馬 楠

（西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

白酒釀造過程中，微生物在酒曲、酒醅、窖泥中參與了淀粉或糖質(zhì)的糖化、發(fā)酵、產(chǎn)酯生香過程，因此微生物的生態(tài)分布情況、種群結(jié)構(gòu)狀態(tài)和代謝消長過程直接影響發(fā)酵結(jié)果。同時，與風味功能有關(guān)的微生物結(jié)構(gòu)決定了白酒的釀造質(zhì)量和香氣類別，是影響白酒香型的關(guān)鍵。深入研究白酒中微生物的多樣性可以更好地對白酒釀造技術(shù)進行創(chuàng)新，提高白酒的釀造品質(zhì)、產(chǎn)量等。

我國進入農(nóng)耕時代較早，掌握了多種糧食種植技術(shù)。大部分地區(qū)的氣候為夏雨冬干。夏季的雨量較為集中且溫度較高、濕度較大，能夠給微生物提供較為適宜的生長環(huán)境。每年從6 月6 日到7 月19 日，我國南方大部分地區(qū)處于梅雨季節(jié)，此時間段內(nèi)釀酒所用的糧食水果等原料中更容易產(chǎn)生霉菌，氣候、濕度、溫度等自然條件均適合微生物的生長，有利于人們成功釀造出各類美酒。

現(xiàn)階段，相關(guān)學(xué)者通過現(xiàn)代生物技術(shù)對白酒釀造過程中涉及的微生物情況進行了詳細的研究。陳雪等對鳳香型白酒中的微生物進行了研究，發(fā)現(xiàn)該種香型的白酒共含有細菌182 種，真菌32 種，且乳酸桿菌的種群數(shù)量占絕對優(yōu)勢；詳細分析了白酒理化因子與微生物多樣性之間的關(guān)系，研究證明細菌多樣性和溫度之間呈負相關(guān)，還原糖和淀粉之間呈正相關(guān)的關(guān)系。崔鳳嬌等對芝麻香型白酒中的微生物多樣性進行了研究，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵前期，白酒中的優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌，發(fā)酵后期，優(yōu)勢菌屬變成了乳桿菌，其次才是芽孢桿菌；在酵母方面，伊薩酵母為優(yōu)勢菌群，其次為假絲酵母和釀酒酵母。

本文以現(xiàn)有研究成果作為基礎(chǔ)，從酒曲、酒醅、窖泥3 個方面分析多種香型白酒釀造過程中的微生物多樣性，總結(jié)出微生物多樣性與理化指標之間的關(guān)系，并將該關(guān)系應(yīng)用于多種釀酒工藝中，進一步提高白酒的產(chǎn)量和品質(zhì)。

1 多香型白酒酒曲微生物多樣性分析

曲最早指的是發(fā)霉的谷物種子，經(jīng)過不斷地改良逐漸形成了“曲衣”的說法，指的是含有霉孢子的糧食曲。酒曲在發(fā)展初期，微生物種類還較為單一，主要以米曲霉為主，其次為酵母菌。漢代后餅曲逐漸流行，餅曲能夠繁殖出的微生物種類更多，使得微生物組成也更加豐富，更具多樣性，此時酒曲中酵母菌也逐漸增多。后來釀酒者在酒曲中加入了一些草本植物使得各菌群的維生素營養(yǎng)更充分，生成也更為旺盛，也就逐漸形成了現(xiàn)階段邊糖化邊發(fā)酵的復(fù)式發(fā)酵工藝。

微生物對脂肪和蛋白質(zhì)分解及其自身代謝而產(chǎn)生的分解物會影響酒曲中微生物的多樣性。與高等生物相比，微生物的地域分布特征不明顯，但是更容易隨著氣流運動。因此酒曲中微生物大多數(shù)來源于釀造環(huán)境、保溫蘆葦?shù)?，或者是由各種釀造原料帶入的，主要以細菌和酵母菌為主。

從濃香型、醬香型、清香型3 種香型白酒的釀造過程出發(fā)，總結(jié)酒曲中微生物的變化情況。經(jīng)過歸納研究分析，三者釀造環(huán)境中的微生物種類大致相同，但由于制曲工藝和釀造原料的不同，酒曲中的微生物種類存在細微差異。

