李海霞，李慧朋，王文文

作者單位：鄭州市第七人民醫(yī)院，a婦科，b中醫(yī)科，c藥學部，河南 鄭州450016；

卵巢早衰是臨床常見的婦科內(nèi)分泌疾病之一，也是引起卵巢儲備功能異常的主要疾病之一，其發(fā)病趨勢呈現(xiàn)明顯年輕化［1］。卵巢早衰發(fā)病率占原發(fā)性閉經(jīng)的20%～28%，約占繼發(fā)性閉經(jīng)的4%～20%，可導致生殖器萎縮，增加骨質(zhì)丟失、心血管疾病發(fā)生風險，甚至造成女性喪失生殖能力，嚴重影響女性身心健康［2］。研究表明，卵巢早衰與卵泡數(shù)量減少有關［3］。有研究報道，微小RNA（miR）-125b 在多囊卵巢綜合征病人卵泡中表達上調(diào)［4］，中樞性性早熟女童血清miR-125b 表達水平異常可用于評估乳房發(fā)育情況［5］。VICTORIA 等［6］研究證實，抗米勒管激素（anti-mullerian hormone，AMH）可在一定程度上反映卵巢功能，而卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）是臨床常用卵巢早衰診斷檢測指標［7］。由于血清miR-125b在卵巢早衰中表達水平報道較為少見，本研究旨在探討卵巢早衰病人血清miR-125b 表達水平，通過分析miR-125b 表達與AMH、FSH/LH 及中醫(yī)證型的關系，以期為卵巢早衰臨床治療提供一定理論幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017 年3 月至2019 年6 月鄭州市第七人民醫(yī)院婦科收治的136例卵巢早衰病人作為研究對象（研究組），研究組年齡（35.23±1.37）歲，范圍為28～39 歲；體質(zhì)量指數(shù)（23.01±0.83）kg/m2，范圍為20～25 kg/m2；西醫(yī)診斷標準參照曹澤毅主編《中華婦產(chǎn)科學》［8］（第三版）中診斷標準，中醫(yī)診斷標準參照《中藥新藥臨床研究指導原則》［9］制定的標準，其中中醫(yī)辨證分型診斷標準主要參考《中醫(yī)婦科學》［10］、《中醫(yī)診斷學》［11］及《中藥新藥臨床研究指導原則》［9］中分型標準：有肝腎陰虛證、腎虛肝郁證、脾腎陽虛證、腎虛血瘀證。

另選取同期120 例該院體檢健康者作為對照組，年齡（35.45±1.46）歲，范圍為26～39歲；體質(zhì)量指數(shù)（23.09±0.85）kg/m2，范圍為20～26 kg/m2，兩組研究對象年齡、體質(zhì)量指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=1.24、0.76，P=0.215、0.447）。

1.2 納入標準（1）符合上述卵巢早衰中西醫(yī)診斷標準；（2）年齡<40 歲；（3）閉經(jīng)超過4 個月；（4）至少2 次（間隔時間>1 個月）血清FSH>40 IU/L，雌二醇<73.2 pmol/L；（5）病人知情，簽署知情同意書；（6）該研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.3 排除標準（1）近1 年有激素治療史者；（2）伴多囊卵巢綜合征及其他卵巢疾病者；（3）先天性生殖器官發(fā)育不全者；（4）伴嚴重心、肝、腎等器官原發(fā)性疾病者；（5）伴惡性腫瘤者；（6）泌乳素異常者；（7）甲狀腺功能異常者；（8）伴糖尿病、高血壓及血液疾病者；（9）精神疾病者。

