楊子燁,張桂梅,王佩華,王慧楠,姜明瑞,張婧秋,岳珠珠,王志成,胡宇峰,王英姿(北京中醫(yī)藥大學中藥學院,北京 102488)
當歸是傘形科植物Angelicae sinensis
(Oliv.)Diels的干燥根,藥用歷史悠久,具有補血活血,調經(jīng)止痛的功效,經(jīng)酒炙后可以增強其活血化瘀、通經(jīng)活絡的作用,引藥上行。2020年版《中國藥典》四部通則0213規(guī)定“酒炙時,除另有規(guī)定,一般用黃酒”,但由于黃酒的種類繁多,其酒精度、含糖量、總酸等理化性質各不相同,對飲片質量的影響程度也不同,目前未見黃酒種類對酒當歸飲片質量影響的研究報道。因此,本試驗在黃酒理化性質的基礎上,以市場上常用的干型、半干型、半甜型黃酒炮制的15批酒當歸飲片為研究對象,以飲片中阿魏酸、多糖、醇溶浸出物、水溶浸出物、總灰分、酸不溶性灰分為指標,采用層次分析法(AHP)-熵權法(EWA)對其進行綜合評價,為酒當歸飲片的藥效物質基礎及飲片質量評價研究提供參考。
MS-5型炒貨機(邁斯機械有限公司);日本島津高效液相色譜儀(SIL-20A自動進樣器,SPD-20A紫外可見檢測器,CTO-10A SVP柱溫箱);BSI10型1/1萬電子天平(Sartorius);KH7200DB型數(shù)控超聲波清洗機(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);ZN-02小型粉碎機(北京興時利和科技發(fā)展有限公司);Research plus 單道可調量程移液器(3120000267,德國Eppendorf);電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9030A,北京北方利輝實驗儀器設備有限公司);紫外-可見分光光度計(756PC,上海舜宇恒平科學儀器有限公司);電熱恒溫水浴鍋(HH-S4)、SX-2.5-10箱式電阻爐(北京科偉永興儀器有限公司);渦旋儀(MX-S,DRAGONLAB);U-3010 型色度儀(日本株式會社日立高新技術)。
Angelica sinensis
(Oliv.)Diels的干燥根。乙腈、甲醇[色譜純,賽默飛世爾科技(中國)有限公司],其余試劑均為分析純,水為純凈水。阿魏酸對照品(批號:110773-201614,純度:99.0%,中國食品藥品檢定研究院),無水葡萄糖對照品(批號:E1624080,純度≥99.0%,aladdin);5%苯酚溶液(Biotopped)。收集了15批黃酒,涵蓋11個黃酒產(chǎn)地及3種黃酒類型,黃酒的類型由總糖含量區(qū)分,GB/T 13662-2018《黃酒》國家推薦標準規(guī)定:干黃酒含糖量小于15 g·L,半干黃酒含糖量為15~40 g·L,半甜型黃酒含糖量為40.1~100 g·L。黃酒的具體信息見表1。
表1 黃酒樣品信息
Tab 1 Sample information
編號 來源 產(chǎn)地 類型 批號J1 會稽山加飯酒 浙江紹興 半干型 6905321179012 J2 老恒和陳年花雕酒 浙江湖州 半干型 6914239201579 J3 紹興元紅酒 浙江紹興 干型 6921334981084 J4 塔牌陳年貢酒 浙江紹興 干型 6901206031055 J5 紹興黃酒 浙江紹興 干型 6910384699612 J6 企業(yè)提供1 北京 干型 190801 J7 企業(yè)提供2 甘肅臨夏 半甜型 6918104518182 J8 即墨黃酒 山東青島 半甜型 6903608015732 J9 企業(yè)提供3 浙江杭州 干型 F-SYHJ-19-13 J10 企業(yè)提供4 浙江紹興 半干型 6925455803157 J11 石庫門黃酒 上海 半干型 6025455803157 J12 企業(yè)提供5 河北保定 半干型 D210101 J13 企業(yè)提供6 浙江杭州 干型 F-SYHJ-19-12 J14 古南豐黃酒 安徽宣城 半干型 6920761100792 J15 銀明黃酒 四川南充 半干型 6920398557884
分別取當歸飲片100 g,加不同種類輔料黃酒(J1~J15)10 mL、拌勻,悶潤1.0 h至黃酒被吸盡,于120℃炒制15 min,取出放涼,即得(S1~S15)。
取收集的15批黃酒,根據(jù)GB/T 13662-2018《黃酒》中相關方法對理化性質(總糖、非糖固形物、總酸、氨基酸態(tài)氮、氧化鈣、酒精度和pH值)進行測定,結果見表2,各批黃酒理化性質具有一定差異,但均符合國家輔料標準。
表2 黃酒理化性質測定結果(=3)
Tab 2 Physical and chemical property of rice wine (=3)
