聶淞瑩,唐海明,汪鋆植*,王丹陽,顏華玲,胡浩寧,黃永梅(. 三峽大學生物與制藥學院,湖北宜昌 443000;. 湖北恒安芙林藥業(yè)股份有限公司,湖北 宜昌 44303)
木瓜又名“皺皮木瓜”“鐵腳梨”,為薔薇科植物貼梗海棠[Chaenomeles speciosa
(Sweet)Nakai]的干燥近成熟的果實,具有舒筋活絡(luò)、和胃化濕的作用,主要化學成分為三萜類、苯丙素類、黃酮類、有機酸類等。其具有鎮(zhèn)痛、抗炎、增強免疫、保肝、抗胃潰瘍與腸損傷、抗腫瘤等藥理活性。中藥飲片標準湯劑是基于中醫(yī)理論和臨床用藥,參考現(xiàn)代提取方法,經(jīng)標準化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎劑。由于中藥材成分復雜,且受產(chǎn)地、區(qū)域、氣候、環(huán)境、加工方式的影響,傳統(tǒng)湯劑制備工藝很難保證臨床療效的一致性和制備工藝的合理性。因此,本文采用多指標層次分析法(AHP)計算各指標權(quán)重,并結(jié)合Box-Behnken響應面法優(yōu)化木瓜標準湯劑的制備工藝參數(shù),旨在為木瓜標準湯劑的制備提供理論依據(jù)。Thermo Ultimate 3000型高效液相色譜系統(tǒng)(包括高壓輸液系統(tǒng)、二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外可見光檢測器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),賽默飛科技有限公司);RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);TD24K離心機(湖北湘儀儀器公司),PB-10型pH計(德國賽多利斯公司);XSE205DU型十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司),ME204T/02型萬分之一天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司),DTC-27型數(shù)控超聲波清洗器(湖北鼎泰高科有限公司)。
L
-蘋果酸(批號:190014-201302,含量:100%)(對照品,中國食品藥品檢定研究院);莽草酸(批號:C11015240)、奎尼酸(批號:C11520221)(對照品,含量≥98%,上海麥克林生化科技有限公司);木瓜藥材購自湖北宜昌市長陽土家族自治縣,經(jīng)三峽大學王玉兵教授鑒定為貼梗海棠的干燥近成熟果實,符合2020年版《中國藥典》一部要求。乙腈為色譜純(湖北弗頓生化科技有限公司);乙醇為分析純(國藥集團化學試劑有限公司);磷酸為分析純(天津市科密歐化學試劑有限公司);水為超純水(經(jīng)Milli-Q Reference系統(tǒng)凈化),其余試劑均為分析純。2.1.1 色譜條件 采用Agilent ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱;流動相乙腈(A)-0.01%磷酸水(B),梯度洗脫(0~8 min,1%A;8~15 min,1%~8%A;15~25 min,8%~10%A;25~35 min,10%~15%A;35~40 min,15%A;40~45 min,15%~1%A;45~55 min,1%A);檢測波長0~8 min:212 nm;9~55 min:280 nm;流速0.8 mL·min;柱溫30℃;進樣量10 μL。色譜圖見圖1。
圖1 混合對照品溶液(A)及木瓜提取樣品溶液(B)的HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of mixed reference substance(A)and extracted C. speciosa sample(B)
2.1.2 對照品溶液制備 分別精密稱取各對照品適量,用流動相B溶解,制成質(zhì)量濃度分別為綠原酸99.5 μg·mL、原兒茶酸18.5 μg·mL、L
