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        Box-Behnken設(shè)計-響應面法優(yōu)化木瓜標準湯劑的制備工藝

        2022-03-30 02:05:12聶淞瑩唐海明汪鋆植王丹陽顏華玲胡浩寧黃永梅三峽大學生物與制藥學院湖北宜昌443000湖北恒安芙林藥業(yè)股份有限公司湖北宜昌44303
        中南藥學 2022年2期
        關(guān)鍵詞:膏率原兒茶酸蘋果酸

        聶淞瑩,唐海明,汪鋆植*,王丹陽,顏華玲,胡浩寧,黃永梅(. 三峽大學生物與制藥學院,湖北宜昌 443000;. 湖北恒安芙林藥業(yè)股份有限公司,湖北 宜昌 44303)

        木瓜又名“皺皮木瓜”“鐵腳梨”,為薔薇科植物貼梗海棠[

        Chaenomeles speciosa

        (Sweet)Nakai]的干燥近成熟的果實,具有舒筋活絡(luò)、和胃化濕的作用,主要化學成分為三萜類、苯丙素類、黃酮類、有機酸類等。其具有鎮(zhèn)痛、抗炎、增強免疫、保肝、抗胃潰瘍與腸損傷、抗腫瘤等藥理活性。中藥飲片標準湯劑是基于中醫(yī)理論和臨床用藥,參考現(xiàn)代提取方法,經(jīng)標準化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎劑。由于中藥材成分復雜,且受產(chǎn)地、區(qū)域、氣候、環(huán)境、加工方式的影響,傳統(tǒng)湯劑制備工藝很難保證臨床療效的一致性和制備工藝的合理性。因此,本文采用多指標層次分析法(AHP)計算各指標權(quán)重,并結(jié)合Box-Behnken響應面法優(yōu)化木瓜標準湯劑的制備工藝參數(shù),旨在為木瓜標準湯劑的制備提供理論依據(jù)。

        1 儀器與試藥

        1.1 儀器

        Thermo Ultimate 3000型高效液相色譜系統(tǒng)(包括高壓輸液系統(tǒng)、二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外可見光檢測器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),賽默飛科技有限公司);RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);TD24K離心機(湖北湘儀儀器公司),PB-10型pH計(德國賽多利斯公司);XSE205DU型十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司),ME204T/02型萬分之一天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司),DTC-27型數(shù)控超聲波清洗器(湖北鼎泰高科有限公司)。

        1.2 試藥

        綠原酸(批號:110753-202018,含量:96.1%)、原兒茶酸(批號:110809-201906,含量:97.7%)、

        L

        -蘋果酸(批號:190014-201302,含量:100%)(對照品,中國食品藥品檢定研究院);莽草酸(批號:C11015240)、奎尼酸(批號:C11520221)(對照品,含量≥98%,上海麥克林生化科技有限公司);木瓜藥材購自湖北宜昌市長陽土家族自治縣,經(jīng)三峽大學王玉兵教授鑒定為貼梗海棠的干燥近成熟果實,符合2020年版《中國藥典》一部要求。乙腈為色譜純(湖北弗頓生化科技有限公司);乙醇為分析純(國藥集團化學試劑有限公司);磷酸為分析純(天津市科密歐化學試劑有限公司);水為超純水(經(jīng)Milli-Q Reference系統(tǒng)凈化),其余試劑均為分析純。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 各成分含量測定

        2.1.1 色譜條件 采用Agilent ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱;流動相乙腈(A)-0.01%磷酸水(B),梯度洗脫(0~8 min,1%A;8~15 min,1%~8%A;15~25 min,8%~10%A;25~35 min,10%~15%A;35~40 min,15%A;40~45 min,15%~1%A;45~55 min,1%A);檢測波長0~8 min:212 nm;9~55 min:280 nm;流速0.8 mL·min;柱溫30℃;進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

        圖1 混合對照品溶液(A)及木瓜提取樣品溶液(B)的HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of mixed reference substance(A)and extracted C. speciosa sample(B)

        2.1.2 對照品溶液制備 分別精密稱取各對照品適量,用流動相B溶解,制成質(zhì)量濃度分別為綠原酸99.5 μg·mL、原兒茶酸18.5 μg·mL、

        L

        -蘋果酸 1940.0 μg·mL、莽草酸536 .0 μg·mL、莽草酸4176.0 μg·mL的儲備液,各精密吸取適量,用流動相B稀釋,即得各質(zhì)量濃度分別為40.3、9.3、194.0、106.2、208.8 μg·mL的對照品溶液。

