白江松，張子卉，連朋敬，奚柳青，李靜云，徐 彤，李鴻儒，張鐘方，喬 健*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；2.河北北方學(xué)院動物科技學(xué)院，張家口 075000)

革蘭陰性菌銅綠假單胞菌是一種機(jī)會致病菌，通常棲息在土壤和水環(huán)境的表面。它的適應(yīng)性和固有的高抗藥性使其能夠在自然和人工環(huán)境中廣泛生存[1]。銅綠假單胞菌感染會給養(yǎng)貂業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，它能引起一種急性敗血性傳染病——水貂出血性肺炎。該病發(fā)病急、死亡快，常呈地方性爆發(fā)，發(fā)病貂死亡率在1%～50%[2]。自2000年以來，我國水貂感染銅綠假單胞菌的疫情報道逐漸增多，給養(yǎng)殖戶造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失，在山東、遼寧、河北、內(nèi)蒙古等地均有報道[3]。銅綠假單胞菌也可以感染人，其嚴(yán)重感染通常是醫(yī)院內(nèi)感染，幾乎所有銅綠假單胞菌感染的臨床病例都與宿主防御能力受損有關(guān)，例如中性粒細(xì)胞減少、嚴(yán)重?zé)齻湍倚岳w維化[4-6]。2017年，世界衛(wèi)生組織將銅綠假單胞菌列為最危及生命的細(xì)菌之一和研發(fā)新型抗生素的優(yōu)先病原體[7]。

Toll樣受體(TLR)是Ⅰ型跨膜蛋白，是一類保守的模式識別受體(PRR)，可被多種病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)激活，從而在高等動物中引發(fā)先天性免疫應(yīng)答和炎癥[8]。據(jù)報道，在包括銅綠假單胞菌在內(nèi)的革蘭陰性細(xì)菌感染中，脂多糖(LPS)是細(xì)菌細(xì)胞壁的一種成分，它通過引起宿主炎癥反應(yīng)并誘導(dǎo)全身性炎癥而引起急性器官損傷和敗血癥[9]。LPS主要通過激活Toll樣受體4(TLR4)引起急性免疫應(yīng)答[10]。一項研究表明，人肺泡巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞中TLR4 mRNA的表達(dá)水平在LPS暴露1 h后增加，而在LPS 暴露24 h后又降低，這表明LPS雙相地影響肺泡巨噬細(xì)胞中TLR4的表達(dá)水平[11]。在銅綠假單胞菌的肺炎動物模型中，炎性細(xì)胞因子的釋放和積累主要發(fā)生在被感染的肺泡中，肺中產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子能夠傳播到被銅綠假單胞菌分泌的毒素所破壞的整個肺上皮循環(huán)中，從而導(dǎo)致敗血性休克[12]。近來，一些研究強(qiáng)調(diào)了TLR4在肺炎模型中的炎癥作用。在肺部感染期間，IL-27通過促進(jìn)TLR4表達(dá)，在肺成纖維細(xì)胞中增強(qiáng)了LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子IL-6和IL-8的產(chǎn)生[13]。還有研究表明，TLR4激活導(dǎo)致對機(jī)體有害的炎癥應(yīng)答[14]。因此，LPS-TLR4信號引發(fā)的過度炎癥似乎是導(dǎo)致細(xì)菌性肺炎患者死亡的重要原因。

但是，LPS-TLR4信號傳導(dǎo)的阻斷可能是有害的，因為通過TLR4識別細(xì)菌LPS以及隨后感染宿主中的促炎性反應(yīng)對于抵抗病原體的先天免疫力至關(guān)重要。有研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后發(fā)生肺炎的患者的肺泡巨噬細(xì)胞中TLR4表達(dá)降低，這表明TLR4表達(dá)降低介導(dǎo)的局部免疫抑制是術(shù)后的危險因素[15]。此外，有研究表明存在TLRs的內(nèi)源性配體[16]，這意味著TLR信號不僅在針對感染性微生物的炎癥和免疫反應(yīng)中具有調(diào)節(jié)作用，而且還在針對內(nèi)源性有害刺激的炎癥和免疫反應(yīng)中具有調(diào)節(jié)作用?；谶@些報道，TLR4在感染性肺炎中具有雙重作用。但TLR4仍然是抑制不良炎癥反應(yīng)的潛在靶標(biāo)。

