呂義俊，孫 齊，郭唐芳，李興森，劉懷臣

（勁牌有限公司，湖北 大冶 435100）

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

材料：糯高粱、粳高粱、發(fā)酵槽車(chē)。

儀器設(shè)備：勁牌有限公司楓林酒廠車(chē)間生產(chǎn)設(shè)備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

分別選取粳高粱生產(chǎn)車(chē)間及糯高粱生產(chǎn)車(chē)間同一天生產(chǎn)批次，從入箱糖化開(kāi)始，到發(fā)酵第15 天結(jié)束，每天取糖化醅和酒醅樣進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，檢測(cè)酵母數(shù)、霉菌數(shù)、細(xì)菌數(shù)、原酒五大色譜指標(biāo)（甲醇、乙醛、正丙醇、乙酸乙酯、雜醇油）含量，取樣及檢測(cè)方法如下。

取樣方法：糧食糖化完成后，選取糖化箱床中間區(qū)域取上中下層糖化醅進(jìn)行混合；然后跟蹤該區(qū)域糧食對(duì)應(yīng)的多個(gè)發(fā)酵槽車(chē)，每天取距表層20～30 cm 高度的酒醅樣品，為了避免取樣進(jìn)入氧氣對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響，每次取樣后扎緊槽車(chē)并換一個(gè)區(qū)域進(jìn)行取樣。取樣后一部分作為微生物計(jì)數(shù)樣品，另一部分采用“50 g 樣品+50 mL 無(wú)水乙醇”萃取法，先后于搖床30 min、超聲波水浴30 min、離心機(jī)12000 r/min 離心10 min，取上清液進(jìn)行色譜檢測(cè)，每個(gè)樣品酒醅檢測(cè)3個(gè)平行樣，如果3個(gè)平行樣檢測(cè)差別在10 %以?xún)?nèi)則取均值，大于10 %則取差別較小的2組數(shù)據(jù)的均值。

細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母數(shù)檢測(cè)：采用稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法，準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g 樣品于裝有100 mL 無(wú)菌水的250 mL三角瓶中，置于30 ℃，150 r/min恒溫?fù)u床中振蕩15 min，準(zhǔn)確吸取1 mL 菌液于裝有9 mL無(wú)菌水的試管中稀釋10倍，然后準(zhǔn)確吸取1 mL 稀釋菌液，分別接種牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基、YPD 培養(yǎng)基，然后置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后數(shù)菌落數(shù)，單位為CFU/g。

GC 分析條件：氣相色譜儀：Focus 8890，色譜柱：INNOWax 30 m×0.53 mm×1 μm。升溫順序?yàn)椋?0 ℃保持5 min，以6 ℃/min 升至70 ℃，再以10 ℃/min 升溫速度升至220 ℃，保持5 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度280 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉菌數(shù)量變化

霉菌是清香型小曲中的主要糖化菌類(lèi)，霉菌主要有根霉、曲霉和毛霉等，為好氧菌。現(xiàn)用小曲中以米根霉為主，其發(fā)育溫度30～35 ℃，最適溫度32 ℃，各類(lèi)霉菌增殖主要以延伸菌絲的生長(zhǎng)為主，產(chǎn)生大量淀粉酶系，提前將一部分淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖，并供給酵母的生長(zhǎng)增殖。由圖1 可知，糯高粱從糧糟混合開(kāi)始到發(fā)酵2 d 內(nèi)，霉菌在有氧條件下快速增長(zhǎng)繁殖，頂峰為9.70×10CFU/g，此階段主要為霉菌利用酒醅中殘余的氧氣進(jìn)行糖化和生長(zhǎng)，因此霉菌生長(zhǎng)迅速，經(jīng)酒醅溶氧含量檢測(cè)顯示，發(fā)酵24～30 h 酒醅中氧氣含量耗盡（詳見(jiàn)圖2），與該結(jié)論互相印證；發(fā)酵第3 天霉菌數(shù)量急劇減少，與發(fā)酵第4 天存在較大差異，應(yīng)為檢測(cè)誤差所致；從發(fā)酵第4 天至發(fā)酵15 d，酒醅中霉菌數(shù)量處于緩慢下降趨勢(shì)，第15 天霉菌數(shù)量為5.6×10CFU/g；粳高粱從糧糟混合開(kāi)始到發(fā)酵5 d 內(nèi)，霉菌快速增長(zhǎng)繁殖，頂峰為11.2×10CFU/g，發(fā)酵6 d 起逐漸減少至發(fā)酵15 d 的2.37×10CFU/g。綜合對(duì)比，糯高粱糖化醅、入池醅霉菌量較粳高粱高，且前期增殖速度較粳高粱快、到達(dá)頂峰時(shí)間早，原因有如下兩點(diǎn)：①糯高粱幾乎全為支鏈淀粉，與直鏈淀粉相比易于糊化及糖化；②糯高粱開(kāi)箱涎水豐富、入池溫度較粳高粱高2～3 ℃，微生物酶活高、代謝速率快。

