 mL OSβG與氨基酸混合溶液使最終芘的濃度為0.6 μmol/L,在室溫條件下攪拌3 h后測(cè)定。測(cè)定條件：激發(fā)波長(zhǎng)335 nm,發(fā)射和激發(fā)狹縫均為2.5 nm,收集波長(zhǎng)為360～460 nm,以芘第一、第三吸收峰熒光強(qiáng)度的比值(I1/I3)與OSβG濃度的對(duì)數(shù)(lgC)作圖,經(jīng)過分段線性擬合求出各條件下OSβG的CMC值。

1.3.5 粒徑、多分散系數(shù)和表面電荷的測(cè)定

采用馬爾文激光粒度儀測(cè)定,測(cè)試條件為氬離子激光器,波長(zhǎng)633 nm,溫度25 ℃,散射角為90°,測(cè)定OSβG及其與氨基酸混合溶液的粒徑、PDI和Zeta電位。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示(n=3)。使用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,采用Tukey’s HSD進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH條件下氨基酸對(duì)OSβG的CMC的影響

合成的OSβG交聯(lián)物及其自聚集膠束的結(jié)構(gòu)特性前期已經(jīng)研究清楚[15],但當(dāng)其應(yīng)用于食品體系時(shí),不可避免會(huì)受到食品加工條件及共存組分的沖擊,以氨基酸作為食品組分代表物,研究氨基酸及其所處環(huán)境條件對(duì)OSβG的影響,具有實(shí)際意義。通常氨基酸的解離程度與溶液pH密切相關(guān),在等電點(diǎn)(pI)時(shí),氨基酸解離程度最小[21],明確不同pH條件下氨基酸的解離程度對(duì)解析其影響OSβG自聚集行為至關(guān)重要。因此,選擇3個(gè)pH體系(3、6和10)。pH 3時(shí)谷氨酸解離程度最小,pH 6時(shí),除具有酸堿性質(zhì)的氨基酸外,各中性氨基酸均表現(xiàn)出最低解離程度,pH 10時(shí)賴氨酸有最小的解離度。不同pH條件下氨基酸對(duì)OSβG的CMC的影響見圖2。

圖2 不同pH條件下氨基酸對(duì)OSβG的CMC的影響

在強(qiáng)酸性條件下,由于OSβG分子的辛烯基琥珀酸鏈羧基完全質(zhì)子化,導(dǎo)致缺乏靜電斥力,使OSβG膠束的疏水核結(jié)構(gòu)緊密堆積,芘分子更易滲透到膠束疏水核中,此時(shí)氨基酸對(duì)OSβG膠束化影響較小,導(dǎo)致pH 3時(shí)氨基酸對(duì)其CMC影響很小[22]。但pH 6時(shí),各條件下CMC均增加,主要?dú)w功于OSβG分子的辛烯基琥珀酸鏈羧基逐漸去質(zhì)子化,此時(shí)質(zhì)子化和脫質(zhì)子化的OSβG分子共存,靜電斥力增強(qiáng),導(dǎo)致OSβG膠束疏水核松散,使?jié)B透到疏水區(qū)域的芘分子難以穩(wěn)定存在,導(dǎo)致氨基酸對(duì)其CMC影響較大；當(dāng)pH 10時(shí)OSβG分子的辛烯基琥珀酸鏈羧基完全脫質(zhì)子化,靜電斥力進(jìn)一步增強(qiáng),導(dǎo)致CMC進(jìn)一步增加。在相同pH條件下,與對(duì)照組和酸性氨基酸組相比,堿性賴氨酸使OSβG的CMC呈現(xiàn)不同程度的增加趨勢(shì),說明具有酸堿性的氨基酸對(duì)OSβG的CMC的影響,與其環(huán)境pH密切相關(guān)。4種疏水性氨基酸的疏水性大小順序?yàn)椋寒惲涟彼?苯丙氨酸>半胱氨酸>丙氨酸,結(jié)果說明它們對(duì)OSβG的CMC的影響與其親/疏水性并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,說明氨基酸對(duì)OSβG的CMC影響行為較為復(fù)雜。HE等[23]研究了堿性氨基酸對(duì)脫氧膽酸鈉CMC的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),影響效果取決于氨基酸側(cè)鏈所帶的電荷,主要受靜電和疏水相互作用控制?？傊?結(jié)果說明pH主要通過質(zhì)子化作用,氨基酸主要通過與OSβG的糖鏈形成氫鍵、與OSβG的OSA鏈形成靜電斥力,二者協(xié)同影響OSβG的自聚集。