本研究使用致死劑量的銅綠假單胞菌對TLR4缺陷C3H/HeJ小鼠和野生型C3H/HeN小鼠進(jìn)行感染，通過評估各組小鼠臨床癥狀、存活率、肺病變程度、肺部細(xì)胞因子含量的動態(tài)變化來探討TLR4對銅綠假單胞菌感染小鼠致病性的影響，有助于進(jìn)一步了解銅綠假單胞菌感染的致病機(jī)理以及TLR4在銅綠假單胞菌感染引起的肺損傷中的作用，進(jìn)而采取有效手段預(yù)防和治療銅綠假單胞菌感染引起的肺損傷。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與實驗動物

本試驗采用購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司的銅綠假單胞菌凍干粉，菌株標(biāo)準(zhǔn)編號：FSCC 206003，批號：B0102B。6～8周齡，18～21 g雄性C3H/HeJ和C3H/HeN小鼠各21只，野生型小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；TLR缺陷小鼠購自南京大學(xué)模式動物研究所，該小鼠Tlr4基因的cDNA的2342處發(fā)生由胞嘧啶突變?yōu)橄汆堰实狞c(diǎn)突變，該突變導(dǎo)致TLR4受體蛋白的胞質(zhì)TIR區(qū)712位點(diǎn)處保守的脯氨酸被組氨酸取代，而脯氨酸是TLR4信號通路的重要組成部分，從而導(dǎo)致TLR4信號通路的功能缺失。0.9% NaCl溶液購自石家莊四藥有限公司。LB固體培養(yǎng)基購自北京路橋技術(shù)有限公司。小鼠TNF-α ELISA檢測試劑盒(貨號BMS607/3)購自eBioscience公司。小鼠IL-1β ELISA檢測試劑盒(貨號MLB00C)購自R & B system公司。

1.2 試驗分組及樣本采集

將C3H/HeJ小鼠和C3H/HeN小鼠各21只，隨機(jī)按如下分組。C3H/HeJ和C3H/HeN感染組，每組18只小鼠，每只小鼠滴鼻接種100 μL銅綠假單胞菌濃度為1.8×108個·mL-1的細(xì)菌懸液。C3H/HeJ和C3H/HeN對照組，每組3只小鼠，每只小鼠滴鼻接種100 μL 0.9% NaCl溶液。感染細(xì)菌后0、8、16、32、54 h監(jiān)測各組小鼠體溫、體重變化，感染后72 h內(nèi)觀察并記錄小鼠的精神狀態(tài)和死亡情況。計算各組小鼠的中位生存期，即恰好有50%的個體尚存活的時間。中位生存期越長，表示疾病的預(yù)后越好；中位生存期越短，預(yù)后越差。在小鼠細(xì)菌感染后8、16、32 h進(jìn)行采樣，每次采樣時在感染組隨機(jī)選擇3只小鼠，稱重，麻醉后脫頸處死，采集肺組織，觀察記錄肺大體病理變化。稱量肺重，計算肺系數(shù)(肺系數(shù)=肺濕重/體重×100%)，觀察記錄肺大體病理變化。

表1 試驗分組設(shè)計

1.3 肺組織病理切片的制作及HE染色

在細(xì)菌感染后16 h，采集各組小鼠肺組織。分離左、右肺，將左肺置于4 %多聚甲醛溶液中固定1周后，經(jīng)沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片、蘇木素-伊紅染色、封片步驟，制作組織切片并觀察。

1.4 肺組織細(xì)菌載量的測定

在細(xì)菌感染后8、16、32 h，采取各組肺組織，將肺組織在PBS中研磨，定容至4 mL，獲得肺組織勻漿。10×倍比稀釋至10-6。每個稀釋度(包括原液)取100 μL于LB營養(yǎng)瓊脂平板上，涂布培養(yǎng)24 h，菌落數(shù)在30～300個之間計數(shù)，計算細(xì)菌載量。

