劉洋,瞿恒賢,張龍飛,李啟明,陳大衛(wèi),顧瑞霞*

1(揚(yáng)州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院 江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 揚(yáng)州,225127)2(新希望乳業(yè)股份有限公司,四川 成都,610023)

益生菌是對(duì)宿主有益的活的微生物,其可以降低血清膽固醇、改善腸道健康、預(yù)防各種癌癥、促進(jìn)免疫反應(yīng)和改善認(rèn)知障礙[1-3]。益生菌通過黏附腸上皮細(xì)胞在腸道定植從而抑制腸道有害菌,改善腸道微生態(tài)平衡,進(jìn)而改善胃腸道的生理平衡,以此對(duì)宿主產(chǎn)生有益作用[4]。乳酸菌的抗氧化等重要生物學(xué)功能在保障食品質(zhì)量、提高食品品質(zhì)方面具有重要作用[5-8]。發(fā)酵乳是益生菌最好的載體,功能性益生菌發(fā)酵乳的研究開發(fā)一直受到廣泛關(guān)注[9]。

功能性低聚糖是由3～10個(gè)單位的不同聚合程度的單體組成的簡(jiǎn)單碳水化合物和可溶性膳食纖維[10]。菊粉、低聚果糖和低聚半乳糖是被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中的功能性低聚糖[11-12]。低聚糖對(duì)益生菌的生長(zhǎng)具有增殖作用,楊健等[13]研究了4種低聚糖對(duì)乳酸菌體外增殖過程的影響,發(fā)現(xiàn)低聚果糖對(duì)干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌的增殖效果最好。李雅麗等[14]研究了6種低聚糖對(duì)腸道益生菌生長(zhǎng)情況以及代謝產(chǎn)物的影響,發(fā)現(xiàn)其對(duì)各益生菌的促生長(zhǎng)和促產(chǎn)酸能力不同,以水蘇糖和低聚半乳糖的效果最為顯著。但低聚糖對(duì)益生菌發(fā)酵乳功能特性的影響研究鮮有報(bào)道。

為了凸顯益生元發(fā)酵乳的益生性,應(yīng)該和含有益生菌的發(fā)酵乳結(jié)合,從而構(gòu)建益生元、益生菌、發(fā)酵乳三者的協(xié)同關(guān)系[15]。本文選取菊粉、低聚果糖和低聚半乳糖與實(shí)驗(yàn)室篩選得到的具有優(yōu)良功能特性的3株益生菌進(jìn)行合生元組合實(shí)驗(yàn),制備合生元發(fā)酵乳,探究低聚糖對(duì)益生菌發(fā)酵乳活菌數(shù)、pH、酸度、總抗氧化能力和黏附能力的影響,并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)性分析,旨在探討不同低聚糖對(duì)益生菌發(fā)酵乳功能特性的影響及其之間的相關(guān)性,為功能性合生元發(fā)酵乳的開發(fā)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)菌株：鼠李糖乳桿菌LV108、鼠李糖乳桿菌 Hsryfm 1301、發(fā)酵乳桿菌DALI 02,揚(yáng)州大學(xué)江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

原料：全脂乳粉、脫脂乳粉,新西蘭威士蘭乳業(yè)公司；菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖、蔗糖,上海昊岳食品科技有限公司；乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸,均為色譜純,德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；MEM培養(yǎng)液、MEM非必需氨基酸溶液、丙酮酸鈉溶液、GlutaMAX谷氨酰胺添加劑,美國(guó)Gibco公司;0.25%胰酶細(xì)胞消化液、PBS,上海碧云天生物技術(shù)公司。

