江穎娟，蔣作鋒，岑俊林，李桂東，余慧文

廣州市紅十字會醫(yī)院暨南大學醫(yī)學院附屬廣州紅十字會醫(yī)院全科醫(yī)學科，廣州510220

糖尿病的發(fā)病率逐漸升高，糖尿病及其慢性并發(fā)癥可嚴重降低患者生活質量，增加經(jīng)濟負擔［1］。大血管的動脈粥樣硬化是導致糖尿病患者致殘乃至病死的主要原因之一。氧化應激反應和內質網(wǎng)應激反應在動脈粥樣硬化病變進程可能發(fā)揮重要作用。由于氧化應激反應可導致糖尿病患者組織中ROS過量產(chǎn)生，促進內皮細胞凋亡，最終導致動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。持續(xù)的高血糖狀態(tài)還可觸發(fā)患者體內的內質網(wǎng)應激反應，激活分子伴侶糖調節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78），啟動內皮細胞的凋亡程序［2］，導致動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。最新研究［3］發(fā)現(xiàn)，高血糖狀態(tài)下人體內皮細胞的氧化應激反應、內質網(wǎng)應激反應可互相促進，進一步誘導內皮細胞的凋亡，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。深入研究靶向氧化應激、內質網(wǎng)應激的作用機制可能為為糖尿病并發(fā)動脈粥樣硬化的防治提供新思路。中藥具有穩(wěn)定性好、不良反應輕、療效明確等優(yōu)點，中藥用于治療慢性病的基礎研究是目前的研究熱點之一。槲皮素是一種具有很多種生物學活性的天然黃酮類物質，具有促進氧自由基清除、抵抗脂質過氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥理學作用［4］。近期有研究［5］指出，槲皮素可抑制病毒感染導致的心肌細胞凋亡，其作用機制可能與其抑制內質網(wǎng)的應激有關。有研究［6］指出，槲皮素可通過抑制內質網(wǎng)應激，抑制視網(wǎng)膜細胞、神經(jīng)元細胞的損傷。槲皮素是否通過抑制氧化應激及內質網(wǎng)應激反應保護內皮細胞，抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，目前尚不清楚。自2020 年3 月起，我們觀察了不同劑量槲皮素預處理后采用高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)的內皮細胞活性、氧化應激及內質網(wǎng)應激情況，旨在為研究槲皮素治療糖尿病并發(fā)癥動脈粥樣硬化的作用機制提供理論基礎?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和儀器 人臍靜脈內皮細胞購買自上海艾研科技有限公司。槲皮素單體、DMEM 低糖培養(yǎng)基、CCK-8 細胞活性檢測試劑盒自Sigma 公司；PBS 粉、胰酶、胎牛血清等購自美國Hyclone 公司。蛋白提取試劑盒購自Bioworld 公司?？笴/EBP同源蛋白（CHOP）抗體、抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶12（Capsae12）抗體、GRP78抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗購自Zenbio 公司。LDH 檢測試劑盒、ROS 檢測試劑盒購自南京建成生物。凋亡檢測試劑盒Annexin V-FITC/PI 購自南京凱基生物公司。細胞培養(yǎng)瓶、各種離心管和不同型號的細胞培養(yǎng)板等購自美國Corning公司［7］。

1.2 內皮細胞分組及槲皮素處理方法 在37 ℃、含CO2為5%的細胞培養(yǎng)箱中采用培養(yǎng)內皮細胞，實驗前換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，然后按照分組情況處理細胞。將內皮細胞分為槲皮素組（Q20 組、Q50 組、Q100 組）、高糖組（HG 組）及正常對照組（Control組），Q20組預先加入20 μmol/L的槲皮素預處理1 h，再加入10 mg/L的葡萄糖培養(yǎng)細胞，Q50組預先加入50 μmol/L 的槲皮素預處理1 h，再加入10 mg/L 的葡萄糖培養(yǎng)細胞，Q100 組預先加入100 μmol/L 的槲皮素預處理1 h，再加入10 mg/L 的葡萄糖培養(yǎng)細胞。HG 組在培養(yǎng)液中加入10 mg/L的HG 培養(yǎng)細胞，Control 組采用低糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 各組內皮細胞活性觀察