1.4 樣本采集及檢驗收集所有研究對象（未閉經(jīng)者在月經(jīng)期2～3 d，閉經(jīng)者無時間限定）清晨空腹靜脈血5 mL，室溫靜置1 h，3 000 r/min 離心10 min，分離上清，超低溫凍存待檢。（1）血清AMH 水平檢測；（2）采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）檢測血清miR-125b 表達水平，試劑盒購自大連寶生物技術有限公司。20 μL 反應體系如下：ROX 0.4μL，Mix 10μL，cDNA 2μL，正、反向引物各2μL，無酶水3.6μL。反應步驟如下：95 ℃，7 min，1循環(huán)；95 ℃，15 s；63 ℃，35 s；72 ℃，18 s；40 循環(huán)，一個樣品3次重復。以U6為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算miR-125b 表達水平；（3）采用酶聯(lián)免疫吸附測定檢測血清AMH水平，AMH試劑盒由美國Epitope Di?agnostics 公司提供，全自動酶標儀購自意大利Bio?base 公司，具體步驟參照試劑盒說明書操作；（4）采用電化學發(fā)光法檢測FSH、LH 水平，試劑盒、化學發(fā)光分析儀購自美國雅培公司，室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)均在控，由同一實驗員完成上述檢驗操作。

1.5 統(tǒng)計學方法采用統(tǒng)計軟件SPSS 23.0 處理實驗數(shù)據(jù)，計量資料行正態(tài)檢驗，符合正態(tài)分布，采用±s描述，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較應用單因素方差分析（采用q檢驗進行兩兩間比較）；計數(shù)資料用（%）描述，采用χ2檢驗；采用Pearson 相關性分析檢驗血清miR-125b 與AMH、FSH/LH 比值關系，通過logistic 回歸分析探討血清miR-125b、AMH、FSH/LH 對卵巢早衰不同中醫(yī)證型影響。當P<0.05時，差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 卵巢早衰病人中醫(yī)證型分布情況136例卵巢早衰病人中腎虛肝郁證56例（41.18%），肝腎陰虛證32 例（23.53%），腎虛血瘀證23 例（16.91%），脾腎陽虛證20例（14.70%），其他5例（3.68%）。

2.2 兩組病人血清miR-125b、AMH、FSH、LH、FSH/LH 比值比較研究組病人血清AMH 水平明顯低于對照組（P<0.05），miR-125b、FSH、LH、FSH/LH比值明顯高于對照組（P<0.05），見表1。

表1 體檢健康者與卵巢早衰病人血清AMH、FSH、LH、FSH/LH比值比較/± s

表1 體檢健康者與卵巢早衰病人血清AMH、FSH、LH、FSH/LH比值比較/± s

注：AMH為抗米勒管激素，F(xiàn)SH為卵泡刺激素，LH為黃體生成素。

組別對照組研究組t值P值FSH/LH 1.05±0.31 1.62±0.52 10.48<0.001例數(shù)120 136 miR-125b 1.01±0.29 2.67±0.91 19.14<0.001 AMH/（pmol/L）10.95±2.62 1.98±0.64 38.65<0.001 FSH/（U/L）6.05±1.02 47.28±9.15 49.08<0.001 LH/（U/L）5.32±1.37 30.46±8.24 33.01<0.001

2.3 不同中醫(yī)證型病人血清miR-125b、AMH、FSH、LH、FSH/LH 比值比較四組不同中醫(yī)證型病人血清miR-125b、AMH、FSH、LH、FSH/LH 比值比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），肝腎陰虛證組病人血清AMH 水平低于腎虛肝郁證、腎虛血瘀證、脾腎陽虛證病人（P<0.05），脾腎陽虛證組低于腎虛血瘀證組（P<0.05）；肝腎陰虛證組病人miR-125b、FSH、LH 水平高于腎虛肝郁證、腎虛血瘀證、脾腎陽虛證病人（P<0.05），脾腎陽虛證組miR-125b、FSH、LH 水平高于腎虛血瘀證、腎虛肝郁證組（P<0.05）；肝腎陰虛證組病人FSH/LH 比值低于腎虛肝郁證、腎虛血瘀證病人（P<0.05），脾腎陽虛證組低于腎虛肝郁證病人（P<0.05）。見表2。

表2 不同中醫(yī)證型卵巢早衰病人血清AMH、FSH、LH、FSH/LH比值比較/± s

表2 不同中醫(yī)證型卵巢早衰病人血清AMH、FSH、LH、FSH/LH比值比較/± s

注：AMH為抗米勒管激素，F(xiàn)SH為卵泡刺激素，LH為黃體生成素。①與腎虛肝郁證比較，P<0.05。②與肝腎陰虛證比較，P<0.05。③與腎虛血瘀證比較，P<0.05。