培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基：液體用于菌種的活化,固體用于活菌計(jì)數(shù)；益生元選擇培養(yǎng)基：分別用菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖替換MRS中的葡萄糖,121 ℃,15 min滅菌冷卻后備用,用于菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定；益生元增殖培養(yǎng)基：120 g/L全脂乳粉,60 g/L蔗糖復(fù)配過篩均質(zhì)后分別添加20 g/L菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖,105 ℃,5 min 滅菌冷卻后備用,用于菌株增殖及功能測(cè)定；MEM培養(yǎng)基：77%(體積分?jǐn)?shù),下同)MEM、20% 優(yōu)質(zhì)胎牛血清、1% MEM非必需氨基酸溶液、1%丙酮酸鈉溶液、1% GlutaMAX谷氨酰胺添加劑,4 ℃貯藏備用,用于Caco-2細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

JF-SX-500全自動(dòng)滅菌鍋,日本TOMYG公司；超凈工作臺(tái)SW-CJ-1F,蘇州凈化設(shè)備有限公司；高壓均質(zhì)機(jī)GYB 60-08,上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠；7890 A-7697 A氣相色譜儀,美國(guó)Agilent公司；5804 R型高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司；生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀,Bioscreen C；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀IC 1000,上海睿鈺生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 益生菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

分別以菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖作為單一碳源代替MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖。將實(shí)驗(yàn)菌株以3%接種量分別接種3種不同低聚糖為碳源的培養(yǎng)基中在自動(dòng)生長(zhǎng)曲線儀中37 ℃培養(yǎng)48 h。以菌液的OD600值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 益生菌發(fā)酵乳的制備

復(fù)配乳經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后,60 g/L的蔗糖分別添加20 g/L的低聚糖(菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖),經(jīng)均質(zhì)、熱處理后冷卻,單菌發(fā)酵乳按3%的接菌量分別接入3株益生菌,37 ℃發(fā)酵18 h。

1.2.3 發(fā)酵乳活菌數(shù)的測(cè)定

將發(fā)酵乳搖晃均勻后進(jìn)行梯度稀釋。采用MRS固體培養(yǎng)基傾注法,37 ℃培養(yǎng)48 h,對(duì)發(fā)酵乳中的活菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4 發(fā)酵乳pH的測(cè)定

使用玻璃電極pH計(jì)測(cè)定樣品的pH值。

1.2.5 發(fā)酵乳酸度的測(cè)定

稱取5 g左右發(fā)酵乳樣品,記錄質(zhì)量m,用40 mL蒸餾水稀釋,并加酚酞指示劑,用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至微紅色,并在30 s內(nèi)不變色,記錄體積V,按公式(1)計(jì)算樣品酸度(°T)：

(1)

1.2.6 發(fā)酵乳總抗氧化能力的測(cè)定

樣品總抗氧化能力按照T-AOC試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。稱取27.8 mg試劑盒中的FeSO4·7H2O,用去離子水溶解并定容至1 mL,此時(shí)濃度即為100 mmol/L。用去離子水將100 mmol/L FeSO4·7H2O分別稀釋至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取5 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入96孔板中,在孔中加180 μL FRAP工作液,37 ℃孵育3～5 min后,用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為593 nm處的OD值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到曲線公式。分別取5 μL稀釋后的發(fā)酵乳加入96孔板中,在孔中加180 μL 光脫色熒光恢復(fù)技術(shù)(fluorescence recovery after photobleaching，F(xiàn)RAP)工作液,37 ℃孵育3～5 min后,用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為593 nm處的OD值,將樣品的OD值代入總抗氧化標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得結(jié)果。

1.2.7 益生菌在Caco-2細(xì)胞上的黏附

1.2.7.1 Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)

將Caco-2細(xì)胞接種于MEM培養(yǎng)基中并置于恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃,5% CO2,相對(duì)濕度90%)中培養(yǎng)。每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)液,當(dāng)Caco-2細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部80%時(shí)用含2.5 g/L的胰酶消化液消化后,進(jìn)行傳代。穩(wěn)定傳代至5代后可用于試驗(yàn)。

