陸崟，李金慈，盛華，唐安福，蘇華，湯淏（東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科，南京 210002）

保腎片是由蓼科植物大黃經(jīng)醇提和水提等一系列工藝制成的中藥制劑，為東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院腎臟科的常用制劑，在臨床用藥中占據(jù)重要地位。該藥具有升清消濁、調(diào)節(jié)代謝的作用，通過(guò)緩解“殘余腎”的高代謝狀態(tài)、影響氮質(zhì)代謝及腎系膜細(xì)胞增殖和功能而發(fā)揮保護(hù)腎功能的作用，臨床主要用于慢性腎功能不全氮質(zhì)血癥期的治療。保腎片現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是采用薄層色譜法對(duì)制劑中的大黃素進(jìn)行鑒別，并結(jié)合高效液相色譜法對(duì)大黃酸、大黃素和大黃酚的總量進(jìn)行測(cè)定。然而，中藥是以多組分、多靶點(diǎn)發(fā)揮作用的，對(duì)其中某一個(gè)或某幾個(gè)指標(biāo)成分的控制難以全面反映其整體質(zhì)量。

中藥多為復(fù)雜的化學(xué)成分群，采收、加工、生產(chǎn)等各個(gè)環(huán)節(jié)均會(huì)對(duì)質(zhì)量產(chǎn)生影響，而中藥質(zhì)量直接影響其臨床療效和用藥安全。如何對(duì)復(fù)雜的中藥體系進(jìn)行合理的質(zhì)量控制，始終是中藥現(xiàn)代化發(fā)展過(guò)程中的熱點(diǎn)與難點(diǎn)問(wèn)題。中醫(yī)治療疾病的理論精髓是整體觀念和辨證論治，在尚不能明確中藥全部藥效物質(zhì)的今天，應(yīng)遵循中藥的用藥特點(diǎn)、基于中藥整體物質(zhì)群科學(xué)地建立其特色的、系統(tǒng)的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。中藥指紋圖譜實(shí)現(xiàn)了以現(xiàn)有分析技術(shù)為載體全面挖掘中藥中的化學(xué)成分信息，目前在中藥真?zhèn)舞b別、質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)等方面應(yīng)用廣泛，并已受到國(guó)內(nèi)國(guó)際一致認(rèn)可。然而完全通過(guò)人為方式辨識(shí)指紋圖譜的龐大數(shù)據(jù)信息是不可能且不客觀的，因此常常將化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)與指紋圖譜相結(jié)合來(lái)進(jìn)行多維數(shù)據(jù)的解析。因此，本研究采用超高效液相色譜法（UPLC）首次建立了本院制劑保腎片的指紋圖譜，通過(guò)相似度評(píng)價(jià)對(duì)保腎片的質(zhì)量穩(wěn)定性進(jìn)行整體評(píng)價(jià)，通過(guò)聚類分析（CA）和正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）尋找不同批次樣品間的差異，為綜合評(píng)價(jià)制劑質(zhì)量、提升質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290 InfinityⅡ 型UPLC儀，配 備G7117B DAD檢測(cè)器、OpenLAB CDS ChemStation工作站（美國(guó)安捷倫科技公司）；AE240型電子天平（梅特勒-托利多）；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；GM-0.33A型真空泵、0.45 μm針頭過(guò)濾器（天津津騰科技有限公司）。

1.2 試藥

沒(méi)食子酸（批號(hào)：110831-201204，含量：89.9%）、大黃素（批號(hào)：110756-201512，含量：98.7%）、大黃酚（批號(hào)：110796-201621，含量：99.2%）、大黃素甲醚（批號(hào)：110758-201013，含量：99.8%）、蘆薈大黃素（批號(hào)：110795-201308，含量：98.0%）（對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇為色譜純（美國(guó)Tedia公司），冰醋酸為分析純（上海申博化工有限公司），超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。16批保腎片（規(guī)格：0.3 g/片自制，編號(hào)S1～S16，批號(hào)分別為20200116、20200224、20200325、20200420、20200514、20200602、20200611、20200626、20200710、20200805、20200901、20200925、20201015、20201029、20201117、20201216），各批次制劑所用飲片來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 原料飲片樣品信息
Tab 1 Information of raw herbal materials

