李淑敏，肖志彬，田增奎，陳振謹(jǐn)

（1.天津河西醫(yī)院藥劑科，天津 300202；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

胰腺炎為常見消化系統(tǒng)疾病，病死率為15%～30%［1］，其發(fā)病時常伴多器官衰竭，肺損傷為常見并發(fā)癥之一。肺損傷的嚴(yán)重程度與胰腺炎患者的住院時間、預(yù)后等密切相關(guān)［2］。Rho/ROCK通路是與哮喘、肺動脈高壓、肺纖維化等呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［3］。該通路的異常表達(dá)是導(dǎo)致肺組織損傷等病理學(xué)變化的重要原因［4］。百令膠囊具有補肺益腎功效，治療肺損傷的療效顯著［5］。本研究中探討了百令膠囊對急性胰腺炎模型大鼠肺損傷的修復(fù)作用，為該制劑的藥理學(xué)機制研究提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：Multiskan Sky型全波長酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技有限公司）；EasyStat型全自動血氣分析儀（美國Medica公司）；OmegaFluor型凝膠成像儀（美國Aplegen公司）；CKX53型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；RM2235型石蠟切片機（德國Leica公司）；Neofuge 23R型臺式高速冷凍離心機（力康國際貿(mào)易＜上海＞有限公司）；C1000型Touch聚合酶鏈反應(yīng)儀（美國Bio-Rad公司）；Oven125型烘箱（艾卡儀器設(shè)備有限公司）。

試藥：百令膠囊（杭州中美華東制藥有限公司，批號為20191102）；鹽酸法舒地爾注射液（天津紅日藥業(yè)股份有限公司，批號為2018131）；?；悄懰徕c（北京諾博萊德科技有限公司，批號為1105261）；Trizol試劑、SYBR Green PCR Master Mix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司，批號分別為21065，11431，72401）；RhoA、Rho激酶1（ROCK1）、GAPDH兔單克隆抗體、Rho激酶2（ROCK2）兔多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（碧云天生物技術(shù)公司，批號分別為13140，62809，17165，12203，31781）；高效RIPA裂解液、ECL Plus超敏發(fā)光液、蘇木素-伊紅（HE）染色劑、淀粉酶、白細(xì)胞介素6（IL-6）試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNFα）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、BCA試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為483121，567121，103217，652311，212631，403417，118910，707830）；髓過氧化物酶試劑盒（MPO，上海廣銳生物科技有限公司，批號為GRDS13-178）；活性氧試劑盒（ROS，武漢恒意賽生物科技有限公司，批號為ELK7244）。

動物：健康清潔級成年Wistar大鼠72只，雄性，體質(zhì)量180～200 g，均購自豪威生物科技有限公司，實驗動物許可證號為SYXK（津）2019-0002。飼養(yǎng)于動物使用房，12 h/12 h明暗交替，溫度（23±1）℃，相對濕度40%～70%。

1.2 方法

將72只大鼠隨機分為假手術(shù)組（等體積生理鹽水灌胃），模型組（等體積生理鹽水灌胃），百令膠囊低、中、高劑量組（1，2，4 g/kg灌胃）及法舒地爾組（30 mg/kg腹腔注射），各12只。除假手術(shù)組外，其余5組大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，沿腹部正中線切開，以0.2 mL/min的速率向胰膽管內(nèi)注射4%牛磺膽酸鈉（1 mL/kg），以復(fù)制胰腺炎大鼠模型；注射后關(guān)腹，以術(shù)后2 d大鼠出現(xiàn)耳緣靜脈變粗突起，呼吸急促，肺部聽診出現(xiàn)濕羅音為建模成功［6-7］。假手術(shù)組大鼠僅開腹暴露十二指腸后關(guān)腹。建模成功后，各組大鼠均予相應(yīng)藥物或生理鹽水，每天1次，連續(xù)5 d［8-10］。

1.3 觀察指標(biāo)

血清淀粉酶及炎性因子：末次給藥后，取大鼠腹主動脈血液，4℃下靜置2 h，8 000 r/min離心10 min，分離血清，收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測血清淀粉酶、IL-6、TNF-α的水平。