-蘋果酸 1940.0 μg·mL、莽草酸536 .0 μg·mL、莽草酸4176.0 μg·mL的儲備液,各精密吸取適量,用流動相B稀釋,即得各質(zhì)量濃度分別為40.3、9.3、194.0、106.2、208.8 μg·mL的對照品溶液。2.1.3 供試品溶液制備 精密吸取木瓜水煎液10 mL,置于50 mL量瓶中,無水乙醇定容至刻度,醇沉2 h,4000 r·min離心5 min,精密吸取上清液5 mL,蒸干,殘渣加入流動相B溶液溶解,定容至10 mL,搖勻,即得,置于4℃冰箱中保存。
2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項下對照品儲備液適量,流動相B溶液配制成6種系列質(zhì)量濃度的溶液,各進樣10 μL測定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(X
),峰面積為縱坐標(Y
)進行回歸,結(jié)果見表1。表1 各成分線性關(guān)系
Tab 1 Linearity of various constituents
成分 回歸方程 r 線性范圍/(μg·mL -1)綠原酸 Y=0.3288x-0.3177 0.9998 9.9~99.5原兒茶酸 Y=0.3303x-0.0105 0.9999 0.925~18.5 L-蘋果酸 Y=0.0082x-0.0381 0.9996 97~1940莽草酸 Y=0.4993x+0.3606 0.9999 26.8~536奎尼酸 Y=0.0053x-0.1515 0.9997 208.8~4176
2.1.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL,連續(xù)進樣6次,測得綠原酸、原兒茶酸、L
-蘋果酸、奎尼酸、莽草酸峰面積的RSD
分別為0.71%、1.4%、1.2%、0.16%、1.6%,表明儀器精密度良好。2.1.6 重復性試驗 取同一制備工藝下的標準湯劑,按“2.1.3”項下方法平行制備6份供試品溶液,進樣測定,測得綠原酸、原兒茶酸、L
-蘋果酸、奎尼酸、莽草酸峰面積的RSD
分別為0.94%、1.6%、1.9%、0.62%、1.0%,表明該方法重復性良好。2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液,分別在0、2、4、8、12、24 h進樣測定,測得綠原酸、原兒茶酸、L
-蘋果酸、奎尼酸、莽草酸峰面積RSD
分別為1.2%、0.95%、0.78%、1.4%、1.3%,表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.1.8 加樣回收試驗 精密吸取供試品溶液5 mL,共6份,精密加入對照品溶液適量,進樣測定,計算回收率。結(jié)果綠原酸、原兒茶酸、L
-蘋果酸、奎尼酸、莽草酸平均加樣回收率分別為96.9%、98.2%、98.6%、99.5%、99.5%,RSD
分別為2.5%、1.8%、1.9%、0.86%、1.6%。L
-蘋果酸、奎尼酸、莽草酸含量以及出膏率為指標,通過單因素控制變量法,繪制含量動態(tài)分布趨勢圖和出膏率動態(tài)圖,結(jié)果見圖2。根據(jù)試驗結(jié)果,考慮實際操作,選擇加水量8倍、煎煮30 min、煎煮2次作為響應面法的考察水平。圖2 各成分含量及出膏率動態(tài)分布趨勢Fig 2 Dynamic distribution trends for various constituents content and dry extract rate
L
-蘋果酸、奎尼酸等有機酸。根據(jù)木瓜標準湯劑藥理、藥效作用強弱、各成分含量并結(jié)合文獻將權(quán)重指標予以量化。即將6個指標分為4個層次,并確定指標的優(yōu)先順序:出膏率>綠原酸>原兒茶酸>L
-蘋果酸=奎尼酸=莽草酸,據(jù)此進行成對比較,構(gòu)建優(yōu)先判斷矩陣,得到相對評分,結(jié)果見表2,發(fā)現(xiàn)CR
<0.1,表明矩陣符合一致性檢驗,權(quán)重系數(shù)合理有效。綜合評分Y
=0.2519×綠原酸含量+0.1243×原兒茶酸含量+0.0519×奎尼酸含量+0.0519×莽草酸含量+0.0519×L
-蘋果酸含量+0.4682×出膏率。表2 各指標權(quán)重系數(shù)
Tab 2 Weight coefficients for various indicators