編號(hào) 廠家 批號(hào) 基源 產(chǎn)地S1 華云藥業(yè) 190901 藥用大黃 青海S2 華云藥業(yè) 190901 藥用大黃 青海S3 華云藥業(yè) 191001 藥用大黃 青海S4 華云藥業(yè) 191001 藥用大黃 青海S5 華云藥業(yè) 191001 藥用大黃 青海S6 華云藥業(yè) 191201 藥用大黃 青海S7 華云藥業(yè) 191201 藥用大黃 青海S8 華云藥業(yè) 191201 藥用大黃 青海S9 華云藥業(yè) 191201 藥用大黃 青海S10 華云藥業(yè) 191201 藥用大黃 青海S11 北川華寧 200706 藥用大黃 甘肅S12 北川華寧 200706 藥用大黃 甘肅S13 北川華寧 200706 藥用大黃 甘肅S14 北川華寧 200706 藥用大黃 甘肅S15 南京鶴齡 191101 唐古特大黃 青海S16 南京鶴齡 191101 唐古特大黃 青海

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色 譜 柱：Agilent Por oshell 120 EC-C（2.7 μm，4.6 mm×50 mm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.2%冰醋酸水溶液（B），梯度洗脫（0～6.0 min，6%～20%A；6.0～15.0 min，20%～40%A；15.0～28.0 min，40%～60%A；28.0～33.0 min，60%A；33.0～36.0 min，60%～100%A；36.0～39.0 min，100%A）；流速0.8 mL·min；柱溫30℃；進(jìn)樣量1 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液 取本品20片，去薄膜衣，研細(xì)，精密稱取0.5 g置圓底燒瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，水浴加熱回流1 h，取出放冷，再次稱定質(zhì)量，甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液 精密稱取沒(méi)食子酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，置于量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成含沒(méi)食子酸50.55 μg·mL、蘆薈大黃素51.30 μg·mL、大黃素51.75 μg·mL、大黃酚59.55 μg·mL、大黃素甲醚68.40 μg·mL的混合對(duì)照品溶液，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取S1號(hào)樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積較大、分離度較好的3號(hào)峰為參照，結(jié)果12個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間

RSD

為0.010%～0.11%、相對(duì)峰面積

RSD

為2.3%～2.8%，表明儀器精密度良好。2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1號(hào)樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以3號(hào)峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，結(jié)果12個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間

RSD

為0.010%～0.20%、相對(duì)峰面積

RSD

為1.8%～2.4%，表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1號(hào)樣品6份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以3號(hào)峰為參照，結(jié)果12個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間

RSD

為0.011%～ 0.18%、相對(duì)峰面積

RSD

為0.87%～1.1%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜的建立及分析

分別取S1～S16號(hào)保腎片，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析。采用“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012A版）”軟件進(jìn)行色譜圖數(shù)據(jù)的分析處理，以S1號(hào)樣品圖譜為參照，時(shí)間窗寬度設(shè)為0.1 s，采用中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜R，經(jīng)多點(diǎn)校正后全譜峰匹配建立指紋圖譜，結(jié)果見(jiàn)圖1。共確定了12個(gè)共有峰，共有峰峰面積之和占色譜圖總峰面積的81.11%，符合要求。取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析，根據(jù)保留時(shí)間和紫外吸收光譜進(jìn)行對(duì)比，指認(rèn)出12個(gè)共有峰中的5個(gè)，分別為1號(hào)峰（沒(méi)食子酸）、9號(hào)峰（蘆薈大黃素）、10號(hào)峰（大黃素）、11號(hào)峰（大黃酚）、12號(hào)峰（大黃素甲醚），見(jiàn)圖2。

圖1 16批保腎片的UPLC指紋圖譜Fig 1 UPLC fingerprints of 16 batches of Baoshen tablets

圖2 混合對(duì)照品色譜圖（A）與對(duì)照?qǐng)D譜R（B）Fig 2 UPLC chromatogram of mixed reference substances（A）and control fingerprint R（B）

根據(jù)“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012A版）”計(jì)算得出S1～S16號(hào)保腎片樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度在0.860～0.997，具體結(jié)果見(jiàn)表2，其中14批樣品的相似度均大于0.9，表明不同批次保腎片相似度較高，制劑工藝較穩(wěn)定。S15、S16兩批保腎片的相似度相對(duì)較低，可能與原料藥材不同有關(guān)。

表2 16批保腎片相似度評(píng)價(jià)結(jié)果
Tab 2 Similarity evaluation of 16 batches of Baoshen tablets

?