1.5 ELISA法測定肺組織勻漿中TNF-α、IL-1β含量

在細(xì)菌感染后8、16、32 h，采集各組肺組織，將肺組織在PBS中研磨，定容至4 mL，獲得肺組織勻漿。并以5 000 r·min-1離心10 min，取上清進(jìn)行檢測。按照小鼠TNF-α和IL-1β ELISA檢測試劑盒說明書操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)在GraphPad Prism8上擬合曲線并計算待測樣品含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

所有試驗數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用GraphPad Prism8進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并使用t檢驗分析兩組間差異性，AVONA分析多組間差異性，以P>0.05為不存在顯著差異，以P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 試驗動物精神狀態(tài)

TLR4缺失型鼠C3H/HeJ對照組和野生型C3H/HeN對照組，臨床表現(xiàn)正常。TLR4缺失型鼠C3H/HeJ感染組和野生型C3H/HeN感染組，在接種銅綠假單胞菌8 h后均出現(xiàn)精神沉郁、活動減少、被毛粗糙的現(xiàn)象。細(xì)菌感染24 h時，C3H/HeJ感染組和野生型C3H/HeN感染組小鼠均表現(xiàn)出明顯呼吸困難，C3H/HeJ感染組小鼠扎堆現(xiàn)象更為嚴(yán)重。

2.2 小鼠體溫與體重變化

由圖1可知銅綠假單胞菌感染后，兩個對照組小鼠體溫?zé)o明顯變化，均在正常范圍內(nèi)。TLR4缺失C3H/HeJ感染組小鼠在感染后8 h內(nèi)，體溫急劇下降，感染后8～16 h，體溫以較快速度回升，之后緩慢回升，到54 h時，體溫接近正常水平。野生型C3H/HeN小鼠在感染后8 h內(nèi)體溫下降，但下降幅度遠(yuǎn)小于C3H/HeJ感染組小鼠，隨后體溫平緩地持續(xù)下降，到54 h時，體溫低于正常水平。感染后8 h，C3H/HeJ感染組小鼠體溫顯著低于C3H/HeN感染組小鼠(P<0.01)。感染后54 h時，C3H/HeJ感染組小鼠體溫顯著高于C3H/HeN感染組小鼠(P<0.01)。兩個對照組小鼠體重平緩上升，而銅綠假單胞菌感染后，兩個感染組小鼠體重大幅下降。

**.P<0.01。下同

圖2 銅綠假單胞菌感染后小鼠體重變化

2.3 存活率

接種銅綠假單胞菌后，TLR4缺失型C3H/HeJ感染組的8只小鼠中陸續(xù)死亡7只，存活1只，存活率為12.5%，中位生存期為27 h。野生型C3H/HeN感染組的8只小鼠陸續(xù)死亡7只，存活1只，存活率為12.5%，中位生存期為45 h。TLR4缺失型C3H/HeJ感染組小鼠先于野生型C3H/HeN感染組小鼠死亡。兩個對照組小鼠存活率為100%(圖3)。

圖3 銅綠假單胞菌感染后小鼠生存曲線

2.4 肺大體病變和組織病理學(xué)變化

如圖4，C3H/HeJ對照組和C3H/HeN對照組的小鼠肺組織無眼觀病理變化。C3H/HeJ感染組與C3H/HeN感染組小鼠表現(xiàn)出肺體積增大，邊緣鈍圓。細(xì)菌感染后8 h，C3H/HeN感染組小鼠肺表面僅有少數(shù)淤血點(diǎn)；而C3H/HeJ感染組小鼠肺充血淤血嚴(yán)重。細(xì)菌感染后16 h，眼觀兩個感染組病變程度類似，表現(xiàn)為肺體積增大，邊緣鈍圓，表明有許多出血點(diǎn)。細(xì)菌感染后32 h，C3H/HeN感染組小鼠肺出現(xiàn)大面積實變區(qū)域，而C3H/HeJ感染組小鼠肺基本恢復(fù)正常(圖4)。

組織學(xué)觀察表明(圖5)，接種銅綠假單胞菌后16 h，C3H/HeJ感染組和C3H/HeN感染組的小鼠肺都有明顯的病變，表現(xiàn)為肺間質(zhì)增厚，肺泡毛細(xì)血管淤血、出血，肺泡中大量嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤。其中，C3H/HeN感染組小鼠肺組織學(xué)病變更為嚴(yán)重，肺間質(zhì)嚴(yán)重增厚，肺基本結(jié)構(gòu)喪失。