圖1 霉菌數(shù)量變化趨勢(shì)圖

圖2 發(fā)酵過(guò)程溶氧變化趨勢(shì)圖

2.2 酵母菌數(shù)量變化

酵母菌是清香型小曲中的主要發(fā)酵菌類(lèi)，釀酒酵母為兼性厭氧菌，氧氣充足時(shí)大量增殖（芽殖），氧氣極少或無(wú)氧時(shí)調(diào)節(jié)代謝途徑進(jìn)行厭氧發(fā)酵，最佳生長(zhǎng)溫度為30 ℃左右，溫度越高增殖和衰亡速度越快，不宜超過(guò)38 ℃。從圖3 可以看出，糯高粱和粳高粱均在發(fā)酵第1 天有一個(gè)短期的增長(zhǎng)繁殖、發(fā)酵第6 天達(dá)到最高值，其中糯高粱逐步上升，并于發(fā)酵第6 天達(dá)到最高值2.49×10CFU/g，然后又逐漸降低至發(fā)酵結(jié)束的10數(shù)量級(jí)；粳高粱在發(fā)酵2～5 d動(dòng)態(tài)波動(dòng)，于發(fā)酵第6、7天達(dá)到最高值1.07×10CFU/g。由于實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，酵母菌平板計(jì)數(shù)時(shí)存在菌落不明顯、多不可計(jì)的現(xiàn)象，導(dǎo)致粳高粱數(shù)據(jù)存在較大波動(dòng)，該折線(xiàn)圖僅可代表酵母菌增長(zhǎng)趨勢(shì)，而不能準(zhǔn)確反應(yīng)其數(shù)量級(jí)，可證明高粱品種特性對(duì)酵母增殖影響較大，酵母菌增殖差異是實(shí)際生產(chǎn)中粳高粱與糯高粱雜醇油差別較大的主要原因。

圖3 酵母菌數(shù)量變化趨勢(shì)圖

2.3 細(xì)菌數(shù)量變化

細(xì)菌種類(lèi)繁多，廣泛分布在釀造生產(chǎn)環(huán)境中，部分兼有糖化和發(fā)酵的作用，小曲酒生產(chǎn)由于環(huán)境原因，細(xì)菌種類(lèi)相對(duì)偏少，常見(jiàn)的有醋酸菌、乳酸菌和丁酸菌等，在發(fā)酵過(guò)程中分別產(chǎn)生乙酸、乳酸和丁酸，適量細(xì)菌生長(zhǎng)可為小曲酒生香和配糟提酸產(chǎn)生一定好處，過(guò)量則會(huì)產(chǎn)生危害。從圖4可以看出,糯高粱和粳高粱糖化發(fā)酵過(guò)程，均表現(xiàn)為細(xì)菌數(shù)量先上升后下降的趨勢(shì)。

圖4 細(xì)菌數(shù)量變化趨勢(shì)圖

2.4 色譜指標(biāo)變化

2.4.1 乙醛

小曲白酒中乙醛主要是酵母菌在EMP 途徑中產(chǎn)生，由葡萄糖酵解生成的丙酮酸脫羧而成，為乙醇的前體物質(zhì)。從圖5 可以看出，糯高粱和粳高粱在發(fā)酵第1～2 天時(shí)乙醛有大幅度升高，此過(guò)程為葡萄糖大量酵解產(chǎn)生的丙酮酸脫羧生成乙醛造成，化學(xué)反應(yīng)式：CHO→2CHCOCOOH+4[H]+ATP→2CHCHO+2CO；第3～4天降低至最低值,此過(guò)程為酵母的無(wú)氧發(fā)酵開(kāi)始,乙醛在乙醇脫氫酶的作用下被快速還原為乙醇；而后乙醛整體呈緩慢上升趨勢(shì)，其生成途徑為由酒精氧化而成，化學(xué)反應(yīng)式：2CHOH+O→2CHCHO+2HO，發(fā)酵槽車(chē)薄膜松動(dòng)導(dǎo)致內(nèi)部（尤其是表層）有少量空氣進(jìn)入，導(dǎo)致此途徑的發(fā)生。

圖5 乙醛含量變化趨勢(shì)圖

2.4.2 甲醇

小曲白酒中的甲醇是由植物原材料表皮中的果膠質(zhì)在加熱蒸煮過(guò)程或者酶的作用下水解生成的甲氧基還原而成的，糖化及發(fā)酵過(guò)程酒曲中的黑曲霉產(chǎn)生的果膠酶會(huì)促進(jìn)果膠質(zhì)的水解。從圖6可以看出，糯高粱、粳高粱糖化醅中甲醇含量較高，說(shuō)明在經(jīng)過(guò)高溫蒸煮后，糖化過(guò)程甲醇含量已達(dá)到頂峰；在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中,甲醇含量整體呈輕微下降趨勢(shì)。糯高粱甲醇含量整體略高于粳高粱，與車(chē)間實(shí)際大生產(chǎn)數(shù)據(jù)較吻合。