肺功能指標(biāo)：取腹主動脈血，采用血氣分析儀檢測動脈血二氧化碳分壓（PaCO2）、氧分壓（PaO2），計算氧合指數(shù)（OI）。OI=PaO2/吸入氧濃度（FiO2）。

肺組織濕干質(zhì)量比（W/D）及MPO，SOD，ROS：每組取6只大鼠，取右肺下葉，稱定的質(zhì)量記為濕質(zhì)量（W），將其置80℃烘箱中烘烤至恒重，稱定的質(zhì)量記為干質(zhì)量（D），計算W/D。每組另取6只大鼠肺組織，采用ELISA法檢測肺組織MPO，SOD，ROS的水平。

肺組織病理形態(tài)學(xué)：取大鼠肺組織，用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片（厚度為5μm），用二甲苯脫蠟、梯度乙醇復(fù)水后，HE染色，顯微鏡下觀察。

肺組織RhoA，ROCK1，ROCK2 mRNA表達(dá)：采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RTq-PCR）法。取大鼠肺組織適量，以Trizol試劑提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)水平。PCR條件為94℃30 s；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，30個循環(huán)?；蛞镄畔⒁姳?。

表1 各基因引物信息Tab.1 Primer sequences of genes

肺組織RhoA，ROCK1，ROCK2蛋白表達(dá)：采用Western blot法。取大鼠肺組織適量，加入蛋白裂解液，勻漿，以BCA法測定樣品的蛋白濃度。樣品經(jīng)變性后上樣，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量蛋白樣品，并將蛋白條帶轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，封閉（5%脫脂奶粉），加RhoA抗體（1∶500）、ROCK1抗體（1∶500）、ROCK2抗體（1∶500）及GAPDH抗體（1∶500），孵育過夜，清洗3次，加二抗山羊抗兔IgG（1∶1 000），室溫下孵育40 min，清洗3次，加入化學(xué)發(fā)光試劑，顯色。采用Image J軟件分析蛋白相對表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 血清淀粉酶、IL-6及TNF-α

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清淀粉酶、IL-6及TNF-α水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，百令膠囊低、中、高劑量組及法舒地爾組大鼠血清淀粉酶、IL-6、TNF-α水平均顯著降低（P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠血清淀粉酶、IL-6及TNF-α水平比較（±s，n=12）Tab.2 Comparison of serum amylase，IL-6 and TNF-αlevels of rats in each group （±s，n=12）

表2 各組大鼠血清淀粉酶、IL-6及TNF-α水平比較（±s，n=12）Tab.2 Comparison of serum amylase，IL-6 and TNF-αlevels of rats in each group （±s，n=12）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。表3至表5、圖2同。Note：Compared with those in the sham operation group，*P＜0.05（for Tab.2-5，F(xiàn)ig.2）；Compared with those in the model group，#P＜0.05（for Tab.2-5，F(xiàn)ig.2）.

IL-6（pg/mL）42.76±1.26 148.66±2.18*107.85±2.81#84.47±1.81#50.85±1.43#58.40±1.13#組別假手術(shù)組模型組百令膠囊低劑量組百令膠囊中劑量組百令膠囊高劑量組法舒地爾組血清淀粉酶（U/L）1 053.27±24.17 4 128.61±15.63*3 370.59±13.94#2 660.12±27.45#1 245.73±31.25#2 178.17±43.37#TNF-α（pg/mL）29.39±0.89 90.14±1.05*78.59±1.77#61.67±0.92#41.77±1.22#52.40±1.38#

2.2 肺功能及肺組織W/D

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠動脈血PaCO2、肺組織W/D均顯著升高（P＜0.05），PaO2和OI顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，百令膠囊低、中、高劑量組及法舒地爾組大鼠PaCO2、肺組織W/D均顯著降低（P＜0.05），PaO2和OI均顯著升高（P＜0.05）。詳見表3。

表3 各組大鼠PaCO2，PaO2，OI及肺組織W/D水平比較（±s，n=12）Tab.3 Comparison of PaCO2，PaO2，OI and lung tissue W/D levels of rats in each group（±s，n=12）

表3 各組大鼠PaCO2，PaO2，OI及肺組織W/D水平比較（±s，n=12）Tab.3 Comparison of PaCO2，PaO2，OI and lung tissue W/D levels of rats in each group（±s，n=12）