1.3.1 各組細胞活性測算 取各組細胞接種于96孔板，調整細胞密度5×107/L。培養(yǎng)24 h時按照說明書向每孔細胞加入CCK-8 溶液，在37 ℃下培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h。采用酶標儀檢測各組光密度（450 nm波長）OD 值，并計算各組細胞活性。細胞活性（%）=［藥物組OD 值－空白對照孔OD 值］÷［正常組OD值－空白對照孔OD值］×100%。各組實驗至少重復3次，取平均值。

1.3.2 各組細胞凋亡情況觀察 采用流式細胞術。培養(yǎng)24 h 時收集細胞，調整細胞濃度為5×105/mL，預冷PBS 洗滌細胞2 次，按照說明重懸細胞于Binding Buffer 中，分別向每管細胞內加入10 μL Annexin V和10 μL PI試劑，室溫避光放置10 min，加入Binding Buffer，流式細胞儀測算各組細胞凋亡率。實驗至少重復3次，取平均值。

1.4 各組內皮細胞氧化應激情況觀察

1.4.1 各組細胞活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）檢測 采用流式細胞術。取對數(shù)生長期各組細胞接種于6孔板，貼壁生長培養(yǎng)至80%左右，每孔分別加入終濃度為20 μmol/L 的DCFH-DA，37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)30 min，PBS 洗滌內皮細胞，胰酶消化細胞，最含3%FBS 的PBS 懸浮細胞，采用流式細胞儀檢測各組細胞ROS。用平均熒光強度（median fluorescent intensity，MFI）代表ROS 含量。各組重復3次，取平均值。

1.4.2 各組細胞培養(yǎng)液中LDH 活性檢測 培養(yǎng)24 h 時取各組細胞培養(yǎng)液，3 000 r/min 離心10 min，采用乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒測定內皮細胞細胞培養(yǎng)液中LDH活性。各組重復不少于3次，取平均值。

1.5 各組細胞內皮細胞內質網(wǎng)應激情況觀察 采用Western Blotting 法檢測各組內皮細胞GRP78、CHOP 和Caspase12。培養(yǎng)24 h 時取各組細胞，按照蛋白提取試劑盒說明書提取核蛋白，測定蛋白濃度并調整蛋白至合適濃度，取30 μg 蛋白上樣，進行SDS-PAGE 分離，將蛋白轉印至硝酸纖維素膜，采用脫脂牛奶持續(xù)封閉4 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗繼續(xù)室溫孵育1 h，TBST 清洗后用Odyssey 凝膠成像系統(tǒng)掃描成像，所得結果以GAPDH 為內參［7］。各組重復3次，取平均值。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)處理。采用Kolmogorov-Smirnov test 檢驗是否符合正態(tài)分布，成正態(tài)分布的計量資料以表示，各組間比較采用單因素方差分析One-way ANOVA。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組內皮細胞活性比較 培養(yǎng)24 h 時Control組、Q20 組、Q50 組、Q100 組、HG 組及內皮細胞活性分別為100%、88.50% ± 4.01%、90.93% ± 2.83%、92.525±2.46%、80.56%±3.36%、，與Control 組比較，HG 組內皮細胞活性下降（P＜0.01）；與HG 組比較，Q20組、Q50組、Q100組內皮細胞活性增加，且隨濃度增加，細胞活性上升（P均＜0.01）。

2.2 各組細胞凋亡率比較 培養(yǎng)24 h 時Q20 組、Q50 組、Q100 組、HG 組及Control 組細胞凋亡率分別為19.20% ± 1.78%、14.56% ± 1.47%、9.00% ±3.12%、23.46% ±1.80%、3.47% ±0.96%。與Control 組比較，HG 組細胞凋亡率增加（P＜0.01）；與HG組比較，Q20 組、Q50 組及Q100 組細胞凋亡率降低，且隨槲皮素濃度增加，細胞凋亡率下降（P均＜0.01）。