        2.1.3 供試品溶液制備 精密吸取木瓜水煎液10 mL,置于50 mL量瓶中,無水乙醇定容至刻度,醇沉2 h,4000 r·min離心5 min,精密吸取上清液5 mL,蒸干,殘渣加入流動相B溶液溶解,定容至10 mL,搖勻,即得,置于4℃冰箱中保存。

        2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項下對照品儲備液適量,流動相B溶液配制成6種系列質(zhì)量濃度的溶液,各進樣10 μL測定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(

        X

        ),峰面積為縱坐標(

        Y

        )進行回歸,結(jié)果見表1。

        表1 各成分線性關(guān)系
        Tab 1 Linearity of various constituents

        成分 回歸方程 r 線性范圍/(μg·mL -1)綠原酸 Y=0.3288x-0.3177 0.9998 9.9~99.5原兒茶酸 Y=0.3303x-0.0105 0.9999 0.925~18.5 L-蘋果酸 Y=0.0082x-0.0381 0.9996 97~1940莽草酸 Y=0.4993x+0.3606 0.9999 26.8~536奎尼酸 Y=0.0053x-0.1515 0.9997 208.8~4176

        2.1.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL,連續(xù)進樣6次,測得綠原酸、原兒茶酸、

        L

        -蘋果酸、奎尼酸、莽草酸峰面積的

        RSD

        分別為0.71%、1.4%、1.2%、0.16%、1.6%,表明儀器精密度良好。2.1.6 重復性試驗 取同一制備工藝下的標準湯劑,按“2.1.3”項下方法平行制備6份供試品溶液,進樣測定,測得綠原酸、原兒茶酸、

        L

        -蘋果酸、奎尼酸、莽草酸峰面積的

        RSD

        分別為0.94%、1.6%、1.9%、0.62%、1.0%,表明該方法重復性良好。2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液,分別在0、2、4、8、12、24 h進樣測定,測得綠原酸、原兒茶酸、

        L

        -蘋果酸、奎尼酸、莽草酸峰面積

        RSD

        分別為1.2%、0.95%、0.78%、1.4%、1.3%,表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.1.8 加樣回收試驗 精密吸取供試品溶液5 mL,共6份,精密加入對照品溶液適量,進樣測定,計算回收率。結(jié)果綠原酸、原兒茶酸、

        L

        -蘋果酸、奎尼酸、莽草酸平均加樣回收率分別為96.9%、98.2%、98.6%、99.5%、99.5%,

        RSD

        分別為2.5%、1.8%、1.9%、0.86%、1.6%。

        2.2 單因素試驗

        精密稱取木瓜飲片100 g,加入水浸泡45 min,考察加水量(6、7、8、9、10倍)、煎煮時間(20、30、40、50、60 min)、煎煮次數(shù)(1、2、3次)、濃縮溫度(50、60、70、80℃)等因素,以綠原酸、原兒茶酸、

        L

        -蘋果酸、奎尼酸、莽草酸含量以及出膏率為指標,通過單因素控制變量法,繪制含量動態(tài)分布趨勢圖和出膏率動態(tài)圖,結(jié)果見圖2。根據(jù)試驗結(jié)果,考慮實際操作,選擇加水量8倍、煎煮30 min、煎煮2次作為響應面法的考察水平。

        圖2 各成分含量及出膏率動態(tài)分布趨勢Fig 2 Dynamic distribution trends for various constituents content and dry extract rate

        2.3 層次分析法計算權(quán)重

        經(jīng)測定,木瓜水煎液中主要含有綠原酸、原兒茶酸、莽草酸、

        L

        -蘋果酸、奎尼酸等有機酸。根據(jù)木瓜標準湯劑藥理、藥效作用強弱、各成分含量并結(jié)合文獻將權(quán)重指標予以量化。即將6個指標分為4個層次,并確定指標的優(yōu)先順序:出膏率>綠原酸>原兒茶酸>

        L

        -蘋果酸=奎尼酸=莽草酸,據(jù)此進行成對比較,構(gòu)建優(yōu)先判斷矩陣,得到相對評分,結(jié)果見表2,發(fā)現(xiàn)

        CR

        <0.1,表明矩陣符合一致性檢驗,權(quán)重系數(shù)合理有效。綜合評分

        Y

        =0.2519×綠原酸含量+0.1243×原兒茶酸含量+0.0519×奎尼酸含量+0.0519×莽草酸含量+0.0519×

        L

        -蘋果酸含量+0.4682×出膏率。

        表2 各指標權(quán)重系數(shù)
        Tab 2 Weight coefficients for various indicators

        指標 綠原酸原兒茶酸L-蘋果酸奎尼酸莽草酸出膏率權(quán)重系數(shù) CR綠原酸 1 3 5 5 5 1/3 0.2519 0.0218原兒茶酸 1/3 1 3 3 3 1/5 0.1243蘋果酸 1/5 1/3 1 1 1 1/7 0.0519奎尼酸 1/5 1/3 1 1 1 1/7 0.0519莽草酸 1/5 1/3 1 1 1 1/7 0.0519出膏率 3 5 7 7 7 1 0.4682