1.2.7.2 發(fā)酵乳中益生菌在Caco-2細(xì)胞上黏附能力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[16]的方法并略作修改。在24孔細(xì)胞板上每孔加入1 mL發(fā)酵乳(pH經(jīng)10 g/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至7.0),37 ℃下在細(xì)胞培養(yǎng)箱里共孵育2小時(shí)。孵育結(jié)束后每孔用PBS重復(fù)清洗3次后加入0.15 mL胰酶消化液并放入細(xì)胞培養(yǎng)箱消化3 min左右。將細(xì)胞板置于顯微鏡觀察到貼壁細(xì)胞漂浮在消化液中時(shí)加入0.35 mL MEM培養(yǎng)基終止消化。按照1.2.3的方法計(jì)算黏附在Caco-2細(xì)胞上的益生菌數(shù)量。黏附率按公式(1)計(jì)算:

(2)

式中：N0,發(fā)酵乳中原始益生菌活菌數(shù)；N1,黏附后益生菌活菌數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3次,使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2019、SPSS 25.0和Origin 2019進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與繪圖,各組均數(shù)比較采用Duncan法多重方差分析,P<0.05為顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 低聚糖對(duì)益生菌生長(zhǎng)曲線的影響

以低聚糖作為單一碳源,測(cè)定不同益生菌的生長(zhǎng)情況。由圖1-a可知,LV108利用低聚果糖的生長(zhǎng)促進(jìn)效果最為明顯,低聚半乳糖、菊粉次之。由圖1-b可知,Hsryfm 1301在利用低聚糖生長(zhǎng)時(shí)對(duì)低聚半乳糖顯示出較好的嗜好性,顯著高于菊粉和低聚果糖。由圖1-c可知,DALI 02利用3種低聚糖生長(zhǎng)情況排序?yàn)榈途酃?菊粉>低聚半乳糖,在利用低聚果糖時(shí)OD600可達(dá)到1.4左右,高于菊粉和低聚半乳糖且接近葡萄糖組的生長(zhǎng)情況。

a-菌株 LV108；b-菌株 Hsryfm 1301；c-菌株 DALI 02

2.2 低聚糖對(duì)益生菌發(fā)酵乳活菌數(shù)的影響

在全脂牛乳中添加2%不同低聚糖制備益生菌發(fā)酵乳,發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行活菌數(shù)測(cè)定。由圖2可知,菊粉和低聚果糖對(duì)LV108發(fā)酵乳的活菌數(shù)增殖作用不顯著(P>0.05),低聚半乳糖對(duì)LV108發(fā)酵乳活菌數(shù)增殖作用顯著(P<0.05),活菌數(shù)由8.37×108增殖至9.13×108CFU/mL。

LV108、Hsryfm 1301、DALI 02,分別表示使用3株菌發(fā)酵的發(fā)酵乳；I、F、G分別表示菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖(下同)

低聚糖對(duì)Hsryfm 1301發(fā)酵乳的活菌數(shù)增殖效果排序?yàn)榫辗?低聚半乳糖>低聚果糖(P<0.05),菊粉和低聚果糖對(duì)DALI 02 發(fā)酵乳活菌數(shù)增殖效果接近且與其他組別差異顯著(P<0.05)。LV108和Hsryfm 1301發(fā)酵乳活菌數(shù)顯著高于DALI 02發(fā)酵乳(P<0.05),均在8×108CFU/mL左右。3種低聚糖對(duì)Hsryfm 1301發(fā)酵乳中活菌數(shù)具有較好的增殖效果,其中菊粉對(duì)Hsryfm 1301發(fā)酵乳中活菌數(shù)增殖幅度最大,由8.17×108至1.24×109CFU/mL,為空白組的1.52倍,顯著高于其他低聚糖發(fā)酵乳。