指標 綠原酸原兒茶酸L-蘋果酸奎尼酸莽草酸出膏率權(quán)重系數(shù) CR綠原酸 1 3 5 5 5 1/3 0.2519 0.0218原兒茶酸 1/3 1 3 3 3 1/5 0.1243蘋果酸 1/5 1/3 1 1 1 1/7 0.0519奎尼酸 1/5 1/3 1 1 1 1/7 0.0519莽草酸 1/5 1/3 1 1 1 1/7 0.0519出膏率 3 5 7 7 7 1 0.4682
根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理,綜合單因素影響試驗結(jié)果,以加水量(A)、煎煮時間(B,第二、三煎加水量為第一次加水量-1倍)、煎煮次數(shù)(C,第二、三煎煎煮時間為第一次煎煮時間-10 min)為考察因素。設(shè)計因素與水平表(見表3)。以綠原酸、原兒茶酸、蘋果酸、奎尼酸、莽草酸含量以及出膏率的綜合評分為評價指標,響應面法優(yōu)化制備工藝,結(jié)果見表4。
表3 Box-Behnken設(shè)計因素與水平表
Tab 3 Factor and level of Box-Behnken design
水平 因素A. 加水量/倍 B. 煎煮時間/min C. 煎煮次數(shù)/次-1 7 20 1 0 8 30 2 1 9 40 3
表4 響應面試驗方案與結(jié)果
Tab 4 Design and results of response surface method
序號 加水量/倍 煎煮時間/min 煎煮次數(shù)/次 綠原酸/% 原兒茶酸/% 蘋果酸/% 奎尼酸/% 莽草酸/% 出膏率/% 綜合評分1 9 20 2 0.262 0.0389 7.09 9.83 1.19 42.22 0.2078 2 8 30 2 0.188 0.0396 7.02 10.64 1.24 40.26 0.1988 3 8 30 2 0.243 0.0445 6.77 10.58 1.20 39.18 0.1937 4 7 40 2 0.192 0.0457 7.23 10.81 1.23 37.12 0.1843 5 8 30 2 0.301 0.0428 6.49 11.10 1.24 38.48 0.1907 6 8 30 2 0.285 0.0400 7.25 11.04 1.30 38.66 0.1919 7 9 40 2 0.289 0.0371 7.84 9.18 1.11 44.35 0.2178 8 8 40 1 0.203 0.0377 9.00 10.79 1.32 27.75 0.1414 9 8 30 2 0.297 0.0381 7.50 10.25 1.27 39.18 0.1941 10 7 30 3 0.276 0.0401 6.53 10.45 1.24 43.46 0.2137 11 9 30 3 0.246 0.0451 5.72 10.57 1.20 46.48 0.2274 12 9 30 1 0.305 0.0419 8.14 12.22 1.43 28.58 0.1459 13 7 30 1 0.344 0.0406 7.53 10.66 1.22 24.55 0.1259 14 8 20 1 0.241 0.0364 8.55 10.90 1.36 28.72 0.1459 15 7 20 2 0.284 0.0412 7.20 10.79 1.25 36.18 0.1801 16 8 40 3 0.352 0.0441 7.37 9.78 1.18 48.98 0.2398 17 8 20 3 0.237 0.0390 7.72 9.71 1.21 44.11 0.2168
采用Design-Expert 10.0 軟件進行多元線性回歸和二項擬合,得到方程為Z
=0.19+0.012A
+4.087×10B
+0.042C
+1.45×10AB
-1.575×10AC
+6.875×10BC
-2.045×10A
+5.705×10B
-0.014C
(R
=0.9920),方差分析見表5,可知各因素影響程度依次為C>A>B;模型P
<0.0001,表明其達到極顯著水平,失擬項不顯著P
=0.1356>0.05,說明模型合適。各因素之間兩兩交互作用對木瓜標準湯劑制備工藝的影響見圖3??芍顑?yōu)工藝為加8.173倍水煎煮39.919 min,煎煮2.997次,結(jié)合實際操作,將其修正為加8倍水煎煮40 min,煎煮3次。圖3 各因素交互作用響應面圖和等高線圖Fig 3 Response surface and contour plots for interaction between factors