以3號(hào)峰為參照峰（S峰），計(jì)算16批樣品中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果各批樣品的相對(duì)保留時(shí)間

RSD

為0.060%～0.65%，波動(dòng)極小，但相對(duì)峰面積

RSD

為14%～110%，波動(dòng)較大，表明不同批次保腎片中共有成分的含量存在差異。

2.5 化學(xué)模式識(shí)別分析

2.5.1 CA 以共有峰峰面積與樣品取樣量的比值作為變量建立數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件，以平方歐氏距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，采用組間聯(lián)接法進(jìn)行系統(tǒng)聚類，結(jié)果見(jiàn)圖3。由樹(shù)狀圖可知，類間距為5～10時(shí)樣品可分為兩類，第一類樣品為S1～S10，相似度均大于0.99，第二類樣品為S11～S16，相似度相差較大，說(shuō)明16批保腎片整體質(zhì)量基本穩(wěn)定，但因原料飲片來(lái)源不同導(dǎo)致各批次制劑的共有成分存在差異。

圖3 16批保腎片的CA結(jié)果Fig 3 Cluster analysis of 16 batches of Baoshen tablets

2.5.2 OPLS-DA 由上述CA分析和相似度分析結(jié)果可知，不同批次保腎片樣品之間存在一定差異。為了進(jìn)一步明確16批保腎片之間的差異，將“2.5.1”項(xiàng)下數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入Simca-P14.1多元統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)樣品共有峰聚類所得的兩大類進(jìn)行OPLS-DA分析。由圖4可知，樣品分組區(qū)分良好，當(dāng)提取2個(gè)主成分時(shí)，模型主成分回歸系數(shù)為：

RX

＝0.893，

RY

＝0.998，

Q

＝0.994，均高于0.5，且差距小于0.2，說(shuō)明所建模型有效，且有較高的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)能力。由載荷圖（見(jiàn)圖5）可看出11號(hào)、4號(hào)和3號(hào)色譜峰距離中心的離散程度較高，說(shuō)明這幾種成分對(duì)保腎片制劑的質(zhì)量穩(wěn)定性影響較大。變量重要性投影值（variable importance in projection，VIP）可直觀反映各變量對(duì)模型分類的整體貢獻(xiàn)度，當(dāng)VIP＞1.0時(shí)表明該色譜峰為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異標(biāo)志物。由圖6可知，VIP值大于1.0者為峰11（VIP＝2.1746）、峰4（VIP＝2.0980）、峰3（VIP＝1.1045），提示這3種成分對(duì)不同批次保腎片的質(zhì)量一致性具有顯著影響，在生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制中可重點(diǎn)關(guān)注它們的變化情況。

圖4 16批保腎片OPLS-DA得分圖Fig 4 OPLS-DA score plot of 16 batches of Baoshen tablets

圖5 16批保腎片OPLS-DA載荷圖Fig 5 OPLS-DA loading plot of 16 batches of Baoshen tablets

圖6 16批保腎片OPLS-DA變量重要性投影圖Fig 6 OPLS-DA VIP plot of 16 batches of Baoshen tablets

2.6 指標(biāo)成分含量測(cè)定

按文獻(xiàn)方法對(duì)16批樣品中大黃酸、大黃素、大黃酚的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3和圖7。由結(jié)果可看出，各批次樣品中大黃酸的含量差異較大，其余兩種成分的含量存在波動(dòng)，結(jié)果與OPLS-DA相一致，這可能是原料飲片廠家更換所導(dǎo)致。

圖7 指標(biāo)成分含量測(cè)定折線圖Fig 7 Content determination of index components

表3 保腎片中大黃酸、大黃素、大黃酚的含量測(cè)定結(jié)果(mg/片)Tab 3 Content of rhein，emodin and chrysophanol in Baoshen tablets (mg/slice)

編號(hào) 大黃酸 大黃素 大黃酚 3種成分總量S1 0.07 0.99 4.06 5.12 S2 0.08 0.92 3.82 4.82 S3 0.09 1.07 4.18 5.35 S4 0.09 1.07 4.10 5.26 S5 0.07 1.24 5.66 6.98 S6 0.14 1.06 4.61 5.81 S7 0.05 0.59 2.48 3.12 S8 0.14 1.06 4.61 5.81 S9 0.19 0.82 3.18 4.18 S10 0.30 1.15 5.05 6.49 S11 0.37 1.30 5.23 6.90 S12 1.01 1.67 5.77 8.45 S13 1.20 1.99 5.69 8.88 S14 1.09 1.82 6.13 9.04 S15 2.21 1.56 4.80 8.58 S16 2.18 1.47 4.70 8.34