2.1 濃香型白酒酒曲微生物分析

對現(xiàn)階段最為大眾所熟悉的濃香型白酒——瀘州老窖的酒曲微生物進行研究。常用的方法有克隆文庫方法單獨分析成品酒曲微生物組成，也可以與其他方法相結(jié)合研究酒曲不同位置細菌和真菌組成的差異。與傳統(tǒng)的研究方法相比，克隆文庫可以獲得更加豐富的多樣性信息。

據(jù)研究報道，將瀘州老窖同一批次質(zhì)量不同的3 種高溫大曲，根據(jù)顏色由深到淺分別記為F1、F2、F3。該酒廠夏天濃香型白酒生產(chǎn)堆積的時間是32 h 左右，在堆積過程中跟蹤取樣。取樣時從兩端及中間取樣并混勻，并記錄取樣時的溫度。觀察樣品酒曲在發(fā)酵過程中各微生物的消長變化情況如下：

樣品酒的酒曲中根霉較多，曲霉次之，優(yōu)質(zhì)曲中紅曲霉也相對較多。這是因為瀘州老窖的酒曲配置溫度最高不超過55 ℃，因此霉菌和酵母菌存活率較高，酒曲中兩種菌屬的含量也就相對較高。

2.2 醬香型白酒酒曲微生物分析

醬香型白酒主要選取醬香高溫大曲進行研究。研究方法與濃香型白酒相同。酒曲在發(fā)酵過程中微生物變化情況如下：

醬香高溫大曲中除了存在根霉、曲霉兩種霉菌以外，還存在少部分耐高溫霉菌，細菌數(shù)量占優(yōu)勢，大致有97.6%，霉菌占據(jù)2.3%，而酵母菌不容易被檢測出來。

這是因為高溫制曲是制作醬香型白酒的主要技藝，在其酒曲制作過程中微生物生長會釋放大量的熱量，導(dǎo)致曲塊的溫度能夠達到60 ℃以上，而大多數(shù)霉菌和酵母菌在如此高的溫度下都難以存活，因此醬香高溫大曲中霉菌和酵母菌的含量極少。

2.3 清香型白酒酒曲微生物分析

汾酒是清香型白酒的代表，因此以汾酒為例分析清香型白酒在釀造過程中酒曲微生物的變化情況，相關(guān)研究結(jié)果如下：

汾酒酒曲中的細菌分布情況與瀘州老窖較為相似，均含有較多的乳酸菌、醋酸菌及芽孢桿菌。汾酒的酒曲配置溫度最高不超過50 ℃，因此霉菌和酵母菌存活率較高，酒曲中兩種菌屬的含量也就相對較高。大曲樣品中細菌和芽孢桿菌的數(shù)量較高，其中芽孢桿菌的數(shù)量較高，該種大曲的“穿衣”效果較為明顯。大曲的“穿衣”一般是微生物尤其是霉菌生長好壞的外在表現(xiàn)特征，由于霉菌在生長繁殖過程中可產(chǎn)生糖化酶、液化酶、蛋白酶、纖維素酶等多種酶類，所以霉菌的生長繁殖狀況對各種酶活力有很大的影響。

此外由于白酒酒曲大部分是靠天然接種培制的，往往也會存在一些不利于釀造的微生物，如上述3 種研究對象中均檢測出了一些犁頭霉，根據(jù)多年釀造經(jīng)驗可以判斷該類霉菌會對酒的釀造質(zhì)量產(chǎn)生一定的負面影響，例如：如果汾酒的酒曲中含有較多的犁頭霉就會產(chǎn)生微弱苦味。

3 多香型白酒酒醅微生物多樣性分析

酒醅的微生物區(qū)系較為復(fù)雜，是釀酒過程中研究微生物多樣性的重要對象。在整個發(fā)酵過程中，微生物代謝形成的不同酶菌會引起一系列的生化反應(yīng)，使得白酒形成不同風味，因此本文對不同風味白酒糟醅中的微生物進行分析。