2.3 低聚糖對(duì)益生菌發(fā)酵乳pH和酸度的影響

由圖3可知,低聚半乳糖對(duì)3株益生菌發(fā)酵乳pH降低作用均不顯著(P>0.05)。

圖3 低聚糖對(duì)益生菌發(fā)酵乳pH的影響

菊粉和低聚果糖均顯著降低了LV108和DALI 02發(fā)酵乳的pH(P<0.05),其中菊粉對(duì)LV108發(fā)酵乳pH的降低效果最為明顯,由4.84降至4.55,降低幅度為5.99%。菊粉和低聚果糖對(duì)Hsryfm 1301發(fā)酵乳pH的影響不顯著(P>0.05),添加低聚半乳糖后Hsryfm 1301發(fā)酵乳的pH得到了提高,由4.45增至4.56,提高幅度為2.47%。

由圖4可知,3種低聚糖均顯著提高了LV108和DALI 02發(fā)酵乳的酸度(P<0.05),其中菊粉對(duì)LV108和DALI 02發(fā)酵乳酸度的提升最為顯著,分別由72.12、63.54提升至85.66、71.86°T,提高幅度分別為18.69%、13.09%。添加菊粉和低聚果糖對(duì)Hsryfm 1301發(fā)酵乳酸度沒有顯著影響(P>0.05),而添加低聚半乳糖組的酸度得到了顯著降低(P<0.05),由79.77降至77.50°T。

圖4 低聚糖對(duì)益生菌發(fā)酵乳酸度的影響

2.4 低聚糖對(duì)益生菌發(fā)酵乳總抗氧化能力的影響

利用試劑盒對(duì)發(fā)酵乳進(jìn)行總抗氧化能力測(cè)定。由圖5可知,添加低聚果糖的LV108發(fā)酵乳總抗氧化能力為4.17 mmol/g prot,顯著高于添加菊粉和低聚半乳糖組(P<0.05),為空白組的1.83倍。菊粉和低聚果糖對(duì)Hsryfm 1301發(fā)酵乳總抗氧化能力的增效作用顯著優(yōu)于低聚半乳糖(P<0.05)。對(duì)于DALI 02而言,3種添加低聚糖組之間的總抗氧化能力差異不顯著且較之空白組均有1.5倍左右的提升,為4 mmol/g prot 左右。3種低聚糖對(duì)3株益生菌發(fā)酵乳在總抗氧化能力上表現(xiàn)出廣譜的增強(qiáng),未添加低聚糖組中Hsryfm 1301發(fā)酵乳總抗氧化能力最強(qiáng),為4.01 mmol/g prot。添加菊粉的Hsryfm 1301發(fā)酵乳總抗氧化能力在所有添加低聚糖組別中最強(qiáng),為4.85 mmol/g prot。

圖5 低聚糖對(duì)益生菌發(fā)酵乳總抗氧化能力的影響

2.5 低聚糖對(duì)發(fā)酵乳中益生菌對(duì)Caco-2細(xì)胞黏附的影響

在Caco-2細(xì)胞傳代穩(wěn)定后進(jìn)行發(fā)酵乳中益生菌的黏附能力測(cè)定。由圖6可知,添加菊粉和低聚半乳糖對(duì)LV108的黏附能力沒有顯著提升(P<0.05),LV108利用低聚果糖使其黏附率從0.56%提升至0.89%。Hsryfm 1301利用3種低聚糖對(duì)黏附能力的提升程度相當(dāng),均提升0.5倍左右。菊粉和低聚果糖對(duì)于DALI 02黏附的改善較大,其黏附率分別提升了0.98、0.66倍,低聚半乳糖對(duì)黏附能力沒有改善。低聚果糖對(duì)發(fā)酵乳中3株益生菌黏附Caco-2能力具有廣譜的提升作用,發(fā)酵乳中LV108和DALI 02黏附Caco-2能力在添加低聚半乳糖后沒有顯著變化(P<0.05)。

