張震,李孟露,趙振坤,蘇新明
(中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第一醫(yī)院呼吸疾病研究所,沈陽(yáng) 110001;2.附屬第四醫(yī)院病理科,沈陽(yáng) 110032)
支氣管哮喘是一種常見(jiàn)的慢性氣道炎癥性疾病,主要特征為氣道炎癥、氣道高反應(yīng)和氣道重塑[1]。目前控制哮喘發(fā)作的主要藥物是糖皮質(zhì)激素,但已有研究[2]表明,部分哮喘患者已出現(xiàn)了激素抵抗現(xiàn)象,且長(zhǎng)期使用激素可能產(chǎn)生肥胖、高血壓等不良反應(yīng)。百令膠囊是由傳統(tǒng)高原中藥冬蟲夏草經(jīng)發(fā)酵制成[3],有研究[4]報(bào)道百令膠囊對(duì)支氣管哮喘有一定的治療作用,而且與西藥聯(lián)合使用可降低激素用量、減少不良反應(yīng)、有效控制癥狀。本研究旨在探討百令膠囊對(duì)支氣管哮喘小鼠氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)的治療作用。
6~8周齡Balb/c雌性小鼠48只,體質(zhì)量(20±3)g,按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組:正常對(duì)照組、支氣管哮喘組、布地奈德組、低劑量百令膠囊組、中劑量百令膠囊組、高劑量百令膠囊組,每組8只。于實(shí)驗(yàn)第 0、7、14天,分別給予支氣管哮喘組、布地奈德組和低劑量百令膠囊組、中劑量百令膠囊組、高劑量百令膠囊組小鼠卵清蛋白(ovalbumin,OVA,20 μg)和氫氧化鋁凝膠(2 mg)致敏。末次致敏7 d 后,除正常對(duì)照組外,其余5組均以2% OVA(20 mg/mL)超聲霧化(3 mL/min)進(jìn)行激發(fā)實(shí)驗(yàn),30 min/次,3次/周,共8周。每次激發(fā)實(shí)驗(yàn)前30 min,布地奈德組小鼠給予布地奈德(2 mg)霧化給藥,低劑量百令膠囊組、中劑量百令膠囊組、高劑量百令膠囊組分別給予1.875 g/kg、3.75 g/kg、6.25 g/kg百令膠囊灌胃給藥。正常對(duì)照組致敏和激發(fā)實(shí)驗(yàn)中藥品均用生理鹽水代替。
末次激發(fā)實(shí)驗(yàn)24 h后,應(yīng)用EMKA小動(dòng)物肺功能檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定氣道阻力。將小鼠放入密閉的體描箱中,給予不同濃度的乙酰膽堿(0、3.125、6.25、12.5、25、50 mg/mL)激發(fā),采集增強(qiáng)呼氣間歇(enhanced pause,Penh)值3 min,用于反映氣道阻力。
各組小鼠肺功能檢測(cè)結(jié)束后,水合氯醛麻醉,行支氣管肺泡灌洗,回收BALF并記錄回吸收量,回吸收量>1.2 mL為合格標(biāo)本。肺泡灌洗液4 ℃、1 200 r/min離心10 min,離心沉淀細(xì)胞用0.4 mL Hanks液重懸混勻,顯微鏡下計(jì)數(shù)BALF中細(xì)胞總數(shù)。
肺泡灌洗后取6組小鼠左肺組織進(jìn)行石蠟包埋切片,分別行HE染色、AB-PAS染色、Masson 染色。
1.4.1 HE染色:石蠟切片脫蠟至水,蘇木素染色3~5 min,自來(lái)水沖洗5 min,室溫下鹽酸乙醇分化3 s,自來(lái)水沖洗30 min 返藍(lán),伊紅染液復(fù)染1~2 min,自來(lái)水輕度沖洗,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。光鏡下觀察比較各組小鼠肺組織炎癥改變。
1.4.2 AB-PAS染色:石蠟切片脫蠟至水,阿利新藍(lán)染色10~20 min,蒸餾水洗去浮色,0.5%高碘酸水溶液氧化5~10 min,蒸餾水洗去浮色,Schiff試劑染色15 min,流水沖洗10 min,蘇木素染核5 min,水洗,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。光鏡下觀察氣道上皮杯狀細(xì)胞增生改變。
1.4.3 Masson 染色:石蠟切片脫蠟至水,Weigert氏鐵蘇木素染色5 min,蒸餾水洗去浮色,1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒,流水沖洗數(shù)分鐘返藍(lán)。麗春紅酸性品紅液染色5~10 min,蒸餾水洗去浮色。磷鉬酸水溶液處理約3~5 min,不用水洗,苯胺藍(lán)液復(fù)染5 min,1%冰醋酸處理1 min。梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。光鏡下觀察上皮下膠原沉積改變。
采用SP法行肺組織α-SMA免疫組織化學(xué)染色。石蠟切片脫蠟至水,H2O2孵育5 min,微波爐抗原修復(fù)3次,6 min/次,10%胎牛血清常溫封閉30 min,α-SMA一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜。二抗(1 ∶500)孵育60 min,顯微鏡下控制DAB顯色,復(fù)染,脫水,透明,封片。
小鼠氣道阻力與乙酰膽堿具有濃度依賴性。與支氣管哮喘組相比,低劑量百令膠囊組、中劑量百令膠囊組、高劑量百令膠囊組小鼠氣道阻力均明顯降低(P< 0.05),與布地奈德組相似,說(shuō)明百令膠囊能夠有效緩解哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性。見(jiàn)表1。
表1 各組小鼠不同濃度乙酰甲膽堿刺激后Penh值Tab.1 Penh values of mice in different groups following stimulation with acetylcholine