現(xiàn)階段，利用DGGE 指紋圖譜可以比較直觀的觀察微生物菌落的變化，常結(jié)合圖像分析軟件，計算微生物群落的多樣性指數(shù)及聚類分析。利用DGGE 研究酒醅微生物群落組成的變化，分析與微生物生長環(huán)境理化因子以及白酒質(zhì)量相關(guān)的關(guān)鍵風味物質(zhì)變化的關(guān)系，對于揭示白酒的釀造機理有十分重要的意義。

3.1 濃香型白酒酒醅微生物分析

通過現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)對濃香型白酒酒糟中的真核和原核生物進行研究。分析微生物生長、轉(zhuǎn)化和分布情況后得出如下結(jié)論：大多數(shù)細菌都在上層酒醅中，只有酵母菌在底層的酒醅中，且霉菌在酒醅中含量較少。

白酒發(fā)酵初期，酵母菌、堿性厭氧細菌和霉菌的菌群數(shù)量會大幅度增加。隨著發(fā)酵的不斷深入，各類菌群數(shù)量均有所降低。發(fā)酵中期，細菌、酵母會逐漸成為優(yōu)勢菌群。發(fā)酵后期，酵母菌種總量減少，直至不能被檢測出來，數(shù)量接近于零。而芽孢桿菌會逐漸增多。

通過對微生物16S rRNA 序列的同源性進行對比，發(fā)現(xiàn)糟醅中的原核生物主要是古細菌，如真菌、甲烷囊菌以及甲烷螺桿菌等。

有文獻對現(xiàn)階段最為大眾所熟悉的濃香型白酒——瀘州老窖進行研究。白酒窖內(nèi)中層中心和周圍的糟醅，在發(fā)酵過程中各細菌的消長變化情況如下：剛?cè)虢褧r期，微生物的多樣性較高，發(fā)酵7 d后細菌種類減少，且嗜酸乳桿菌成為優(yōu)勢菌群。發(fā)酵一個月時，散囊菌屬與曲霉菌屬代替了嗜酸乳桿菌成為優(yōu)勢菌群，實驗前被認為大量存在的酵母屬僅在發(fā)酵一周后的糟醅中層邊緣處微量存在，這表明了酵母屬在瀘州老窖的釀造過程中不是主要菌屬，這是因為瀘州老窖在釀造過程中使用了回酒蒸餾技術(shù)，給嗜酸乳桿菌的大量產(chǎn)生提供了時機。

不同的釀造環(huán)境所產(chǎn)生的微生物也略有差異，與上文瀘州老窖相似的濃香型酒——習(xí)酒和全興酒的酒糟中也以乳桿菌為優(yōu)勢菌群，而宜賓多糧酒的酒糟中優(yōu)勢菌則有所不同，主要是以芽孢桿菌為主。此外全興酒的優(yōu)勢菌群除了與瀘州老窖相同的曲霉菌屬、伊薩酵母菌群以外還有酵母菌屬、犁頭菌屬以及復(fù)膜孢子酵母菌屬。這是由于全興酒多釀造于盛夏，所以在發(fā)酵初期檢測到的優(yōu)勢菌多數(shù)為未培養(yǎng)菌以及通常分布于土壤中的魏斯氏菌屬。

3.2 醬香型白酒酒醅微生物分析

醬香型白酒與濃香型白酒存在一定差異，醬香型白酒的酒醅表現(xiàn)在兩個方面，分別為窖內(nèi)發(fā)酵酒醅和高溫堆積酒醅。醬香型白酒異于其他香型白酒的釀造工藝，使得酒醅中的微生物區(qū)系較為特殊，這也在一定程度上給微生物多樣性的研究增加了難度。