2.2 不同pH條件下氨基酸對(duì)OSβG膠束粒徑和PDI的影響

如圖3所示,當(dāng)溶液pH=3時(shí),氨基酸對(duì)OSβG膠束粒徑影響很小,根本原因在于其OSA鏈羧基完全質(zhì)子化,導(dǎo)致OSβG膠束收縮、粒徑減小[24],此時(shí)氨基酸的影響可忽略；且pH=3時(shí)PDI均小于0.2(圖4),說明此時(shí)OSβG膠束分散均勻。pH=6時(shí),與未添加氨基酸的OSβG膠束相比,添加氨基酸的各組OSβG膠束粒徑均減小,可能是氨基酸通過與OSβG膠束的糖鏈形成氫鍵、與OSA鏈形成疏水作用力,導(dǎo)致膠束收縮重排、PDI增加。pH=10時(shí),氨基酸和OSβG分子均發(fā)生脫質(zhì)子化,體系靜電斥力增強(qiáng),導(dǎo)致OSβG膠束發(fā)生重排,且不同氨基酸在pH 10條件下的電荷密度不同,導(dǎo)致了OSβG膠束粒徑和PDI差異,其中此時(shí)堿性賴氨酸組的粒徑最大。

圖3 不同pH條件下氨基酸對(duì)OSβG膠束粒徑的影響

圖4 不同pH條件下氨基酸對(duì)OSβG膠束PDI的影響

結(jié)果進(jìn)一步說明：(1)不同種類的氨基酸對(duì)OSβG膠束結(jié)構(gòu)的影響主要原因?yàn)閜H對(duì)氨基酸側(cè)鏈和OSβG羧基的解離作用,最終取決于分子間作用力的改變；(2)對(duì)于5種中性氨基酸而言,pH=3時(shí)其粒徑無顯著差異(除異亮氨酸外),pH=6和pH=10時(shí)異亮氨酸和苯丙氨酸組的粒徑略大于其他3組,可能原因在于不同氨基酸的親疏水性及其側(cè)鏈鏈長(zhǎng)差異導(dǎo)致。

2.3 不同pH條件下氨基酸對(duì)OSβG膠束Zeta電位的影響

Zeta電位常用于反映膠束的微結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性[25]。為了進(jìn)一步研究氨基酸對(duì)OSβG膠束的結(jié)構(gòu)及其作用力的影響,測(cè)定了不同pH條件下氨基酸對(duì)OSβG膠束Zeta電位的影響,結(jié)果見圖5。在所測(cè)試范圍內(nèi),所有樣品的Zeta電位均為負(fù)值。當(dāng)氨基酸與OSβG膠束混合溶液pH為3時(shí),氨基酸種類對(duì)OSβG膠束Zeta電位影響較小,主要是由于氨基酸與OSβG均質(zhì)子化,降低了電荷密度,OSβG膠束的凈電荷銳減,導(dǎo)致氨基酸對(duì)OSβG膠束的表面電荷影響較小[26]。當(dāng)溶液pH=6時(shí),此時(shí)pH接近中性氨基酸和OSβG膠束的解離常數(shù)pKa,此時(shí)溶液中性氨基酸解離程度相對(duì)較低,質(zhì)子化與脫質(zhì)子化OSβG分子共存,導(dǎo)致此時(shí)OSβG膠束Zeta電位主要受pH對(duì)氨基酸解離程度的影響和支配。

圖5 不同pH條件下氨基酸對(duì)OSβG膠束Zeta電位的影響

當(dāng)pH=10時(shí),OSβG膠束的OSA鏈羧基全部脫質(zhì)子化、帶上大量負(fù)電荷,與此同時(shí)氨基酸根據(jù)其pKa值發(fā)生了不同程度的解離,且氨基酸分子側(cè)鏈R基團(tuán)的帶電情況不同,使得不同種類氨基酸與OSβG分子接觸的有效分子數(shù)不同,導(dǎo)致凈電荷增加[27-28]?？傊?不同pH條件下氨基酸對(duì)OSβG膠束Zeta電位的影響主要取決于二者電荷密度與解離狀態(tài)及分子之間的靜電斥力。