組別假手術(shù)組模型組百令膠囊低劑量組百令膠囊中劑量組百令膠囊高劑量組法舒地爾組PaCO2（mmHg）33.69±0.97 62.01±1.24*53.06±1.48#46.68±1.31#37.77±0.79#43.69±1.52#PaO2（mmHg）90.86±1.31 47.99±2.95*57.70±0.96#72.24±1.19#84.99±1.17#77.34±1.53#OI（mmHg）419.43±5.44 213.8±3.47*298.82±5.80#347.24±4.59#404.71±4.08#368.27±3.18#W/D 3.91±0.73 6.57±1.60*5.54±1.23#4.91±0.91#4.28±0.62#4.82±0.77#

2.3 肺組織MPO，SOD，ROS

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織MPO及ROS水平均顯著升高（P＜0.05），SOD水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，百令膠囊低、中、高劑量組及法舒地爾組大鼠肺組織MPO及ROS水平均顯著降低（P＜0.05），SOD水平顯著升高（P＜0.05）。詳見表4。

表4 各組大鼠肺組織MPO，SOD，ROS水平比較（±s，n=6）Tab.4 Comparison of MPO，SOD and ROS levels in lung tissue of rats in each group（±s，n=6）

表4 各組大鼠肺組織MPO，SOD，ROS水平比較（±s，n=6）Tab.4 Comparison of MPO，SOD and ROS levels in lung tissue of rats in each group（±s，n=6）

組別假手術(shù)組模型組百令膠囊低劑量組百令膠囊中劑量組百令膠囊高劑量組法舒地爾組MPO（U/gprot）0.81±0.09 3.89±0.17*2.74±0.11#1.86±0.12#1.03±0.04#1.16±0.15#SOD（U/mgprot）117.08±3.20 42.86±1.55*62.58±1.16#78.11±1.09#95.26±1.23#88.10±1.44#ROS（U/mgprot）20.43±0.78 86.52±1.18*71.51±1.30#56.12±1.12#43.95±1.71#46.33±0.74#

2.4 肺組織病理形態(tài)學(xué)

假手術(shù)組大鼠肺組織未見明顯病理形態(tài)學(xué)變化；模型組大鼠肺組織出現(xiàn)明顯炎性浸潤，毛細(xì)血管充血、水腫，肺間隔增厚；百令膠囊低、中、高劑量組及法舒地爾組大鼠肺組織炎性浸潤、組織結(jié)構(gòu)均較模型組大鼠明顯改善。詳見圖1。

圖1 大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)（HE，×200）A.Sham operation group B.Model group C.Bailing Capsules low-dose group D.Bailing Copsules medium-dose group E.Bailing Capsules high-dose group F.Fasudil groupFig.1 Pathological morphology of lung tissue of rats（HE staining，×200）

2.5肺組織RhoA，ROCK1，ROCK2 mRNA水平

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織mRNA水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，百令膠囊低、中、高劑量組及法舒地爾組大鼠肺組織RhoA，ROCK1，ROCK2 mRNA水平均顯著降低（P＜0.05）。詳見表5。

表5 各組大鼠肺組織RhoA，ROCK1，ROCK2 mRNA水平比較（X±s，n=12）Tab.5 Comparison of RhoA，ROCK1 and ROCK2 mRNA levels in lung tissue of rats in each group（X±s，n=12）

2.6肺組織RhoA，ROCK1，ROCK2蛋白水平

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織RhoA，ROCK1，ROCK2蛋白水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，百令膠囊低、中、高劑量組及法舒地爾組大鼠肺組織RhoA，ROCK1，ROCK2蛋白水平均顯著降低（P＜0.05）。詳見圖2。

圖2各組大鼠肺組織RhoA，ROCK1，ROCK2蛋白水平A.Electroploregogram B.Data statisticsFig.2 RhoA，ROCK1 and ROCK2 protein levels in lung tissue of rats in each group