組別腎虛肝郁證肝腎陰虛證腎虛血瘀證脾腎陽虛證F值P值FSH/LH 1.88±0.23 1.42±0.28①1.69±0.31①②1.58±0.36①19.62<0.001例數(shù)56 32 23 20 miR-125b 2.26±0.75 3.35±1.07①1.94±0.62①②2.73±0.93①②③15.94<0.001 AMH/（pmol/L）1.85±0.24 1.56±0.20①2.01±0.12①②1.72±0.28②③21.15<0.001 FSH/（U/L）43.28±5.11 52.95±3.26①42.73±4.51①②47.12±4.26①②③36.89<0.001 LH/（U/L）24.83±2.52 35.92±3.04①26.57±4.23①②30.79±4.34①②③82.34<0.001

2.4 卵巢早衰病人血清miR-125b 表達水平與AMH 水平、FSH/LH 比值相關性卵巢早衰病人血清miR-125b 表達水平與AMH 水平呈負相關（r=?0.470，P<0.001），與FSH/LH 比值呈正相關（r=0.502，P<0.001）。

2.5 卵巢早衰病人血清miR-125b、AMH、FSH/LH與中醫(yī)證型的關系以miR-125b、AMH、FSH/LH 比值為自變量，中醫(yī)證型為因變量，引入logistic 多元回歸模型顯示，血清AMH 與腎虛肝郁證、肝腎陰虛證、脾腎陽虛證呈負相關（P<0.05），miR-125b、FSH/LH比值與腎虛肝郁證、肝腎陰虛證、腎虛血瘀證、脾腎陽虛證呈正相關（P<0.05），見表3。

表3 卵巢早衰病人血清miR-125b、AMH、FSH/LH與中醫(yī)證型的關系

3 討論

3.1 卵巢早衰中醫(yī)病機及證型分析祖國醫(yī)學將卵巢早衰歸屬于“閉經(jīng)”“不孕”“血枯”“絕經(jīng)前后諸證”等范疇，《素問·上古天真論》最早提出“早衰”一詞，其曰“今時之人不然也……以忘為常……故半百而衰也”，《素問·陰陽應象大論》亦有云：“能之七損八益……則早衰之節(jié)也。年四十而陰氣自半化，起居衰也?！蹦I虛為卵巢早衰發(fā)病病機，《傅青主女科》有“經(jīng)本于腎”“經(jīng)水出諸腎”之說，腎藏先天之精，天癸之源，主生殖，腎精充足則天葵生化有源，腎氣虧虛，精血匱乏，天癸竭，沖任虛衰，胞宮失所養(yǎng)。有學者認為卵巢早衰病機以腎虛為主，清心滋腎可取得較佳治療效果［12］。本研究結果顯示，136例卵巢早衰病人腎虛肝郁證（41.18%）、肝腎陰虛證（23.53%）、腎虛血瘀證（16.91%）、脾腎陽虛證（14.70%）4 類證型均見腎虛，與滕秀香等［13］研究結果相似，提示腎虛可能在卵巢早衰發(fā)病機制中占主導地位。

3.2 卵巢早衰病人血清miR-125b 及激素指標水平分析本研究結果顯示，卵巢早衰病人miR-125b表達水平明顯高于對照組，提示血清miR-125b表達水平升高可能與卵巢早衰發(fā)生有關。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b 可通過與骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1B 特異性結合，促進綿羊卵巢顆粒細胞凋亡［14］。還有研究表明，miR-125b可通過靶向激活素受體2a調(diào)控新生小鼠卵巢原始卵泡形成［15］。而Chen 等［16］研究報道，miR-125b 過表達與卵巢細胞線粒體凋亡通路激活有關，上述結果均提示miR-125b可能通過調(diào)控卵泡相關基因表達，參與卵巢早衰發(fā)生過程。