2.4 中性氨基酸對(duì)pH 6時(shí)荷載姜黃素OSβG膠束的粒徑、PDI和表面電荷的影響

為了進(jìn)一步對(duì)比氨基酸極性對(duì)OSβG膠束荷載能力的影響,考慮到OSβG的自聚集驅(qū)動(dòng)力主要來自其辛烯基琥珀?；g的疏水相互作用,因此選擇了4種疏水性氨基酸(異亮氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和丙氨酸)和1種親水性氨基酸(絲氨酸,作為對(duì)照),而酸性氨基酸和堿性氨基酸相對(duì)于中性氨基酸而言極性差異過大,因此沒有選擇。以脂溶性成分姜黃素作為被荷載目標(biāo)物質(zhì),這5種中性氨基酸在pH=6和室溫時(shí)對(duì)荷載姜黃素OSβG膠束的影響,結(jié)果見圖6。與未添加氨基酸組相比,添加半胱氨酸、丙氨酸和絲氨酸使荷載姜黃素OSβG膠束粒徑略有降低,添加異亮氨酸和苯丙氨酸均導(dǎo)致荷載姜黃素OSβG膠束粒徑增加；添加半胱氨酸、丙氨酸和絲氨酸導(dǎo)致荷載姜黃素OSβG膠束的PDI和Zeta電位均增加,而添加異亮氨酸和苯丙氨酸導(dǎo)致荷載姜黃素OSβG膠束的PDI和Zeta電位呈現(xiàn)出與上述情況相反的變化趨勢(shì)。前期研究發(fā)現(xiàn),荷載姜黃素使OSβG膠束粒徑減小[29],這5種中性氨基酸對(duì)荷載姜黃素OSβG膠束粒徑的影響可能與氨基酸影響OSβG膠束親疏水鏈的分布和定位有關(guān)。這說明通過添加氨基酸能夠在一定程度上影響荷載膠束的結(jié)構(gòu),添加異亮氨酸和苯丙氨酸均導(dǎo)致荷載膠束粒徑增加、PDI減少,這可能與異亮氨酸和苯丙氨酸導(dǎo)致更多OSβG的羧基基團(tuán)裸露,使荷載膠束的凈電荷增加(即Zeta電位絕對(duì)值增加)；而半胱氨酸、丙氨酸和絲氨酸導(dǎo)致荷載膠束粒徑收縮,導(dǎo)致羧基被屏蔽,凈電荷減少。結(jié)果說明,這5種中性氨基酸的親/疏水性并非其影響和決定荷載姜黃素OSβG膠束特性的唯一因素,還可能與其側(cè)鏈鏈長(zhǎng)、極性、所帶電荷密度等均有關(guān)。OSβG膠束對(duì)目標(biāo)疏水物質(zhì)的增溶是一個(gè)較為緩慢的過程,伴隨著其疏水鏈的取向和定位變化[30],氨基酸可能是通過誘導(dǎo)荷載姜黃素OSβG膠束親疏水鏈的重排、聚集等進(jìn)一步影響體系的均勻性和穩(wěn)定性。由于試驗(yàn)中采用先形成荷載姜黃素OSβG膠束,而后再加入氨基酸進(jìn)行影響和干擾,氨基酸作為被荷載物質(zhì)的可能性也存在,但其在荷載姜黃素OSβG膠束的位置及分布規(guī)律還需要進(jìn)一步深入研究?？傊?該研究一方面明確了氨基酸對(duì)OSβG自聚集的影響規(guī)律,另一方面揭示了通過改變氨基酸種類及其所處環(huán)境條件調(diào)控OSβG自聚集行為及其特性的可行性。

a-膠束粒徑；b-PDI；c-Zeta電位

3 結(jié)論

研究了不同pH(3、6、10)條件下氨基酸對(duì)OSβG自聚集行為的影響,通過測(cè)定OSβG的CMC、OSβG膠束的粒徑、PDI和Zeta電位等參數(shù),揭示了7種氨基酸及其所處pH條件對(duì)OSβG膠束形成的影響規(guī)律及其分子本質(zhì),進(jìn)一步明確了其中5種中性氨基酸對(duì)荷載姜黃素OSβG膠束的影響。結(jié)果表明：(1)隨著pH升高,各氨基酸存在條件下OSβG的CMC、OSβG膠束的粒徑和凈電荷均呈現(xiàn)增大趨勢(shì),主要原因在于pH通過影響氨基酸側(cè)鏈和OSβG分子辛烯基琥珀酸鏈羧基的質(zhì)子化與脫質(zhì)子化程度,進(jìn)一步導(dǎo)致OSβG膠束及其與氨基酸側(cè)鏈間的分子間作用力(如氫鍵、靜電斥力和疏水相互作用)的變化,實(shí)現(xiàn)對(duì)OSβG膠束上述指標(biāo)的調(diào)控,即堿性環(huán)境介質(zhì)在很大程度上阻礙其膠束化,而酸性介質(zhì)則會(huì)促進(jìn)其膠束化；(2)與未添加氨基酸相比,添加半胱氨酸、丙氨酸和絲氨酸使荷載姜黃素OSβG膠束粒徑略有降低,添加異亮氨酸和苯丙氨酸均導(dǎo)致荷載姜黃素OSβG膠束粒徑增加；添加半胱氨酸、丙氨酸和絲氨酸導(dǎo)致荷載姜黃素OSβG膠束的PDI和Zeta電位均增加,而添加異亮氨酸和苯丙氨酸導(dǎo)致荷載姜黃素OSβG膠束的PDI和Zeta電位呈現(xiàn)出與上述情況相反的變化趨勢(shì),這5種中性氨基酸的親/疏水性并非其影響和決定荷載姜黃素OSβG膠束特性的唯一因素,還可能與其側(cè)鏈鏈長(zhǎng)和極性等性質(zhì)有關(guān)?？傊?選擇氨基酸作為食品組分代表物,研究其在不同pH條件下對(duì)OSβG自聚集行為的影響及其本質(zhì)規(guī)律,旨在揭示氨基酸對(duì)OSβG自聚集膠束形成的促進(jìn)或阻礙效應(yīng),為構(gòu)建穩(wěn)態(tài)和可調(diào)控的OSβG膠束提供新的視角。