3 討論

胰腺炎是由于膽道系統(tǒng)疾病、高脂血癥等導(dǎo)致胰腺被胰蛋白酶自身消化，進(jìn)而引發(fā)胰腺水腫、壞死，發(fā)熱、腹痛等癥狀的全身性疾病。肺損傷是胰腺炎的常見并發(fā)癥，胰腺炎肺損傷患者的病死率高達(dá)60%，故對于肺損傷的治療是影響胰腺炎患者預(yù)后及病死率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［11］。目前，主要采用對癥治療，但尚未發(fā)現(xiàn)藥理學(xué)作用及機制相對明確的藥物。

百令膠囊是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)、主要由發(fā)酵冬蟲夏草菌粉制成的中成藥，具有補肺益腎等功效，臨床用于治療咳嗽、氣喘、面目浮腫等癥。衷敬華等［12］的研究表明，百令膠囊能降低肺損傷模型大鼠體內(nèi)IL-6，TNF-α，TGF-β1等炎性因子水平，進(jìn)而抑制肺泡炎性反應(yīng)及纖維化進(jìn)展。徐金芬等［13］的研究發(fā)現(xiàn)，百令膠囊能明顯降低放射性肺炎及肺纖維化的發(fā)生率，以及肺損傷患者體內(nèi)降鈣素原及C反應(yīng)蛋白水平，減輕放療相關(guān)性肺損傷程度?？梢?，百令膠囊治療肺損傷具有潛力。

血清淀粉酶水平升高是胰腺炎發(fā)病的典型表現(xiàn)，IL-6和TNF-α作為重要的炎性因子，在胰腺炎的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。劉雋等［14］的研究表明，胰腺炎模型小鼠血清淀粉酶、IL-6及TNF-α水平均明顯升高，降低IL-6及TNF-α水平能明顯阻止模型小鼠胰腺炎的病情進(jìn)展。欒曉峰等［15］的研究發(fā)現(xiàn)，胰腺炎患者血清TNF-α和IL-6水平均明顯升高，清胰湯可降低患者血清TNF-α及IL-6水平，抑制炎性反應(yīng)，并降低胃腸激素水平，進(jìn)而緩解患者的臨床癥狀；PaCO2，PaO2，OI是反映肺功能的重要指標(biāo)，且與肺損傷預(yù)后及病理進(jìn)展密切相關(guān)。楊永康等［16］的研究發(fā)現(xiàn)，胰腺炎肺損傷模型大鼠肺組織充血水腫，PaCO2升高，PaO2及OI明顯降低；MPO，ROS，SOD參與氧化應(yīng)激損傷的發(fā)生，肺損傷大鼠MPO和ROS水平升高及SOD水平降低均會加重模型大鼠肺組織氧化損傷程度，促進(jìn)炎性因子釋放，而降低MPO和ROS水平，升高SOD水平，能減輕大鼠炎性級聯(lián)放大效應(yīng)，修復(fù)肺損傷［17］。本研究結(jié)果表明，百令膠囊能明顯抑制胰腺炎肺損傷模型大鼠炎性因子的釋放，恢復(fù)肺功能，提高肺組織抗氧化損傷的能力。

Rho/ROCK通路被證明與肺損傷密切相關(guān)。張琳等［18］研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素引起的肺損傷與Rho/ROCK通路過度激活有關(guān)，利多卡因能通過抑制Rho/ROCK通路的活性，發(fā)揮抗炎及修復(fù)作用。汪文淑等［9］的研究表明，慢性阻塞性肺疾病并肺動脈高壓模型大鼠的肺血管損傷，與其體內(nèi)Rho/ROCK通路相關(guān)蛋白的過表達(dá)有關(guān)，應(yīng)用Rho/ROCK通路抑制劑能明顯阻止肺組織血管重構(gòu)，改善肺損傷。丁仁彧等［19］報道了膿毒癥引起的肺損傷也與Rho激酶的激活有關(guān)，抑制Rho激酶活性可緩解肺損傷，減少肺積液。本研究結(jié)果提示，百令膠囊可能通過抑制Rho/ROCK通路，進(jìn)而抑制胰腺炎肺損傷進(jìn)展，并修復(fù)模型大鼠肺組織炎性改變。

綜上所述，百令膠囊能通過改善急性胰腺炎肺損傷模型大鼠的肺功能，抑制炎性因子釋放及氧化損傷，其機制可能與抑制Rho/ROCK通路有關(guān)。