醬香型白酒的高溫制曲工藝導(dǎo)致大量酵母菌死亡。酒醅堆積的過程中，微生物又被網(wǎng)羅其中，再次增加了微生物的多樣性。

據(jù)研究報道，醬香型白酒在酒醅堆積過程中，酵母菌的數(shù)量會快速升高，細菌的數(shù)量隨之降低，且隨著堆積輪次的增多酒醅中的總菌群數(shù)量會逐漸降低。在窖內(nèi)發(fā)酵過程中，各類細菌和酵母菌都會不斷減少。發(fā)酵后期，乳酸菌會逐漸減少，直至無法被檢測出來。醬香型白酒的制曲溫度一般在50 ℃左右，酒醅中的細菌也以中溫嗜熱菌為主，多為芽孢桿菌屬，還有少量葡萄球菌屬，酵母菌主要為假絲酵母、裂殖酵母屬。

在醬香型白酒冬季生產(chǎn)過程中，堆積的酒醅內(nèi)部或表層處會出現(xiàn)星白色或微黃色的團狀物，一般帶“霉味”，且酒醅干燥，下窖時酒精味較濃。這種現(xiàn)象稱為“腰線”。有研究采用稀釋涂布法對不同腰線酒醅樣品的酵母與霉菌進行分離，培養(yǎng)基稀釋度分別為10、10、10，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。3 d 后按平板計數(shù)法對酵母菌計數(shù),并對不同形態(tài)菌株進行分離與純化。7 d 后，按同樣方法對霉菌菌落計數(shù)與分離。實驗發(fā)現(xiàn)在該過程中細菌數(shù)量和種類的比例有所下降，而酵母菌數(shù)量和種類的比例不斷增多。窖內(nèi)發(fā)酵初期細菌的總量下降，酒醅的中上層酵母菌減少。發(fā)酵中期，細菌數(shù)量會有小幅度的回升，下層的酵母菌數(shù)量會迅速增多，隨后又緩慢降低。霉菌的數(shù)量在發(fā)酵初期慢慢減少，中期時會有所回升，之后基本保持穩(wěn)定。

3.3 鳳香型及清香型白酒酒醅微生物分析

汾酒為清香型白酒的代表，其生產(chǎn)過程實質(zhì)為霉菌、酵母菌、細菌互相作用的結(jié)果。通過模擬汾酒的發(fā)酵過程發(fā)現(xiàn)其主要功能菌為細菌和酵母菌。乳酸乙酯是清香白酒的主要香氣成分，其比例略低于乙酸乙酯。夏季溫度升高時，釀酒環(huán)境中乳酸菌數(shù)量迅速增加，乳酸菌代謝產(chǎn)物——乳酸，經(jīng)過酯化作用合成乳酸乙酯，導(dǎo)致乳酸乙酯和乙酸乙酯的比例失衡。

另外據(jù)有關(guān)報道，汾酒酒醅大米查、二米查中的菌群數(shù)量在發(fā)酵過程中出現(xiàn)了二次生長，但生長過程不完全一致。發(fā)酵初期時，大米查中的乳酸菌數(shù)量比二米查要多，還存在較少的霉菌，發(fā)酵至中期時，二米查的酵母數(shù)量多于大米查，發(fā)酵后期時大米查逐漸增多的微生物主要為細菌，而二米查中除了細菌變多以外酵母菌數(shù)量也逐漸上升。

在發(fā)酵過程中，微生物種群的變化情況鳳型與清香型大致相同，存在差異的地方是鳳香型白酒的酒醅中含有較多的放線菌，尤其是在發(fā)酵的中期和末期，糟醅中的數(shù)量最多。

4 白酒窖泥微生物多樣性分析

來自操作環(huán)境、窖泥、酒曲等處的各種微生物在酒糟和窖泥中演變、遷徙、能量變換，形成了窖池的微生物區(qū)系。各區(qū)系達到平衡，意味著固態(tài)階段發(fā)酵完成。

通過觀察發(fā)現(xiàn)窖池中微生物的多樣性和釀造環(huán)境的微生態(tài)有很大關(guān)系，微生物的多樣性是窖池中微生態(tài)系統(tǒng)的一部分。釀酒物質(zhì)的能量代謝與微生物的消長共同促進窖池的生態(tài)演變，因此分析釀酒窖池中微生物的多樣性，能夠給微生物工業(yè)應(yīng)用提供可靠的數(shù)據(jù)支撐。

