張震，李孟露，趙振坤，蘇新明

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第一醫(yī)院呼吸疾病研究所，沈陽(yáng) 110001；2.附屬第四醫(yī)院病理科，沈陽(yáng) 110032）

支氣管哮喘是一種常見(jiàn)的慢性氣道炎癥性疾病，主要特征為氣道炎癥、氣道高反應(yīng)和氣道重塑［1］。目前控制哮喘發(fā)作的主要藥物是糖皮質(zhì)激素，但已有研究［2］表明，部分哮喘患者已出現(xiàn)了激素抵抗現(xiàn)象，且長(zhǎng)期使用激素可能產(chǎn)生肥胖、高血壓等不良反應(yīng)。百令膠囊是由傳統(tǒng)高原中藥冬蟲夏草經(jīng)發(fā)酵制成［3］，有研究［4］報(bào)道百令膠囊對(duì)支氣管哮喘有一定的治療作用，而且與西藥聯(lián)合使用可降低激素用量、減少不良反應(yīng)、有效控制癥狀。本研究旨在探討百令膠囊對(duì)支氣管哮喘小鼠氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和哮喘模型制備

6～8周齡Balb/c雌性小鼠48只，體質(zhì)量（20±3）g，按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組：正常對(duì)照組、支氣管哮喘組、布地奈德組、低劑量百令膠囊組、中劑量百令膠囊組、高劑量百令膠囊組，每組8只。于實(shí)驗(yàn)第 0、7、14天，分別給予支氣管哮喘組、布地奈德組和低劑量百令膠囊組、中劑量百令膠囊組、高劑量百令膠囊組小鼠卵清蛋白（ovalbumin，OVA，20 μg）和氫氧化鋁凝膠（2 mg）致敏。末次致敏7 d 后，除正常對(duì)照組外，其余5組均以2% OVA（20 mg/mL）超聲霧化（3 mL/min）進(jìn)行激發(fā)實(shí)驗(yàn)，30 min/次，3次/周，共8周。每次激發(fā)實(shí)驗(yàn)前30 min，布地奈德組小鼠給予布地奈德（2 mg）霧化給藥，低劑量百令膠囊組、中劑量百令膠囊組、高劑量百令膠囊組分別給予1.875 g/kg、3.75 g/kg、6.25 g/kg百令膠囊灌胃給藥。正常對(duì)照組致敏和激發(fā)實(shí)驗(yàn)中藥品均用生理鹽水代替。

1.2 小鼠氣道反應(yīng)性測(cè)定

末次激發(fā)實(shí)驗(yàn)24 h后，應(yīng)用EMKA小動(dòng)物肺功能檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定氣道阻力。將小鼠放入密閉的體描箱中，給予不同濃度的乙酰膽堿（0、3.125、6.25、12.5、25、50 mg/mL）激發(fā)，采集增強(qiáng)呼氣間歇（enhanced pause，Penh）值3 min，用于反映氣道阻力。

1.3 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）細(xì)胞計(jì)數(shù)

各組小鼠肺功能檢測(cè)結(jié)束后，水合氯醛麻醉，行支氣管肺泡灌洗，回收BALF并記錄回吸收量，回吸收量＞1.2 mL為合格標(biāo)本。肺泡灌洗液4 ℃、1 200 r/min離心10 min，離心沉淀細(xì)胞用0.4 mL Hanks液重懸混勻，顯微鏡下計(jì)數(shù)BALF中細(xì)胞總數(shù)。

1.4 肺組織炎癥、膠原沉積和杯狀細(xì)胞觀察

肺泡灌洗后取6組小鼠左肺組織進(jìn)行石蠟包埋切片，分別行HE染色、AB-PAS染色、Masson 染色。

1.4.1 HE染色：石蠟切片脫蠟至水，蘇木素染色3～5 min，自來(lái)水沖洗5 min，室溫下鹽酸乙醇分化3 s，自來(lái)水沖洗30 min 返藍(lán)，伊紅染液復(fù)染1～2 min，自來(lái)水輕度沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察比較各組小鼠肺組織炎癥改變。