2.3 各組細胞ROS 含量比較 培養(yǎng)24 h 時Q20組、Q50 組、Q100 組、HG 組及Control 組細胞ROS 含量分別為215.67 ± 4.51、185.33 ± 17.79、144.00 ±9.17、233.67 ± 8.50、119.66 ± 5.86。與Control 組比較，HG 組細胞ROS 含量升高（P＜0.05）；與HG 組比較，Q20 組、Q50 組及Q100 組細胞ROS 含量降低，且隨槲皮素濃度增加，ROS含量降低（P均＜0.01）。

2.4 各組細胞培養(yǎng)液中LDH 活性比較 培養(yǎng)24 h時Q20 組、Q50 組、Q100 組、HG 組及Control 組細胞培養(yǎng)液中LDH活性分別為（152.33 ± 11.02）、（129.00 ± 13.00）、（116.67 ± 19.01）、（160.00 ±13.11）、（98.67±7.02）U/L。與Control 組比較，HG組細胞培養(yǎng)液中LDH 活性升高（P＜0.05）；與HG 組比較，Q50組及Q100組細胞培養(yǎng)液中LDH 活性降低（P均＜0.05）；與Q50 組比較，Q100 組細胞培養(yǎng)液中LDH活性降低（P均＜0.05）。

2.5 各組細胞GRP78、CHOP 和Caspase12 表達量比較 培養(yǎng)24 h 時各組細胞GRP78、CHOP 和Caspase12表達量比較見表1。

表1 培養(yǎng)24 h時各組細胞GRP78、CHOP和Caspase12表達量比較（）

表1 培養(yǎng)24 h時各組細胞GRP78、CHOP和Caspase12表達量比較（）

注：與Control組比較，＊P＜0.05；與HG 組比較，＃P＜0.05；與Q20組比較，＆P＜0.05；與Q50組比較，ΔP＜0.05。

3 討論

長期的高血糖狀態(tài)是導致糖尿病患者并發(fā)心腦血管疾病的主要原因。血糖水平的高低與頸動脈內膜中層厚度呈正相關，也是亞臨床動脈粥樣硬化的指標之一［8］。同時還有研究表明，高血糖可促進單核細胞和內皮細胞粘附，誘發(fā)出一系列氧化應激反應、炎癥反應等，最終導致內皮功能障礙和動脈粥樣硬化的發(fā)生。因此應該及早干預并嚴格控制糖尿病患者的血糖水平，減少內皮細胞的損傷和動脈粥樣硬化的發(fā)生。

槲皮素屬于黃酮類化合物的一種，分布廣泛，存在于洋蔥、漿果、甘藍、蘋果以及茶和紅酒中，以往的研究表明槲皮素具有一定的抗炎、抗腫瘤、抗氧化應激等作用［9］，但其對高糖損傷的內皮細胞是否具有保護作用目前研究較少。本研究中結果顯示高糖誘導下內皮細胞的細胞活性較Control 組明顯下降，同時細胞膜損傷程度和細胞凋亡較Control 組明顯升高，說明高糖對內皮細胞具有一定的損傷作用，這一結果與其他課題組的研究結果具有一致性［10］；同時本研究證實槲皮素可改善高糖條件下內皮細胞的細胞活性、細胞膜損傷，減少細胞凋亡，初步表明槲皮素對內皮細胞具有一定的保護作用，但其是否與氧化應激和內質網(wǎng)應激相關仍需要進一步研究。

目前長期的高血糖狀態(tài)導致動脈粥樣硬化的發(fā)病機理尚不清楚，高糖條件下內皮細胞內產(chǎn)生的的ROS 與機體內抗氧化防御系統(tǒng)不平衡，過量生成的ROS引起內皮細胞的損傷，增加了內皮細胞凋亡，最終導致動脈粥樣硬化的發(fā)生［11］。研究［12］報道，槲皮素通過減少角膜上皮細胞ROS 的生成發(fā)揮保護角膜保護作用。還有研究［13］指出槲皮素通過拮抗氧化酶的作用抑制H2O2誘導的嗜鉻細氧化損傷。以上這些研究表明槲皮素可通過對氧化的抑制發(fā)揮細胞保護作用，但槲皮素對高糖條件下內皮細胞的氧化應激的研究較少，本研究采用高糖條件下的內皮細胞為研究對象，結果發(fā)現(xiàn)，與Control 組相比，高糖明顯促進了內皮細胞ROS 的表達，這與以往的研究結果是一致的［14］，同時本研究還發(fā)現(xiàn)槲皮素可明顯減少高糖培養(yǎng)條件下內皮細胞ROS 的生成，這一結果初步表明槲皮素可能通過抑制氧化應激反應改善高糖培養(yǎng)條件下內皮細胞的活性，減少內皮細胞凋亡，當然這一過程還有可能有其他機制的參與。