3 討論

本研究采用UPLC建立保腎片的指紋圖譜，與普通液相色譜法相比，具有分離度更高，檢測(cè)更靈敏，分離時(shí)間更短的優(yōu)勢(shì)。在文獻(xiàn)研究基礎(chǔ)上，以色譜圖的出峰數(shù)和峰面積為指標(biāo)，對(duì)保腎片的提取條件（提取溶劑、提取方法、回流時(shí)間）進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示以甲醇為溶劑水浴加熱回流1 h所獲得的供試品溶液色譜峰最多且響應(yīng)值較高。通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相的組成和洗脫梯度，比較不同流速（0.8、1.0、1.2 mL·min）、不同柱溫（25、30、35℃）、不同波長(zhǎng)（254、260、280 nm）條件下的分離分析效果，發(fā)現(xiàn)在本文色譜條件下所獲得的色譜圖基線更平穩(wěn)、色譜峰信息更全面、峰形與分離度俱佳。

指紋圖譜提供的信息龐大而復(fù)雜，需要采用合理的數(shù)據(jù)挖掘工具對(duì)其進(jìn)一步解析，化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)則可有效解決這一問(wèn)題，具有良好的預(yù)測(cè)性和廣泛的適用性。常用的化學(xué)模式識(shí)別方法分為聚類分析（CA）、主成分分析（PCA）等無(wú)監(jiān)督模式識(shí)別和OPLS-DA、線性判別分析等有監(jiān)督模式識(shí)別兩種，它們不僅可單獨(dú)使用，還可結(jié)合在一起用于中藥質(zhì)量控制。本文將CA與OPLS-DA相結(jié)合用于保腎片指紋圖譜數(shù)據(jù)挖掘。

本研究通過(guò)相似度分析發(fā)現(xiàn)16批保腎片指紋圖譜相似度在0.860～0.997，12個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間高度吻合（

RSD

小于0.65%），說(shuō)明該制劑的指紋圖譜穩(wěn)定可靠。CA發(fā)現(xiàn)16批保腎片可以分為兩類，S1～S10聚為一類，S11～S16聚為一類，說(shuō)明更換原料藥材廠家對(duì)制劑質(zhì)量的均一穩(wěn)定性產(chǎn)生了一定的影響。為了明確差異所在，進(jìn)一步采用OPLS-DA進(jìn)行篩選，得到了峰3、峰4、峰11顯著性差異成分3種，其中11號(hào)峰為大黃酸，3號(hào)峰和4號(hào)峰未能與對(duì)照品比對(duì)，后期需通過(guò)質(zhì)譜等技術(shù)進(jìn)一步研究。通過(guò)對(duì)保腎片指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)各批次樣品中大黃酚的含量差異較大，這與OPLS-DA結(jié)果相一致。大黃是一種典型的多基原、多產(chǎn)地藥材，《中國(guó)藥典》2020年版中收載的正品大黃為蓼科植物掌葉大黃

Rheum palmatum

L.、唐古特大黃

Rheum tanguticum

Maxim

. ex

Balf

.

或藥用大黃

Rheum officinale

Baill

.

的干燥根和根莖。大黃對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較為嚴(yán)苛，其生長(zhǎng)過(guò)程中的溫度、濕度、光照、遺傳、土壤狀態(tài)、采收時(shí)間等因素均會(huì)影響藥材質(zhì)量。已有研究表明藥用大黃和唐古特大黃親緣關(guān)系較近，指紋圖譜CA和PCA均不能將其區(qū)分開(kāi)，但指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)果顯示唐古特大黃中游離型蒽醌與結(jié)合型蒽醌的總含量均高于其他大黃品種。本研究中發(fā)現(xiàn)保腎片制劑原料飲片更換后對(duì)制劑質(zhì)量產(chǎn)生了一定的影響，大黃酸、大黃素、大黃酚總量均大于3.0 mg/片，整體上符合當(dāng)前質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求，但大黃酸的含量差異較大，S15、S16的原料藥材來(lái)源于唐古特大黃，大黃酸含量顯著高于其他批次保腎片。由此可見(jiàn)現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚不能完全體現(xiàn)保腎片生產(chǎn)全過(guò)程的質(zhì)量穩(wěn)定性，若將含量測(cè)定與指紋圖譜相結(jié)合，可更全面、客觀地表征藥物信息及工藝穩(wěn)定性。

綜上所述，本試驗(yàn)建立了保腎片的UPLC指紋圖譜，分析方法穩(wěn)定可靠、簡(jiǎn)便易行、高效快速，進(jìn)一步結(jié)合CA和OPLS-DA對(duì)指紋圖譜進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，可較全面地反映制劑的整體信息和特征信息，為保腎片制劑質(zhì)量控制的改善和標(biāo)準(zhǔn)的提高提供了科學(xué)依據(jù)。