樣品 總糖/(g·L-1)非糖固形物/(g·L-1) 總酸/(g·L-1) 氨基酸態(tài)氮/(g·L-1) 氧化鈣/(g·L-1) 酒精度/% pH J1 33.600 32.440 5.295 0.684 0.025 17.197 4.21 J2 32.480 38.173 5.640 0.698 0.021 16.853 4.18 J3 7.600 17.627 3.936 0.362 0.079 13.006 4.09 J4 10.000 31.120 3.957 0.651 0.031 16.023 4.19 J5 14.000 18.993 3.657 0.593 0.001 12.507 4.04 J6 12.000 14.467 3.242 0.303 0.008 13.057 4.09 J7 49.600 56.464 3.894 0.420 0.233 13.037 4.07 J8 50.300 13.341 4.137 0.420 0.088 13.667 4.28 J9 8.600 26.124 3.867 0.476 0.026 11.237 4.19 J10 30.000 19.087 3.977 0.266 0.050 13.433 4.15 J11 30.600 22.880 6.930 1.134 0.247 14.532 4.59 J12 30.800 16.820 2.970 0.392 0.058 14.940 4.35 J13 9.600 51.560 6.210 0.266 0.516 12.320 4.53 J14 31.400 14.460 4.230 0.658 0.092 14.000 4.25 J15 16.600 22.560 3.209 0.406 0.155 8.665 4.53
2.3.1 色譜條件 色譜柱:Agilent Extend-C(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相:乙腈-0.085%磷酸(17∶83),檢測波長:316 nm,進樣量:10 μL,進樣時間:30 min,流速:1.0 mL·min,柱溫:35℃,HPLC色譜圖見圖1。
圖1 對照品(A)和酒當歸供試品(B)的HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of the reference substance(A)and wine Angelica sinensis decoction pieces(B)
2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取酒當歸粉末(過3號篩)0.20 g,置于50 mL具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇20 mL,密塞,稱定質量,于80℃水浴加熱回流30 min,放冷,再次稱定質量,用70%甲醇補足減失的質量,搖勻后靜置,取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾,即得。
2.3.3 對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對照品5.10 mg置于50 mL棕色量瓶中,加70%甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,作為對照品備用液。精密吸取2.5 mL對照品備用液,置于25 mL棕色量瓶中,用70%甲醇定容至刻度,搖勻后即得10.10 μg·mL的阿魏酸對照品溶液。
2.3.4 線性關系考察 稱取適量阿魏酸對照品,配制質量濃度分別為2、6、10、16、18、20 μg·mL的對照品溶液,進樣測定,以峰面積為縱坐標,樣品質量濃度為橫坐標,得回歸方程為:A
=6.07×10C
+2.71×10,R
2=0.9992,結果表明阿魏酸在2~20 μg·mL與峰面積呈良好的線性關系。2.3.5 精密度試驗 精密吸取“2.3.3”項下的對照品溶液10 μL,連續(xù)進樣6次,結果阿魏酸峰面積的RSD
為0.38%,表明精密度良好。2.3.6 重復性試驗 精密稱取同一批酒當歸樣品粉末共6份,按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液,進樣測定,得阿魏酸含量的RSD
為1.9%,結果表明方法重復性良好。2.3.7 穩(wěn)定性試驗 精密稱取同一批酒當歸供試品溶液,分別在0、2、4、8、10、12 h時進樣分析,得阿魏酸含量的RSD
為0.83%,結果表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。2.3.8 加樣回收試驗 精密稱取適量已知阿魏酸含量的同一批酒當歸樣品粉末6份,按照等比的量分別精密加入阿魏酸對照品,制備供試品溶液,進樣測定。得阿魏酸的回收率在96.76%~104.51%,平均回收率為101.74%,RSD
=1.1%,表明該方法準確可靠。2.3.9 樣品含量測定 分別取15批酒當歸粉末,制備樣品溶液,依“2.3.1”項下色譜條件測定。計算酒當歸中阿魏酸指標成分的含量,結果見表3。
表3 黃酒炒制當歸飲片中主要成分平均含量(=3,%)