圖6 低聚糖對(duì)益生菌發(fā)酵乳黏附Caco-2細(xì)胞的影響

2.6 相關(guān)性分析

對(duì)本文所測(cè)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,皮爾遜相關(guān)性分析結(jié)果如表1所示?？偪寡趸芰εc活菌數(shù)呈正相關(guān)(P<0.05),與pH呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。黏附Caco-2細(xì)胞能力與活菌數(shù)呈負(fù)相關(guān)(P<0.01),與pH呈正相關(guān)(P<0.01),與酸度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

表1 發(fā)酵乳功能特性之間的相關(guān)性研究

3 結(jié)論與討論

本文研究探討了不同低聚糖作為單一碳源測(cè)定益生菌對(duì)其的利用情況,并對(duì)不同低聚糖對(duì)益生菌發(fā)酵乳的活菌數(shù)增殖、總抗氧化能力、抑菌能力、Caco-2細(xì)胞黏附能力進(jìn)行了探究。

3株益生菌在低聚糖條件下的生長(zhǎng)效果均低于在葡萄糖條件下的生長(zhǎng)情況,這可能是由于葡萄糖是一種單糖,更適合益生菌的生長(zhǎng)[17]。益生菌在利用低聚糖生長(zhǎng)時(shí)會(huì)表現(xiàn)出差異性,主要的原因是益生菌代謝低聚糖的酶系統(tǒng)存在差異[18-19]。3種低聚糖對(duì)Hsryfm 1301和DALI 02發(fā)酵乳中活菌數(shù)具有較好的增殖效果,其中菊粉對(duì)Hsryfm 1301發(fā)酵乳中活菌數(shù)的增殖幅度最大,由8.17×108至1.24×109CFU/mL,為空白組的1.52倍。

3種低聚糖對(duì)3株益生菌發(fā)酵乳在總抗氧化能力上表現(xiàn)出廣譜的增強(qiáng),益生菌的抗氧化作用在維持微生態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),益生元和益生菌的協(xié)同混合對(duì)健康有積極的影響[20]。CERIELLO等[21]報(bào)道了一系列的糖尿病、發(fā)病機(jī)制和其他后續(xù)并發(fā)癥是由氧化應(yīng)激和炎癥引起的,開發(fā)具有抗氧化能力的功能型食品對(duì)于治療此類疾病是一種良好的策略。發(fā)酵乳的抗氧化能力與益生菌在發(fā)酵牛奶過程中釋放的抗氧化肽密切相關(guān)[22],低聚糖協(xié)同益生菌可能在發(fā)酵牛奶過程中增強(qiáng)了抗氧化肽的釋放。

低聚果糖對(duì)發(fā)酵乳中3株益生菌黏附Caco-2能力均具有提升作用,發(fā)酵乳中LV108和DALI 02黏附Caco-2能力在添加低聚半乳糖后沒有顯著變化(P>0.05)。作為益生元的寡糖也可以增強(qiáng)益生菌菌株的黏附能力,這表明開發(fā)新的共生產(chǎn)品可能是一種潛在的工具,以增加益生菌在腸道中的停留時(shí)間[23]。CAO等[17]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)植物乳桿菌ATCC 14917與不同寡糖一起培養(yǎng)時(shí)黏附特性發(fā)生了變化,甘露寡糖培養(yǎng)下其黏附能力顯著高于其他各組。甘露寡糖通過高表達(dá)黏附因子基因和多種乳酸菌表面蛋白來影響?zhàn)じ教匦訹17]。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示,總抗氧化能力與活菌數(shù)呈正相關(guān)(P<0.05),與pH呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。黏附Caco-2細(xì)胞能力與活菌數(shù)呈負(fù)相關(guān)(P<0.01),與pH呈正相關(guān)(P<0.01),與酸度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。本文探究了不同低聚糖對(duì)益生菌發(fā)酵乳功能特性的影響,為篩選出合適的低聚糖作為益生元提供理論依據(jù),對(duì)合生元的篩選及具有特定功能的合生元發(fā)酵乳的開發(fā)具有指導(dǎo)意義。