表5 響應面回歸模型的方差分析
Tab 5 Variance analysis for the regression model
方差來源 平方和 自由度 均方差 F檢驗 P值模型 0.017 9 1.856×10-3 96.13 <0.0001 A 1.126×10-3 1 1.126×10-3 58.31 0.0001 B 1.337×10-4 1 1.337×10-4 6.92 0.0332 C 0.014 1 0.014 742.25 <0.0001 AB 8.410×10-6 1 8.410×10-6 0.44 0.5284 AC 9.922×10-6 1 9.922×10-6 0.51 0.4815 BC 1.891×10-4 1 1.891×10-4 9.79 0.0163 A2 1.761×10-5 1 1.761×10-5 0.91 0.3529 B2 1.370×10-4 1 1.370×10-4 7.10 0.0301 C2 7.753×10-4 1 7.753×10-4 40.16 0.0004殘差 1.352×10-4 7 1.931×10-5 - -失擬項 9.684×10-5 3 3.228×10-5 3.37 0.1356純誤差 3.831×10-5 4 9.578×10-6 - -總誤差 0.017 16 - - -
根據(jù)優(yōu)化工藝進行3批驗證試驗,結(jié)果顯示3份木瓜飲片標準湯劑的綜合評分分別為0.230、0.224、0.230,平均值為0.228,RSD
為1.7%。與預測值0.240較為接近,說明該工藝合理可行。取木瓜飲片適量,按照一般飲片標準湯劑工藝(一煎7倍量水30 min,二煎6倍量水20 min,濃縮至5倍飲片質(zhì)量)進行煎煮,平行3次,測得6種指標平均值分別為0.192%、0.0457%、7.23%、9.21%、1.18%、36.15%,綜 合 評 分 為0.179。優(yōu)化后的木瓜標準湯劑制備工藝綜合評分優(yōu)于一般制備工藝。L
-蘋果酸、莽草酸、奎尼酸等。大量研究表明該類成分具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、保肝、抗病毒等作用。因此,本研究采用層次分析法對5種有機酸含量和出膏率得到的權(quán)重系數(shù)進行綜合評分。L
-蘋果酸、莽草酸、奎尼酸含量隨煎煮時間的延長,呈現(xiàn)先增加后降低的變化,其原因是該類成分在20 min內(nèi)逐漸被提取,但隨著時間的延長,脂肪族有機酸受熱不穩(wěn)定,其含量下降。綠原酸在40 min時含量下降,該成分為咖啡酸奎尼酸內(nèi)酯,在pH 2.0~3.0或3.0~8.0時,能被酸或堿催化發(fā)生水解。木瓜標準湯劑pH值介于2.9~3.6,綠原酸在此條件下易水解。且綠原酸含量與受熱溫度和時間有關(guān),受熱溫度越高,受熱時間越長,綠原酸越易分解。但在本研究中發(fā)現(xiàn),在減壓濃縮木瓜標準湯劑時,隨溫度的增加和時間的延長,綠原酸損失率較少,并且在湯劑濃縮時,保持了濃縮的真空狀態(tài),猜測綠原酸含量可能與空氣接觸有關(guān)。后期在制備木瓜標準湯劑的同時,應盡量避免與空氣的接觸,可采用減壓濃縮、抽真空的制備工藝。中藥飲片標準湯劑一直以來備受關(guān)注,標準湯劑中的“標準”主要包括中藥材的來源、提取加工的統(tǒng)一性以及質(zhì)量控制的嚴謹性,在不同來源、產(chǎn)地和提取加工方式下,其水煎液質(zhì)量也不盡相同。因此,規(guī)范中藥飲片的制備工藝成為中藥飲片標準湯劑的重點。中藥具有多成分、多靶點的特性,水溶性成分并不能完全表征中藥的特性。中藥標準湯劑是嚴格以水作為提取溶劑,不能以有機溶劑進行提取,這就限制了脂溶性成分在標準湯劑中的溶出。而目前研究的中藥標準湯劑不光是單一的中藥飲片,還延伸出了各種中藥炮制品的標準湯劑、中藥煮散以及復方標準湯劑,后續(xù)關(guān)于標準湯劑的研制是否會以醇提和水提混合制備的方式還不得而知。隨著現(xiàn)代科技的進步,標準湯劑的制備工藝也在不斷完善,不僅能為其配方顆粒提供標準化的制備方案,還能為其臨床應用和相關(guān)新劑型提供理論基礎(chǔ)。