圖6 甲醇含量變化趨勢(shì)圖

2.4.3 正丙醇

小曲白酒中正丙醇主要是在酵母菌的糖厭氧發(fā)酵過(guò)程中作為副產(chǎn)物產(chǎn)生的，酵母菌的衰亡也會(huì)產(chǎn)生正丙醇。從圖7 可以看出，糯高粱、粳高粱糖化醅中正丙醇含量較高，而糧糟混合后數(shù)據(jù)下降較大，說(shuō)明糖化過(guò)程會(huì)產(chǎn)生一定量正丙醇，且正丙醇主要存在于糧食之中，在配糟中含量較少，糧糟混合后相當(dāng)于稀釋了糖化醅中的正丙醇含量；發(fā)酵過(guò)程整體呈緩慢上升趨勢(shì)，與楓林酒廠實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)酵期延長(zhǎng)正丙醇含量也相應(yīng)升高規(guī)律相符。

圖7 正丙醇含量變化趨勢(shì)圖

2.4.4 乙酸乙酯

小曲白酒中乙酸乙酯的生成原理為乙醇丙酮酸在生物酶的作用下生成乙酰輔酶A，然后在酵母、細(xì)菌產(chǎn)生分泌的酯化酶作用下與酒精生成乙酸乙酯。從圖8 可以看出，糖化醅中乙酸乙酯含量遠(yuǎn)高于糧糟混合，說(shuō)明乙酸乙酯主要存在于糧食之中，配糟中含量較少，糖化過(guò)程也會(huì)產(chǎn)生少量乙酸乙酯。兩個(gè)品種高粱有共同的規(guī)律：發(fā)酵前11 d 乙酸乙酯呈緩慢上升趨勢(shì)；發(fā)酵11～15 d 乙酸乙酯含量上升加快，尤其是粳高粱上升幅度較大，這與“乙酸乙酯多由發(fā)酵后期細(xì)菌產(chǎn)生”的釀造機(jī)理相吻合。

圖8 乙酸乙酯含量變化趨勢(shì)圖

2.4.5 雜醇油小曲白酒中雜醇油的主要生成途徑為酵母菌利用糖及氨基酸合成自身所需蛋白質(zhì)過(guò)程中產(chǎn)生，即合成代謝。從圖9 可以看出，糯高粱和粳高粱雜醇油變化趨勢(shì)基本一致,發(fā)酵1～6 d 快速上升，發(fā)酵第7 天出現(xiàn)最大峰值，發(fā)酵8～15 d 回落并趨于平穩(wěn)，與楓林酒廠實(shí)際生產(chǎn)數(shù)據(jù)較吻合。結(jié)合酵母菌數(shù)量變化趨勢(shì)圖3，粳高粱與糯高粱酵母菌含量均在發(fā)酵第6～7 天達(dá)到峰值，此過(guò)程酵母菌利用糖及氨基酸合成自身所需蛋白質(zhì)，雜醇油為過(guò)程產(chǎn)物，因此雜醇油也隨之達(dá)到峰值，進(jìn)一步驗(yàn)證了該結(jié)論的科學(xué)性。

圖9 雜醇油含量變化趨勢(shì)圖

3 結(jié)論

3.1 通過(guò)對(duì)整個(gè)糖化、發(fā)酵過(guò)程酒醅的微生物含量跟蹤檢測(cè)，得到了霉菌、酵母及細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖規(guī)律，均表現(xiàn)為發(fā)酵前期快速增長(zhǎng)，發(fā)酵后期緩慢下降的趨勢(shì)。

3.2 通過(guò)浸提離心及色譜檢測(cè)，得到了五大色譜指標(biāo)的生成規(guī)律：乙醛表現(xiàn)為發(fā)酵前期快速上升，中期下降，后期上升的趨勢(shì)；甲醇表現(xiàn)為糖化過(guò)程已到峰值，發(fā)酵過(guò)程逐漸下降的趨勢(shì)；正丙醇、乙酸乙酯均表現(xiàn)為發(fā)酵過(guò)程緩慢上升的趨勢(shì)；雜醇油表現(xiàn)為發(fā)酵前中期緩慢上升的趨勢(shì)，達(dá)到峰值時(shí)間與酵母菌含量達(dá)到峰值時(shí)間一致，發(fā)酵后期呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)。其中雜醇油與酵母菌達(dá)到峰值的時(shí)間高度一致，印證了結(jié)論“雜醇油的主要生成途徑為酵母菌利用糖及氨基酸合成自身所需蛋白質(zhì)過(guò)程中產(chǎn)生”的準(zhǔn)確性。

3.3 該報(bào)告所提煉的小曲白酒糖化發(fā)酵過(guò)程的微生物、五大色譜指標(biāo)的變化規(guī)律及其關(guān)聯(lián)性，對(duì)楓林酒廠小曲酒色譜指標(biāo)控制起到了重要的參考作用。