進一步查閱文獻發(fā)現(xiàn)，Lannes 等［17］研究認為，miR-125b 可通過神經(jīng)激素調(diào)節(jié)LH、FSH 表達水平，參與神經(jīng)元性疾病進展。AMH 與轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）表達密切相關，有研究證實，胰腺導管腺癌進展中miR-125b 可與TGF-β 相互作用，參與癌細胞增殖、凋亡進程［18］。其中AMH 屬于TGF-β 超家族，其主要表達分泌部位為初級卵泡的顆粒細胞，隨卵泡增大而分泌減少，并隨年齡增長呈降低趨勢，在調(diào)控卵泡的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用［19］。李強等［20］研究發(fā)現(xiàn)，卵巢功能衰退病人血清AMH水平降低，對其早期檢測可預測卵巢功能衰退。FSH 是卵巢早衰最敏感檢測指標之一，臨床上將FSH>40 IU/L 時視為卵泡耗竭，當卵巢功能異常時，血清FSH、LH 分泌調(diào)控會出現(xiàn)紊亂，與卵巢早衰發(fā)生密切相關［21］。本研究結果顯示，較于對照組，研究組病人血清AMH 水平降低，F(xiàn)SH、LH 水平及FSH/LH 比值升高，與陳紅男等［22］研究結果相似，提示血清AMH表達及FSH/LH 比值異?？赡芘c卵巢早衰發(fā)生發(fā)展相關。本研究結果顯示，卵巢早衰病人血清miR-125b 表達水平與AMH 水平呈負相關，與FSH/LH 比值呈正相關，進一步提示血清miR-125b可能通過與AMH、FSH、LH等相關指標或因子相互作用，促進卵泡數(shù)量減少及功能異常發(fā)生，共同參與卵巢早衰進展。

3.3 卵巢早衰中醫(yī)證型與血清miR-125b 及激素指標的關系另外，本研究結果還顯示，血清miR-125b、AMH、FSH、LH及FSH/LH比值在肝腎陰虛證、脾腎陽虛證病人中表達差異較為明顯，提示血清miR-125b、AMH、FSH/LH 比值與卵巢早衰中醫(yī)證型中肝腎陰虛證、脾腎陽虛證的關系較為密切。中醫(yī)認為腎內(nèi)藏真陰元陽，陽主動，為成熟卵子排出體內(nèi)的動力所在，而腎陰則為卵子生成、成熟提供物質(zhì)基礎，腎虛日久，腎陰陽失調(diào)，腎陰不足可導致卵泡形成障礙，而腎陽不足則影響排卵，導致排卵功能障礙，影響卵巢功能，肝腎為母子關系，而脾腎共主水液代謝，影響卵巢分泌功能［23-24］。因此，肝腎陰虛證、脾腎陽虛證卵巢早衰病人血清miR-125b、AMH水平及FSH/LH 比值異常較明顯。最后研究發(fā)現(xiàn)，血清AMH與腎虛肝郁證、肝腎陰虛證、脾腎陽虛證呈負相關，miR-125b、FSH/LH 比值與腎虛肝郁證、肝腎陰虛證、腎虛血瘀證、脾腎陽虛證呈正相關，提示血清miR-125b、AMH 表達、FSH/LH 比值與卵巢早衰中醫(yī)證型相關，臨床上可通過檢測血清miR-125b、AMH 水平及FSH/LH 比值變化作為卵巢早衰中醫(yī)證分型輔助指標，但是由于本研究僅從臨床角度淺顯地分析了二者之間的關系，后期將從分子生物學及基因組學等多個角度進行探討中醫(yī)藥調(diào)控miR-125b對卵巢早衰的影響。

綜上所述，卵巢早衰病人血清miR-125b 高表達，與AMH、FSH/LH 比值異常變化有關，且肝腎陰虛證、脾腎陽虛證病人血清miR-125b水平變化較為明顯，與卵巢早衰中醫(yī)證型相關，但是由于本研究對象較少，且卵巢早衰病程較長其主觀癥狀隨病情變化而變化，可能影響中醫(yī)辨證分型，缺乏多中心研究，同時本研究僅從臨床角度探討血清miR-125b與卵巢早衰病人中醫(yī)證型的關系，關于二者之間的內(nèi)在機制以及是否存在中醫(yī)藥及基因調(diào)控miR-125b 尚不明確，還有待進一步從基礎理論深入分析。