Tab 3 Average content of main components in different wine decoction pieces (=3,%)
編號 阿魏酸 多糖 醇溶浸出物水溶浸出物 總灰分 酸不溶性灰分S1 0.052 4.970 0.611 0.622 5.340 0.480 S2 0.051 4.510 0.609 0.639 5.290 0.420 S3 0.050 4.100 0.542 0.588 4.790 0.580 S4 0.045 3.570 0.594 0.593 4.490 0.380 S5 0.050 4.300 0.539 0.535 5.000 0.560 S6 0.050 4.250 0.510 0.599 5.020 0.540 S7 0.050 4.020 0.555 0.623 5.330 0.700 S8 0.048 3.860 0.584 0.624 4.970 0.480 S9 0.040 3.970 0.605 0.624 4.740 0.540 S10 0.048 3.790 0.602 0.607 5.000 0.410 S11 0.045 4.280 0.584 0.646 4.840 0.360 S12 0.049 4.120 0.592 0.643 5.030 0.360 S13 0.049 3.020 0.601 0.604 6.290 0.520 S14 0.048 4.410 0.596 0.567 4.480 0.390 S15 0.047 3.650 0.607 0.576 4.570 0.410
2.4.1 測定條件 精密量取供試品溶液1.0 mL,置具塞試管中,加入5%苯酚溶液2.0 mL,再加入濃硫酸7 mL,渦旋搖勻20 s后置于70℃水浴中加熱20 min,取出,冰浴5 min后靜置1 h。另以蒸餾水1.0 mL加入相應的試劑同法操作作為空白,在490 nm處測定吸光度。
2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取在105℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品10.38 mg,置于100 mL棕色量瓶中,用蒸餾水溶解并稀釋至刻度,搖勻,得0.1038 mg·mL的葡萄糖對照品溶液。
2.4.3 供試品溶液的制備 精密稱取酒當歸樣品粉末(過3號篩)0.20 g,精密稱定,加80%乙醇100 mL回流1 h,濾過,棄去濾液。濾渣加水50 mL回流2 h,趁熱抽濾,濾液全部轉移到100 mL棕色量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,搖勻即得。
2.4.4 線性關系考察 取葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,分別加水稀釋至2 mL,取樣1 mL,置于具塞試管中,顯色,于490 nm下測定吸光度,以溶液質量濃度為橫坐標,以吸光度為縱坐標,得到線性回歸方程:A
=0.105C
-0.0135,R
2=0.999。結果表明,當歸多糖在5.19~51.90 μg·mL與吸光度呈良好的線性關系。2.4.5 精密度試驗 取對照品溶液1 mL,顯色后于490 nm處測定吸光度,重復6次,結果吸光度RSD
為0.055%,說明儀器精密度良好。2.4.6 重復性試驗 精密稱取同一批當歸樣品粉末,平行制備6份供試品溶液,顯色后分別在490 nm處測定吸光度并計算含量,結果吸光度RSD
為1.4%,表明該方法重復性良好。2.4.7 穩(wěn)定性試驗 精密稱取樣品粉末,制備供試品溶液,分別于顯色后0、10、20、40、60、120 min時測定,結果吸光度RSD
為0.57%,表明樣品在120 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.4.8 加樣回收試驗 精密稱取已知多糖含量的酒當歸樣品6份,等比分別精密加入葡萄糖對照品溶液,制備供試品溶液,顯色后,于490 nm處測定并計算,結果加樣回收率分別為98.64%、101.14%、101.65%、99.81%、97.27%、102.14%,RSD
為1.9%,表明該方法準確度高。用70%乙醇和水作為溶劑,照2020年版《中國藥典》四部通則2201熱浸法測定,計算供試品中醇溶性浸出物和水溶性浸出物的含量,結果見表3。
按照2020年版《中國藥典》四部通則2302計算總灰分和酸不溶性灰分含量,結果見表3。
CR
=CI
/RI
,可以驗證所得權重系數(shù)是否合理,當CR
<0.1時,可判定矩陣符合一致性檢驗。比較矩陣情況及各參數(shù)結果見表4。圖2 AHP評價結構模型Fig 2 Structure model evaluation by analytic hierarchy process
表4 酒當歸中6個指標兩兩比較的判斷優(yōu)先矩陣及權重系數(shù)
