周文艷，王宇明，黃雁，程世云

作者單位：1合肥億帆生物醫(yī)藥有限公司，安徽 合肥230061；

2安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥230051

復方黃黛片由青黛、雄黃、太子參、丹參等四味中藥組成，本品具有清熱解毒，益氣生血的功效，臨床用于初治的急性早幼粒細胞白血?。?-5］，治療效果確切，現(xiàn)已收錄入國家醫(yī)保藥物目錄。復方黃黛片現(xiàn)行標準為國家食品藥品監(jiān)督管理局標準（標準號YBZ13122009），標準中對主藥雄黃、青黛進行了含量控制，丹參也進行了質量控制，只采用原兒茶醛的薄層色譜鑒別作為質量控制方法，此法專屬性不強，為更好控制該制劑的質量，本研究于2018 年5月至2019 年3 月采用重現(xiàn)性和專屬性均較好的高效液相色譜法測定樣品中水溶性成分丹酚酸B的含量［6-11］。方法學研究結果表明：該方法準確度高，重現(xiàn)性好。

1 儀器與試劑

島津LC-20AT 型高效液相色譜儀；瑞士梅特勒XP205 型電子天平；Agilent Zorbax SB-Aq C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱。

丹酚酸B 對照品（中國食品藥品檢定研究院提供，批號111562-201716，對照品含量94.1%，供含量測定用）；復方黃黛片樣品（天長億帆制藥有限公司提供，批號170201、170202、170701、171101、180101、180301、180401、180501、180901、180902、180903、181201、181202）。甲醇和乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件Agilent Zorbax SB-Aq C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78）為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長286 nm，柱溫35 ℃，進樣量10μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取丹酚酸B對照品適量，加甲醇稀釋制成100.76 mg/L 的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品20 片，除去包衣，研細，取約0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲酸-甲醇-水（1∶80∶19）溶液25 mL，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）20 min，放冷，加甲酸-甲醇-水（1：80：19）溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按標準制法［11］，制備缺丹參的陰性樣品。取陰性樣品適量，按照“2.2.2”項下方法操作，制得丹參陰性樣品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性 分別精密移取供試品溶液、對照品溶液和陰性樣品溶液各10 μL 注入液相色譜儀，進樣分析，結果丹酚酸B 峰保留時間為21.1 min，分離度為9.5，陰性樣品在丹酚酸B峰位置處無干擾。

2.3.2 線性關系的考察 分別精密移取對照品母液（溶液濃度：1 007.6 mg/L），加甲醇稀釋成10.076 mg/L、20.152 mg/L、40.304 mg/L、60.456 mg/L、80.608 mg/L、100.76 mg/L、151.140 mg/L 濃度的溶液，精密移取10 μL 注入液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積對溶液濃度（mg/L）進行線性回歸，得回歸方程Y=12 390.60X+5 567.12（r=0.999 9，n=7）。結果表明：丹酚酸B 在10.076～151.140 mg/L 范圍內，峰面積與進樣量呈良好的線性關系。

2.3.3 精密度試驗 精密移取丹酚酸B對照品溶液10μL，重復進樣6 次。結果丹酚酸B 峰面積的相對標準差為0.8%（n=6），表明進樣精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 取同一批復方黃黛片（批號181201）的樣品6份，按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，測定供試品中丹酚酸B的含量，計算樣品中丹酚酸B 的平均含量為2.436 3 mg/g，相對標準差為0.9%。實驗表明：樣品測定重現(xiàn)性良好。

2.3.5 溶液穩(wěn)定性試驗 取“2.3.4”項下供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，于0、2、4、8、12、16、24 h進樣測定，結果丹酚酸B 峰面積的相對標準差為0.5%。結果表明在24 h內供試品溶液穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率試驗 取已知含量的供試品（批號181201，含量2.436 3 mg/g）6 份，每份取0.25 g，精密稱定，置錐形瓶中，分別精密加入濃度為134.563 mg/L 的丹酚酸B 對照品溶液5 mL，按“2.2.2”項下方法制備溶液，依法測定，計算。加樣回收率結果見表1。此方法丹酚酸B 的平均回收率為95.62%，相對標準差為1.6%。

表1 丹酚酸B準確度試驗結果

2.3.7 耐用性試驗 分別采用Agilent Zorbax SBAq C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Sunfire?C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）及phenomenex Luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）三種不同的色譜柱，并分別在島津LC-20AT 型液相色譜儀及Agilent 1260 型液相色譜儀上測定，結果平均含量為2.363 mg/g，相對標準差為2.8%，島津LC-20AT 型液相色譜儀檢測丹酚酸B 峰的分離度為9.5，Agilent 1260型液相色譜儀檢測丹酚酸B 峰的分離度為13.1，耐用性試驗結果良好。

2.4 樣品含量測定取復方黃黛片13 批，按照“2.2.2”項下方法測定丹酚酸B 的含量，結果見表2。

表2 樣品中丹酚酸B含量測定結果

3 討論

3.1 指標性成分的選擇復方黃黛片是黃世林教授依據傳統(tǒng)中醫(yī)中藥理論，以驅邪復正為治療原則，結合長期的臨床實踐研制的純中藥制劑。依據白血病的病因病機關鍵是邪毒內蘊、骨髓瘀滯，病變實質為邪實而致本虛的認識，提出“祛邪復正”的主要治療原則，以解毒清熱、益氣活血為治法組方。方中主要成分為雄黃、青黛、太子參及丹參，丹參在處方中作為佐使藥，其水溶性成分在活血生血及腫瘤抑制方面有明確的作用，且水溶性成分中丹酚酸B 明顯高于其他成分［11-12］，本研究選擇丹酚酸B 作為指標控制成分。

3.2 檢測波長的選擇對丹酚酸B 對照品溶液于200～400 nm 進行掃描，其最大吸收波長為286 nm，與文獻［11］報道的286 nm一致，參考中國藥典2015年版一部丹參含量測定條件，選擇檢測波長為286 nm。

3.3 流動相的選擇試驗分別采用乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78）、乙腈-0.1%甲酸溶液（22∶78）作為流動相［12-15］進行比較研究。結果采用乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78）為流動相，丹酚酸B 峰形較好，保留時間為21.1 min，N=12 085，分離度為9.5。

3.4 提取溶劑與提取時間的選擇本試驗分別對甲酸-水（1∶99）溶液、甲酸-甲醇-水（1∶80∶19）溶液和甲酸-甲醇（1∶99）溶液等溶劑［13-16］進行了考察，結果在甲酸-甲醇-水（1∶80∶19）溶液中溶解效果好，供試品溶液穩(wěn)定，故選擇甲酸-甲醇-水（1∶80∶19）溶液作為提取溶劑。并對超聲時間進行比較考察，結果樣品超聲處理20 min 提取效率最高，因此供試品提取方法采用超聲處理20 min。

4 結論

本研究首次建立了中藥復方黃黛片中丹酚酸B含量測定的高效液相色譜法（HPLC）方法，該方法前處理簡單，穩(wěn)定準確，重現(xiàn)性好。所建立的定量測定方法與現(xiàn)有質量標準配合（丹參原兒茶醛定性鑒別），可以大幅度提升產品的質量控制水平，也為其質量標準的提高提供參考依據。