圖5 銅綠假單胞菌感染后16 h小鼠肺病理切片(50×和100×)

2.5 肺水腫程度變化

如圖6，銅綠假單胞菌感染后8 h，C3H/HeN感染組小鼠肺系數(shù)高于C3H/HeN對照組小鼠(P<0.05)，C3H/HeJ感染組小鼠的肺系數(shù)極顯著高于C3H/HeJ對照組小鼠的肺系數(shù)(P<0.01)，C3H/HeJ感染組小鼠肺系數(shù)高于C3H/HeN感染組(P<0.05)。隨后C3H/HeN感染組小鼠肺系數(shù)在16和32 h逐漸增加，在32 h其肺系數(shù)高于C3H/HeJ感染組，但差異不顯著(P>0.05)。因銅綠假單胞菌感染而死亡的小鼠，C3H/HeN感染組小鼠的肺系數(shù)高于C3H/HeJ感染組小鼠的肺系數(shù)，差異極顯著(P<0.01，圖7)。

圖6 銅綠假單胞菌感染后小鼠肺系數(shù)

圖7 銅綠假單胞菌感染后死亡小鼠肺系數(shù)

2.6 肺部細(xì)菌載量變化

肺部細(xì)菌載量代表肺部對細(xì)菌的清除能力，能直接反映機(jī)體的抵抗力。與C3H/HeN感染組相比，感染后8 h，C3H/HeJ感染組小鼠肺細(xì)菌載量顯著增加(P<0.05)。感染后16、32 h，C3H/HeJ感染組小鼠肺細(xì)菌載量均高于C3H/HeN感染組，但差異不顯著(P>0.05，圖8)。

圖8 銅綠假單胞菌感染后小鼠肺部細(xì)菌載量

2.7 肺勻漿TNF-α、IL-1β含量比較

由圖9可知，感染銅綠假單胞菌后，野生型C3H/HeN小鼠和TLR4突變型C3H/HeJ小鼠肺勻漿中TNF-α含量均極顯著上升(P<0.01)。感染后8 h，測得C3H/HeN感染組小鼠肺勻漿中TNF-α濃度最高，而后隨時間增加逐漸降低。而C3H/HeJ感染組小鼠在所測的3個時間點(diǎn)，肺勻漿中TNF-α濃度變化不大。感染后8 h，C3H/HeN感染組小鼠肺勻漿中TNF-α濃度極顯著高于C3H/HeJ感染組小鼠(P<0.01)。

圖9 銅綠假單胞菌感染后小鼠肺部細(xì)胞因子的變化

感染銅綠假單胞菌后，野生型C3H/HeN小鼠和TLR4突變型C3H/HeJ小鼠肺勻漿中IL-1β含量均極顯著上升(P<0.01)。感染后8 h，測得C3H/HeN感染組小鼠肺勻漿中IL-1β濃度最高，而后隨時間增加而降低。感染后8、32 h，C3H/HeN感染組小鼠肺勻漿中IL-1β濃度顯著高于C3H/HeJ感染組小鼠(P<0.01、P<0.05)。

3 討 論

LPS是細(xì)菌中研究最深入的免疫刺激成分之一，可以誘發(fā)全身性炎癥和敗血癥[17]。Beutler和Rietschel[18]使用已知對LPS應(yīng)答有缺陷的C3H/HeJ小鼠品系，證明TLR4是LPS的重要識別受體。本研究旨在了解TLR4信號通路在銅綠假單胞菌感染所致急性肺損傷中的作用，本試驗對TLR4缺陷C3H/HeJ小鼠和野生型C3H/HeN小鼠感染致死劑量銅綠假單胞菌的致病性進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，與野生型C3H/HeN小鼠相比，TLR4缺陷型C3H/HeJ小鼠在銅綠假單胞菌感染后臨床癥狀更為嚴(yán)重，感染后8 h，C3H/HeJ小鼠體溫急速下降，顯著低于C3H/HeN感染組小鼠體溫。另外，TLR4缺陷型C3H/HeJ小鼠的中位生存期為27 h，顯著短于C3H/HeN小鼠45 h的中位生存期。肺大體病變及肺系數(shù)的結(jié)果表明，感染后8 h，C3H/HeJ小鼠肺水腫及病變程度顯著高于野生型C3H/HeN小鼠。這些結(jié)果均表明TLR4缺陷型小鼠對銅綠假單胞菌的抵抗力較弱。