Tab 4 Judgment priority matrix and weight coefficient of 6 indexes in wine decoction pieces
指標成分 阿魏酸 多糖 醇溶浸出物 水溶浸出物 總灰分 酸不溶性灰分 Aj' Aj λmax CR阿魏酸 1 2 3 3 5 5 2.334 0.389 6.000 0.000多糖 1/2 1 3/2 3/2 5/2 5/2 1.170 0.195醇溶浸出物 1/3 2/3 1 1 5/3 5/3 0.780 0.130水溶浸出物 1/3 2/3 1 1 5/3 5/3 0.780 0.130總灰分 1/5 2/5 3/5 3/5 1 1 0.468 0.078酸不溶性灰分 1/5 2/5 3/5 3/5 1 1 0.468 0.078
2.7.2 EWA客觀賦權 熵權法是計算指標的信息熵,利用指標的差值程度來衡量已知數(shù)據(jù)中包含的有效信息和指標權重,可用于在多指標評價系統(tǒng)中用來確定各指標權重。集合酒當歸15個評價對象和6個評價指標,形成熵權評價體系的初始數(shù)據(jù)矩陣A
={X
}(i
=1、2、3…m
;j
=1、2、3…n
)。然后對每個指標原始數(shù)據(jù)按照公式3進行標準化處理。根據(jù)熵的定義(公式4),確定各個指標的熵值H
、H
、H
…H
。最后根據(jù)熵值計算評價指標的權重(公式5),具體結果見表5。表5 EWA計算酒當歸各指標信息熵及權重
Tab 5 Information entropy and weight of each index in wine decoction pieces by EWA
指標 信息熵Hj 權重Wj阿魏酸 0.9639 0.1452多糖 0.9558 0.1781醇溶浸出物 0.9543 0.1840水溶浸出物 0.9551 0.1806總灰分 0.9669 0.1333酸不溶性灰分 0.9556 0.1788
2.7.3 組合權重的確定 采用AHP得到的指標權重與EWA得到的指標熵權相結合,根據(jù)得到綜合權重。確定得阿魏酸、多糖、醇溶浸出物、水溶浸出物、總灰分、酸不溶性灰分最終權重分別為0.347、0.213、0.147、0.144、0.064、0.086。
2.7.4 綜合評分 從質量評價的角度分析,阿魏酸、多糖、醇溶浸出物和水溶浸出物的含量越高質量越好,總灰分和酸不溶性灰分含量越低質量越好。因此,為了統(tǒng)一評價標準,將總灰分和酸不溶性灰分含量進行取倒數(shù)轉換。評價指標統(tǒng)一后,將酒當歸飲片含量測定原始數(shù)據(jù)進行標準化處理,按公式Y
=(X
-minX
)/(maxX
-minX
)進行計算,結果見表6。表6 酒當歸飲片原始數(shù)據(jù)標準化
Tab 6 Standardization of the original data of wine decoction pieces
編號 阿魏酸 多糖 醇溶浸出物水溶浸出物 總灰分酸不溶性灰分S1 1.0000 1.0000 1.0000 0.8348 0.4403 0.4853 S2 0.9426 0.7641 0.9771 1.0000 0.4679 0.7059 S3 0.8443 0.5538 0.3151 0.5082 0.7751 0.2191 S4 0.4016 0.2821 0.8360 0.5556 0.9923 0.8916 S5 0.8443 0.6564 0.2873 0.0000 0.6386 0.2647 S6 0.8689 0.6308 0.0000 0.6135 0.6262 0.3137 S7 0.8443 0.5128 0.4414 0.8435 0.4458 0.0000 S8 0.6393 0.4308 0.7326 0.8599 0.6574 0.4853 S9 0.0000 0.4872 0.9423 0.8580 0.8094 0.3137 S10 0.7131 0.3949 0.9125 0.6899 0.6386 0.7489 S11 0.4508 0.6462 0.7276 1.0715 0.7415 1.0000 S12 0.7295 0.5641 0.8072 1.0386 0.6200 1.0000 S13 0.7869 0.0000 0.9036 0.6618 0.0000 0.3665 S14 0.6639 0.7128 0.8539 0.3034 1.0000 0.8416 S15 0.5574 0.3231 0.9612 0.3942 0.9316 0.7489
根據(jù)綜合評價函數(shù)計算不同批酒當歸飲片的綜合得分并進行排序。綜合得分=阿魏酸×0.347+多糖×0.213+醇溶浸出物×0.147+水溶浸出物×0.144+總灰分×0.064+酸不溶性灰分×0.086。不同黃酒炮制酒當歸飲片的各指標含量及綜合評分各不相同,表明酒當歸飲片質量與黃酒種類有關,結果見表7。
表7 不同黃酒對酒當歸飲片影響的綜合評價結果