內質網(wǎng)是負責蛋白質折疊、轉錄后修飾和轉運的細胞器，對維持細胞的穩(wěn)態(tài)具有非常重要作用，各種生理和病理因素都可以引起內質網(wǎng)內錯誤折疊或未折疊蛋白的積累，即形成內質網(wǎng)應激。目前發(fā)現(xiàn)內質網(wǎng)應激參與了人類很多常見疾病的發(fā)生、發(fā)展?，F(xiàn)有已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三種內質網(wǎng)應激的相關蛋白，分別是肌醇需求因子1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）、活化轉錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）、類蛋白激酶內質網(wǎng)激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK），它們負責激活了內質網(wǎng)應激的三條信號通路［15］。正常情況下三者與分子伴侶GRP78 相結合，當內質網(wǎng)應激發(fā)生時，GRP78與IRE1、ATF6 以及PERK 分離，并進一步激活下游的相關凋亡信號［16］。近年來大量研究［17-18］表明，糖尿病患者動脈粥樣硬化與內質網(wǎng)應激反應相關，持續(xù)高血糖狀態(tài)可通過誘導炎癥因子及內質網(wǎng)應激標志分子表達，導致內皮細胞凋亡［19］。糖尿病、肥胖和代謝綜合征患者的GRP78、CHOP 以及凋亡信號分子Caspase12 等的水平可能是提示動脈粥樣硬化和心血管疾病的重要標志［20］。糖尿病持續(xù)的高血糖狀態(tài)誘發(fā)的氧化應激反應和內質網(wǎng)應激相互促進，進一步促進了內皮細胞的凋亡，最終導致動脈粥樣硬化的發(fā)生。槲皮素可通過抑制內質網(wǎng)應激相關蛋白PERK、IPE1、CHOP 的表達以及JNK 的磷酸化減少不對稱二甲基精氨酸處理下腎小球內皮細胞的凋亡［21］；槲皮素還可通過抑制GRP78、CHOP的表達抑制多巴胺能神經(jīng)元內質網(wǎng)應激的發(fā)生，減少細胞凋亡［22］。因此槲皮素在一定的條件下可以抑制某些細胞的內質網(wǎng)應激反應，但槲皮素是否抑制高糖條件下內皮細胞的內質網(wǎng)應激反應，目前報道較少。本研究發(fā)現(xiàn)高糖可以引起內皮細胞內質網(wǎng)應激相關蛋白GRP78、CHOP 以及Caspase12 的表達增加，并促進內皮細胞的凋亡，而槲皮素則可明顯減少高糖條件下內皮細胞GRP78、CHOP 以及caspase12 蛋白的表達，減少內皮細胞的凋亡，這些結果提示槲皮素可能通過抑制高糖引發(fā)的內皮細胞內質網(wǎng)應激，進而抑制內皮細胞凋亡，發(fā)揮內皮細胞的保護作用。

綜上所述，槲皮素預處理可能提高槲皮素能增強高糖培養(yǎng)液中的內皮細胞活力，降低細胞培養(yǎng)液中LDH 活性，抑制細胞凋亡，降低ROS 含量，抑制細胞GRP78、CHOP 及Caspase 12 表達，且呈一定劑量依賴性。槲皮素在高糖條件下可能通過抑制內皮細胞的氧化應激和內質網(wǎng)應激反應，抑制內皮細胞的凋亡。槲皮素對高糖誘導的內皮細胞有一定程度的保護作用，其作用機制可能與抑制高糖引發(fā)的氧化應激和內質網(wǎng)應激相關。