1.4.2 AB-PAS染色：石蠟切片脫蠟至水，阿利新藍(lán)染色10～20 min，蒸餾水洗去浮色，0.5%高碘酸水溶液氧化5～10 min，蒸餾水洗去浮色，Schiff試劑染色15 min，流水沖洗10 min，蘇木素染核5 min，水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察氣道上皮杯狀細(xì)胞增生改變。

1.4.3 Masson 染色：石蠟切片脫蠟至水，Weigert氏鐵蘇木素染色5 min，蒸餾水洗去浮色，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，流水沖洗數(shù)分鐘返藍(lán)。麗春紅酸性品紅液染色5～10 min，蒸餾水洗去浮色。磷鉬酸水溶液處理約3～5 min，不用水洗，苯胺藍(lán)液復(fù)染5 min，1%冰醋酸處理1 min。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察上皮下膠原沉積改變。

1.5 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）免疫組織化學(xué)染色

采用SP法行肺組織α-SMA免疫組織化學(xué)染色。石蠟切片脫蠟至水，H2O2孵育5 min，微波爐抗原修復(fù)3次，6 min/次，10%胎牛血清常溫封閉30 min，α-SMA一抗（1 ∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜。二抗（1 ∶500）孵育60 min，顯微鏡下控制DAB顯色，復(fù)染，脫水，透明，封片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 百令膠囊抑制哮喘小鼠氣道高反應(yīng)

小鼠氣道阻力與乙酰膽堿具有濃度依賴性。與支氣管哮喘組相比，低劑量百令膠囊組、中劑量百令膠囊組、高劑量百令膠囊組小鼠氣道阻力均明顯降低（P＜ 0.05），與布地奈德組相似，說(shuō)明百令膠囊能夠有效緩解哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠不同濃度乙酰甲膽堿刺激后Penh值Tab.1 Penh values of mice in different groups following stimulation with acetylcholine

2.2 百令膠囊減少哮喘小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)

正常對(duì)照組、支氣管哮喘組、布地奈德組、低劑量百令膠囊組、中劑量百令膠囊組、高劑量百令膠囊組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)分別為（5.96±5.25）×104/mL、（90.84±9.94）×104/mL、（35.06±6.85）×104/mL、（82.11±9.80）×104/mL、（59.11±11.86）×104/mL、（54.06±4.90）×104/mL。支氣管哮喘組BALF中細(xì)胞總數(shù)顯著高于正常對(duì)照組（P＜ 0.05）。與支氣管哮喘組相比，布地奈德組、低劑量百令膠囊組、中劑量百令膠囊組、高劑量百令膠囊組BALF中細(xì)胞總數(shù)均顯著下降（P＜ 0.05）。且布地奈德組BALF中細(xì)胞總數(shù)低于低劑量百令膠囊組、中劑量百令膠囊組和高劑量百令膠囊組（P＜ 0.05）。

2.3 百令膠囊抑制小鼠氣道炎癥

HE染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠氣道周圍無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；支氣管哮喘組小鼠氣道黏膜層及黏膜下層可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與支氣管哮喘組相比，布地奈德組及低劑量百令膠囊組、中劑量百令膠囊組、高劑量百令膠囊組小鼠氣道和血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均明顯減少，平滑肌增厚減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 肺組織HE染色 ×200Fig.1 HE staining of the lung tissue ×200

2.4 百令膠囊抑制哮喘氣道黏液高分泌

AB-PAS染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠氣道上皮僅有少量PAS陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)；支氣管哮喘組PAS陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加，氣道黏液分泌增多；布地奈德組及低劑量百令膠囊組、中劑量百令膠囊組、高劑量百令膠囊組杯狀細(xì)胞化生均減輕。見(jiàn)圖2。