Tab 7 Effect of different rice wine on wine decoction pieces
編號 綜合評分 綜合排序 編號 綜合評分 綜合排序S1 89.71 1 S5 59.89 9 S2 86.81 2 S3 59.13 10 S12 76.72 3 S6 58.43 11 S11 68.88 4 S15 54.25 12 S14 68.78 5 S4 53.87 13 S10 67.03 6 S13 53.27 14 S8 62.89 7 S9 44.46 15 S7 61.71 8
2.7.5 黃酒理化性質與酒當歸質量相關性分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對黃酒理化性質指標與酒當歸飲片質量AHP-EWA綜合評分進行相關性分析,結果顯示黃酒的總糖、酒精度與酒當歸質量具有明顯相關性,見表8。當總糖含量在8.6~33.6 g·L(干型、半干型),相關系數(shù)r
達到0.812(P
<0.01),兩者關系更緊密。表8 黃酒理化性質與酒當歸飲片質量的相關性分析結果()
Tab 8 Correlation between physical and chemical properties of rice wine and the quality of wine decoction pieces ()
注(Note):<0.05,<0.01。
相關系數(shù) 總糖 非糖固形物 總酸 氨基酸態(tài)氮 氧化鈣 酒精度 pH r 0.515#0.0070.334 0.376 -0.2490.752##0.0095
2.7.6 酒當歸有效成分含量與顏色值相關性分析
利用色度儀對15批酒當歸飲片樣品進行測定。以D65為光源,經(jīng)標準白板校正后,記錄色度值L*
(表示明度)、a*
(表示紅綠方向)、b*
(表示黃藍方向)。樣品顏色可用總色值E*ab
表示,公 式 為E*ab
=(L*
+a*
+b*
)。每 個 樣品重復測定 3 次,取平均值,結果見表9。采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對酒當歸飲片中阿魏酸、多糖、醇溶浸出物、水溶浸出物、總灰分、酸不溶性灰分含量與顏色值L*
、a*
、b*
、E*ab
進行相關性分析。結果顯示,阿魏酸含量與a*
、b*
成正相關;多糖含量與L*
、E*ab
成正相關,見表10。表9 15批酒當歸有效成分含量與顏色值測定結果(=3)
Tab 9 Content of active ingredients and color values of 15 batches of wine decoction pieces
編號 L* a* b* E*ab J1 79.47 2.31 22.41 82.60 J2 78.99 2.27 22.01 82.03 J3 80.72 2.29 21.73 83.63 J4 75.69 2.03 20.41 78.42 J5 80.34 2.35 21.94 83.32 J6 80.16 2.36 22.02 83.16 J7 79.95 2.32 21.83 82.91 J8 78.96 2.26 20.93 81.72 J9 79.55 2.16 20.07 82.07 J10 78.21 2.28 22.12 81.31 J11 79.07 2.14 20.79 81.79 J12 79.67 2.19 21.57 82.57 J13 76.52 2.26 21.16 79.42 J14 77.11 2.16 20.68 79.86 J15 78.41 2.03 20.11 80.97
表10 酒當歸飲片有效成分含量與顏色值相關性分析結果()
Tab 10 Correlation between content of active ingredients and color values of wine decoction pieces ()
注(Note):<0.05,<0.01。
指標成分 L* a* b* E*ab阿魏酸 0.273 0.656## 0.817## 0.363多糖 0.540# 0.345 0.473 0.565#醇溶浸出物 -0.557 -0.550 -0.367 -0.566水溶浸出物 0.103 -0.019 0.076 0.107總灰分 -0.027 0.533 0.453 0.036酸不溶性灰分 0.501 0.626 0.314 0.507
a*
、b*
越高,阿魏酸含量越高;L*
、E*ab
越高,多糖含量越高。本研究表明,酒當歸指標成分阿魏酸、多糖與飲片表觀顏色值具有顯著相關性。本試驗在研究黃酒理化性質差異的基礎上,對酒當歸中阿魏酸、多糖、醇溶浸出物、水溶浸出物、總灰分、酸不溶性灰分含量進行測定,并采用AHP-EWA法對酒當歸飲片進行綜合質量評價,探討了輔料黃酒內(nèi)在性質對酒當歸質量的影響,結果表明該方法可使酒當歸質量評價結果更客觀,可為其他中藥材及中藥飲片的質量評價提供參考。