        2.4 響應面法

        根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理,綜合單因素影響試驗結(jié)果,以加水量(A)、煎煮時間(B,第二、三煎加水量為第一次加水量-1倍)、煎煮次數(shù)(C,第二、三煎煎煮時間為第一次煎煮時間-10 min)為考察因素。設(shè)計因素與水平表(見表3)。以綠原酸、原兒茶酸、蘋果酸、奎尼酸、莽草酸含量以及出膏率的綜合評分為評價指標,響應面法優(yōu)化制備工藝,結(jié)果見表4。

        表3 Box-Behnken設(shè)計因素與水平表
        Tab 3 Factor and level of Box-Behnken design

        水平 因素A. 加水量/倍 B. 煎煮時間/min C. 煎煮次數(shù)/次-1 7 20 1 0 8 30 2 1 9 40 3

        表4 響應面試驗方案與結(jié)果
        Tab 4 Design and results of response surface method

        序號 加水量/倍 煎煮時間/min 煎煮次數(shù)/次 綠原酸/% 原兒茶酸/% 蘋果酸/% 奎尼酸/% 莽草酸/% 出膏率/% 綜合評分1 9 20 2 0.262 0.0389 7.09 9.83 1.19 42.22 0.2078 2 8 30 2 0.188 0.0396 7.02 10.64 1.24 40.26 0.1988 3 8 30 2 0.243 0.0445 6.77 10.58 1.20 39.18 0.1937 4 7 40 2 0.192 0.0457 7.23 10.81 1.23 37.12 0.1843 5 8 30 2 0.301 0.0428 6.49 11.10 1.24 38.48 0.1907 6 8 30 2 0.285 0.0400 7.25 11.04 1.30 38.66 0.1919 7 9 40 2 0.289 0.0371 7.84 9.18 1.11 44.35 0.2178 8 8 40 1 0.203 0.0377 9.00 10.79 1.32 27.75 0.1414 9 8 30 2 0.297 0.0381 7.50 10.25 1.27 39.18 0.1941 10 7 30 3 0.276 0.0401 6.53 10.45 1.24 43.46 0.2137 11 9 30 3 0.246 0.0451 5.72 10.57 1.20 46.48 0.2274 12 9 30 1 0.305 0.0419 8.14 12.22 1.43 28.58 0.1459 13 7 30 1 0.344 0.0406 7.53 10.66 1.22 24.55 0.1259 14 8 20 1 0.241 0.0364 8.55 10.90 1.36 28.72 0.1459 15 7 20 2 0.284 0.0412 7.20 10.79 1.25 36.18 0.1801 16 8 40 3 0.352 0.0441 7.37 9.78 1.18 48.98 0.2398 17 8 20 3 0.237 0.0390 7.72 9.71 1.21 44.11 0.2168

        采用Design-Expert 10.0 軟件進行多元線性回歸和二項擬合,得到方程為

        Z

        =0.19+0.012

        A

        +4.087×10

        B

        +0.042

        C

        +1.45×10

        AB

        -1.575×10

        AC

        +6.875×10

        BC

        -2.045×10

        A

        +5.705×10

        B

        -0.014

        C

        R

        =0.9920),方差分析見表5,可知各因素影響程度依次為C>A>B;模型

        P

        <0.0001,表明其達到極顯著水平,失擬項不顯著

        P

        =0.1356>0.05,說明模型合適。各因素之間兩兩交互作用對木瓜標準湯劑制備工藝的影響見圖3??芍顑?yōu)工藝為加8.173倍水煎煮39.919 min,煎煮2.997次,結(jié)合實際操作,將其修正為加8倍水煎煮40 min,煎煮3次。

        圖3 各因素交互作用響應面圖和等高線圖Fig 3 Response surface and contour plots for interaction between factors

        表5 響應面回歸模型的方差分析
        Tab 5 Variance analysis for the regression model

        方差來源 平方和 自由度 均方差 F檢驗 P值模型 0.017 9 1.856×10-3 96.13 <0.0001 A 1.126×10-3 1 1.126×10-3 58.31 0.0001 B 1.337×10-4 1 1.337×10-4 6.92 0.0332 C 0.014 1 0.014 742.25 <0.0001 AB 8.410×10-6 1 8.410×10-6 0.44 0.5284 AC 9.922×10-6 1 9.922×10-6 0.51 0.4815 BC 1.891×10-4 1 1.891×10-4 9.79 0.0163 A2 1.761×10-5 1 1.761×10-5 0.91 0.3529 B2 1.370×10-4 1 1.370×10-4 7.10 0.0301 C2 7.753×10-4 1 7.753×10-4 40.16 0.0004殘差 1.352×10-4 7 1.931×10-5 - -失擬項 9.684×10-5 3 3.228×10-5 3.37 0.1356純誤差 3.831×10-5 4 9.578×10-6 - -總誤差 0.017 16 - - -