圖2 肺組織AB-PAS染色 ×200Fig.2 AB-PAS staining of the lung tissue ×200

2.5 百令膠囊抑制哮喘膠原沉積

Masson染色顯示，支氣管哮喘組小鼠氣道黏膜中可見(jiàn)大量膠原纖維沉積，上皮下纖維化增加；與支氣管哮喘組相比，布地奈德組及低劑量百令膠囊組、中劑量百令膠囊組、高劑量百令膠囊組上皮下纖維化、氣道壁周圍膠原沉積均明顯減輕。見(jiàn)圖3。

圖3 肺組織Masson染色 ×200Fig.3 Masson staining of the lung tissue ×200

2.6 百令膠囊抑制肺組織中α-SMA的表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示，支氣管哮喘組小鼠氣道平滑肌層α-SMA表達(dá)水平顯著增加，平滑肌增厚；與支氣管哮喘組相比，布地奈德組及低劑量百令膠囊組、中劑量百令膠囊組、高劑量百令膠囊組小鼠肺組織內(nèi)α-SMA表達(dá)均減少。見(jiàn)圖4。

圖4 肺組織α-SMA免疫組化染色 ×200Fig.4 α-SMA immunohistochemical staining of the lung tissue ×200

3 討論

支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，其病理特征是氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)［5-6］。長(zhǎng)期的炎癥刺激和反復(fù)發(fā)作的喘息，導(dǎo)致氣道高反應(yīng)和氣道結(jié)構(gòu)改變［7］。百令膠囊是由傳統(tǒng)的高原中藥冬蟲夏草經(jīng)發(fā)酵而形成，主要由甘露糖醇、蟲草酸、生物堿、氨基酸等相關(guān)元素構(gòu)成［8］。有研究［9］報(bào)道，百令膠囊在治療支氣管哮喘上有一定作用，能顯著抑制嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥的進(jìn)展，減輕氣道高反應(yīng)，并且與西藥聯(lián)合應(yīng)用可降低激素的用量，減輕不良反應(yīng)，說(shuō)明百令膠囊在治療支氣管哮喘上有一定的優(yōu)勢(shì)。本研究的目的是明確百令膠囊在支氣管哮喘小鼠氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)中的作用。

本研究成功復(fù)制出具有典型氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)特征的慢性哮喘小鼠模型，發(fā)現(xiàn)百令膠囊可減少哮喘小鼠BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)，緩解肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和氣管上皮杯狀細(xì)胞化生，減少哮喘中黏液高分泌和上皮下纖維化。但與抗炎、抗氣道重塑效果極佳的布地奈德相比，百令膠囊的上述治療效果不如布地奈德理想，說(shuō)明百令膠囊在治療哮喘時(shí)抗炎、抗氣道重塑作用有限。但值得注意的是，百令膠囊能顯著抑制哮喘小鼠氣道高反應(yīng)，且效果不輸于布地奈德，說(shuō)明百令膠囊在抑制哮喘小鼠氣道高反應(yīng)上具有獨(dú)特的療效。

近年來(lái)，大量基礎(chǔ)和臨床研究表明，百令膠囊在治療支氣管哮喘上具有顯著作用。有研究［10］表明，百令膠囊可以調(diào)節(jié)支氣管哮喘的免疫失衡，聯(lián)合西藥可快速改善急性發(fā)作期哮喘患者的臨床癥狀，改善動(dòng)脈血?dú)猓档脱装Y水平，提高肺功能，從而提高臨床治療有效率。本研究也證明，百令膠囊可以抑制慢性哮喘小鼠氣道炎癥、氣道高反應(yīng)和氣道重塑，尤其在治療氣道高反應(yīng)上，百令膠囊與激素效果相當(dāng)。

綜上所述，百令膠囊在哮喘的治療中可能發(fā)揮重要作用，未來(lái)有望作為哮喘治療的藥物。同時(shí)，百令膠囊聯(lián)合激素治療哮喘，可能改善患者的預(yù)后，減少不良反應(yīng)。