正常對(duì)照組、支氣管哮喘組、布地奈德組、低劑量百令膠囊組、中劑量百令膠囊組、高劑量百令膠囊組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)分別為(5.96±5.25)×104/mL、(90.84±9.94)×104/mL、(35.06±6.85)×104/mL、(82.11±9.80)×104/mL、(59.11±11.86)×104/mL、(54.06±4.90)×104/mL。支氣管哮喘組BALF中細(xì)胞總數(shù)顯著高于正常對(duì)照組(P< 0.05)。與支氣管哮喘組相比,布地奈德組、低劑量百令膠囊組、中劑量百令膠囊組、高劑量百令膠囊組BALF中細(xì)胞總數(shù)均顯著下降(P< 0.05)。且布地奈德組BALF中細(xì)胞總數(shù)低于低劑量百令膠囊組、中劑量百令膠囊組和高劑量百令膠囊組(P< 0.05)。
HE染色結(jié)果顯示,正常對(duì)照組小鼠氣道周圍無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);支氣管哮喘組小鼠氣道黏膜層及黏膜下層可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);與支氣管哮喘組相比,布地奈德組及低劑量百令膠囊組、中劑量百令膠囊組、高劑量百令膠囊組小鼠氣道和血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均明顯減少,平滑肌增厚減輕。見(jiàn)圖1。
圖1 肺組織HE染色 ×200Fig.1 HE staining of the lung tissue ×200
AB-PAS染色結(jié)果顯示,正常對(duì)照組小鼠氣道上皮僅有少量PAS陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá);支氣管哮喘組PAS陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加,氣道黏液分泌增多;布地奈德組及低劑量百令膠囊組、中劑量百令膠囊組、高劑量百令膠囊組杯狀細(xì)胞化生均減輕。見(jiàn)圖2。
圖2 肺組織AB-PAS染色 ×200Fig.2 AB-PAS staining of the lung tissue ×200
Masson染色顯示,支氣管哮喘組小鼠氣道黏膜中可見(jiàn)大量膠原纖維沉積,上皮下纖維化增加;與支氣管哮喘組相比,布地奈德組及低劑量百令膠囊組、中劑量百令膠囊組、高劑量百令膠囊組上皮下纖維化、氣道壁周圍膠原沉積均明顯減輕。見(jiàn)圖3。
圖3 肺組織Masson染色 ×200Fig.3 Masson staining of the lung tissue ×200
免疫組化染色結(jié)果顯示,支氣管哮喘組小鼠氣道平滑肌層α-SMA表達(dá)水平顯著增加,平滑肌增厚;與支氣管哮喘組相比,布地奈德組及低劑量百令膠囊組、中劑量百令膠囊組、高劑量百令膠囊組小鼠肺組織內(nèi)α-SMA表達(dá)均減少。見(jiàn)圖4。
圖4 肺組織α-SMA免疫組化染色 ×200Fig.4 α-SMA immunohistochemical staining of the lung tissue ×200
支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病,其病理特征是氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)[5-6]。長(zhǎng)期的炎癥刺激和反復(fù)發(fā)作的喘息,導(dǎo)致氣道高反應(yīng)和氣道結(jié)構(gòu)改變[7]。百令膠囊是由傳統(tǒng)的高原中藥冬蟲夏草經(jīng)發(fā)酵而形成,主要由甘露糖醇、蟲草酸、生物堿、氨基酸等相關(guān)元素構(gòu)成[8]。有研究[9]報(bào)道,百令膠囊在治療支氣管哮喘上有一定作用,能顯著抑制嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥的進(jìn)展,減輕氣道高反應(yīng),并且與西藥聯(lián)合應(yīng)用可降低激素的用量,減輕不良反應(yīng),說(shuō)明百令膠囊在治療支氣管哮喘上有一定的優(yōu)勢(shì)。本研究的目的是明確百令膠囊在支氣管哮喘小鼠氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)中的作用。
本研究成功復(fù)制出具有典型氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)特征的慢性哮喘小鼠模型,發(fā)現(xiàn)百令膠囊可減少哮喘小鼠BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù),緩解肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和氣管上皮杯狀細(xì)胞化生,減少哮喘中黏液高分泌和上皮下纖維化。但與抗炎、抗氣道重塑效果極佳的布地奈德相比,百令膠囊的上述治療效果不如布地奈德理想,說(shuō)明百令膠囊在治療哮喘時(shí)抗炎、抗氣道重塑作用有限。但值得注意的是,百令膠囊能顯著抑制哮喘小鼠氣道高反應(yīng),且效果不輸于布地奈德,說(shuō)明百令膠囊在抑制哮喘小鼠氣道高反應(yīng)上具有獨(dú)特的療效。
近年來(lái),大量基礎(chǔ)和臨床研究表明,百令膠囊在治療支氣管哮喘上具有顯著作用。有研究[10]表明,百令膠囊可以調(diào)節(jié)支氣管哮喘的免疫失衡,聯(lián)合西藥可快速改善急性發(fā)作期哮喘患者的臨床癥狀,改善動(dòng)脈血?dú)猓档脱装Y水平,提高肺功能,從而提高臨床治療有效率。本研究也證明,百令膠囊可以抑制慢性哮喘小鼠氣道炎癥、氣道高反應(yīng)和氣道重塑,尤其在治療氣道高反應(yīng)上,百令膠囊與激素效果相當(dāng)。
綜上所述,百令膠囊在哮喘的治療中可能發(fā)揮重要作用,未來(lái)有望作為哮喘治療的藥物。同時(shí),百令膠囊聯(lián)合激素治療哮喘,可能改善患者的預(yù)后,減少不良反應(yīng)。