本研究發(fā)現(xiàn)，與野生型C3H/HeN小鼠相比，在感染后8 h，C3H/HeJ小鼠肺組織中TNF-α和IL-1β顯著降低。有研究表明，TNF-α通過結(jié)合并聚集大多數(shù)細(xì)胞膜上大量存在的高親和力受體發(fā)揮作用[19]，激活許多次級蛋白，這些蛋白會激活細(xì)胞內(nèi)的各種反應(yīng)，例如激活基因轉(zhuǎn)錄、產(chǎn)生活性氧以及氮自由基[20]。TNF-α可能通過中性粒細(xì)胞和血小板的活化，巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞殺傷能力的增強(qiáng)以及對免疫系統(tǒng)的刺激而對感染產(chǎn)生抵抗力[21]。IL-1β是關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)和促炎細(xì)胞因子，被caspase-1加工，并在炎性小體中被激活[22]。IL-1β促進(jìn)單核細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞和M1樣巨噬細(xì)胞，并促進(jìn)活化B淋巴細(xì)胞的增殖和分化[23-24]。促炎性因子TNF-α和IL-1β顯著降低，表明機(jī)體抵抗銅綠假單胞菌感染的能力減弱。細(xì)菌載量的結(jié)果也與其一致，C3H/HeJ小鼠肺組織細(xì)菌載量顯著高于野生型C3H/HeN小鼠，表明TLR4缺陷型C3H/HeJ小鼠體內(nèi)細(xì)菌清除能力受損。這些結(jié)果表明，TLR4信號傳導(dǎo)在宿主對抗銅綠假單胞菌感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。有研究表明，與 TLR4野生型小鼠相比，TLR4突變小鼠對丁基化羥基甲苯(BHT)誘導(dǎo)的肺炎更易感[25]。而且BHT處理后，TLR4 野生型小鼠中獨(dú)特的先天免疫細(xì)胞群與TLR4 突變小鼠中的不同[25]。此外，TLR4 在革蘭陰性菌的吞噬中也起著至關(guān)重要的作用[26]。

先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)通過發(fā)現(xiàn)、中和、破壞或排出病原體，有助于宿主抵抗感染[27-29]。但對病原體的破壞和消除常常伴隨著正常組織結(jié)構(gòu)或功能的損傷[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，和C3H/HeJ小鼠相比，雖然野生型C3H/HeN小鼠感染銅綠假單胞菌的致病性和細(xì)菌載量更低，但感染后期的組織學(xué)病變及肺水腫程度更嚴(yán)重，表明野生型小鼠肺損傷更嚴(yán)重。細(xì)菌抗原通過激活Toll樣受體產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，使轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的其他細(xì)胞因子的合成，使肺毛細(xì)血管通透性增加，并從循環(huán)中募集中性粒細(xì)胞[32]。由于炎癥介質(zhì)、毒素、蛋白酶導(dǎo)致的肺細(xì)胞死亡使肺泡上皮基底膜暴露，使肺損傷進(jìn)一步加重[33]。募集的中性粒細(xì)胞，進(jìn)一步產(chǎn)生其他細(xì)胞因子，放大和維持炎癥，對肺組織造成持續(xù)的損傷[32]。免疫防御對宿主產(chǎn)生的這種負(fù)面影響被稱為免疫病理[34]，細(xì)菌對宿主的致病性是宿主免疫防御與免疫病理共同作用的結(jié)果，最佳的免疫應(yīng)答應(yīng)使有效病原體清除力和免疫病理達(dá)到平衡。因此，需要更深入地研究TLR4信號的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，以治療嚴(yán)重細(xì)菌感染。

4 結(jié) 論

致死劑量的銅綠假單胞菌感染后，相比于野生型小鼠，TLR4缺失型小鼠臨床癥狀更為嚴(yán)重，存活時間縮短，細(xì)菌載量增高，促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生減少。TLR4蛋白缺失顯著增加了銅綠假單胞菌對小鼠的致病性，表明TLR4在宿主對抗銅綠假單胞菌感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用。