        根據(jù)優(yōu)化工藝進行3批驗證試驗,結(jié)果顯示3份木瓜飲片標準湯劑的綜合評分分別為0.230、0.224、0.230,平均值為0.228,

        RSD

        為1.7%。與預測值0.240較為接近,說明該工藝合理可行。取木瓜飲片適量,按照一般飲片標準湯劑工藝(一煎7倍量水30 min,二煎6倍量水20 min,濃縮至5倍飲片質(zhì)量)進行煎煮,平行3次,測得6種指標平均值分別為0.192%、0.0457%、7.23%、9.21%、1.18%、36.15%,綜 合 評 分 為0.179。優(yōu)化后的木瓜標準湯劑制備工藝綜合評分優(yōu)于一般制備工藝。

        3 討論

        3.1 評價指標的確定

        指標成分含量、指標成分轉(zhuǎn)移率和出膏率是評價木瓜標準湯劑的重要參數(shù)。在指標成分含量方面,2020年版《中國藥典》是以齊墩果酸和熊果酸為指標進行質(zhì)量評價,但該類成分在提取過程中轉(zhuǎn)移率較低,且在水煎液中基本不能溶出,故不太適合作為評價標準湯劑的指標。本研究經(jīng)前期HPLC色譜定性分析,檢測到木瓜水煎液中主要包含水溶性有機酸,如綠原酸、原兒茶酸、

        L

        -蘋果酸、莽草酸、奎尼酸等。大量研究表明該類成分具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、保肝、抗病毒等作用。因此,本研究采用層次分析法對5種有機酸含量和出膏率得到的權(quán)重系數(shù)進行綜合評分。

        3.2 有機酸穩(wěn)定性探討

        在單因素試驗中,

        L

        -蘋果酸、莽草酸、奎尼酸含量隨煎煮時間的延長,呈現(xiàn)先增加后降低的變化,其原因是該類成分在20 min內(nèi)逐漸被提取,但隨著時間的延長,脂肪族有機酸受熱不穩(wěn)定,其含量下降。綠原酸在40 min時含量下降,該成分為咖啡酸奎尼酸內(nèi)酯,在pH 2.0~3.0或3.0~8.0時,能被酸或堿催化發(fā)生水解。木瓜標準湯劑pH值介于2.9~3.6,綠原酸在此條件下易水解。且綠原酸含量與受熱溫度和時間有關(guān),受熱溫度越高,受熱時間越長,綠原酸越易分解。但在本研究中發(fā)現(xiàn),在減壓濃縮木瓜標準湯劑時,隨溫度的增加和時間的延長,綠原酸損失率較少,并且在湯劑濃縮時,保持了濃縮的真空狀態(tài),猜測綠原酸含量可能與空氣接觸有關(guān)。后期在制備木瓜標準湯劑的同時,應盡量避免與空氣的接觸,可采用減壓濃縮、抽真空的制備工藝。

        3.3 中藥飲片標準湯劑探討

        中藥飲片標準湯劑一直以來備受關(guān)注,標準湯劑中的“標準”主要包括中藥材的來源、提取加工的統(tǒng)一性以及質(zhì)量控制的嚴謹性,在不同來源、產(chǎn)地和提取加工方式下,其水煎液質(zhì)量也不盡相同。因此,規(guī)范中藥飲片的制備工藝成為中藥飲片標準湯劑的重點。中藥具有多成分、多靶點的特性,水溶性成分并不能完全表征中藥的特性。中藥標準湯劑是嚴格以水作為提取溶劑,不能以有機溶劑進行提取,這就限制了脂溶性成分在標準湯劑中的溶出。而目前研究的中藥標準湯劑不光是單一的中藥飲片,還延伸出了各種中藥炮制品的標準湯劑、中藥煮散以及復方標準湯劑,后續(xù)關(guān)于標準湯劑的研制是否會以醇提和水提混合制備的方式還不得而知。隨著現(xiàn)代科技的進步,標準湯劑的制備工藝也在不斷完善,不僅能為其配方顆粒提供標準化的制備方案,還能為其臨床應用和相關(guān)新劑型提供理論基礎(chǔ)。

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