窖泥是釀造白酒過程中微生物的棲息環(huán)境，其中不同種類的微生物會不斷演替代謝，在發(fā)酵的整個過程中會出現(xiàn)非常明顯的多態(tài)性。窖泥中的環(huán)境也較為特殊，其乙醇含量較高，pH 值和氧含量較低，導(dǎo)致了微生物群落結(jié)構(gòu)也更具多樣性。窖泥是各功能菌的繁殖載體，直接與白酒香味的形成相關(guān)。張應(yīng)剛等分別檢測瀘州老窖5 年、30 年、100年、300 年窖泥中的微生物后，結(jié)果表明，5 年窖齡的窖泥中優(yōu)勢菌屬分別為根霉屬、孢子菌屬；100年窖齡的窖泥中優(yōu)勢菌屬分別為曲霉屬、假絲酵母屬；300年窖泥中的古細菌主要是廣域古菌，占總菌數(shù)的9.2 %～16.5 %；30 年的窖泥中廣域古菌占總菌數(shù)的0.6 %，相較于300 年窖泥含量更低。30 年窖泥中的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門，占總數(shù)的90 %以上，厚壁菌門中又以乳酸菌屬為主，約占總數(shù)的92 %以上；而在300 年窖中厚壁菌門也為優(yōu)勢菌門，占比在43 %以上，也以乳酸菌為主，但是僅占總數(shù)的20 %左右。此外，30 年窖泥中還存在梭菌屬和甲烷共生梭菌屬，分別占總數(shù)的21 %和2.7%。300 年窖泥中也存在以上兩種菌屬，但是占比少，分別為2.5 %和0.36 %。從以上分析可以看出，年限不同的白酒窖泥微生物菌落結(jié)構(gòu)也不同，而對于不同類型的白酒，窖泥微生物菌落結(jié)構(gòu)也不同，在白酒窖泥微生物多樣性分析中，湯溝白酒退化窖泥、普通窖泥、優(yōu)質(zhì)窖泥中的微生物菌落結(jié)構(gòu)具有典型性。退化窖泥中的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬；普通窖泥中的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬、甲烷共生梭菌屬等；優(yōu)質(zhì)窖泥中的優(yōu)勢菌屬主要為乳桿菌屬、梭狀芽胞桿菌、甲烷共生梭菌屬等。隨著窖泥質(zhì)量的提升，乳酸桿菌屬的質(zhì)量逐漸減少，梭狀芽胞桿菌、類桿菌、甲烷諾桿菌等菌群逐漸增多，這就表明后3 種菌屬能夠在一定程度上提高窖泥質(zhì)量。此外在分析的過程中還發(fā)現(xiàn)較高的乳酸含量和有機磷含量、低pH 值可能為窖泥質(zhì)量發(fā)生退化的主要外因。

5 小結(jié)

在白酒釀造過程中酵母菌以釀酒酵母、生香酵母等參與發(fā)酵。其中釀酒酵母的產(chǎn)醇能力最強，生香酵母具有強大的糖化、酒化、產(chǎn)酯能力，能夠增加酒醅中的酯類物質(zhì)含量，使白酒呈現(xiàn)出不同的香味。

常見的細菌有乙酸菌、乳酸菌、丁酸菌、醋酸菌。乳酸菌會促進釀酒原料中的發(fā)酵糖類轉(zhuǎn)化為乳酸，乳酸酯化后形成乳酸乙酯。乳酸乙酯為白酒產(chǎn)生香味的主要物質(zhì)之一，但是若含量過高也會使酒體有悶頭的口感。醋酸也是白酒的主要生香物質(zhì)，但是含量過多會導(dǎo)致白酒中有刺激性酸味出現(xiàn)。乙酸菌和丁酸菌多分布在窖泥中，是生香物質(zhì)乙酸乙酯和丁酸乙酯的前體。實際參與釀造的微生物還有很多，總體來說微生物的多樣性越高，則白酒的口感就越為豐富，品質(zhì)也就越高。因此，在釀酒的過程中需要嚴格控制以上幾種酵母和細菌的含量，使白酒的品質(zhì)和口感更佳。

本文對白酒釀造中微生物的多樣性進行了歸納研究，以瀘州老窖、茅臺、汾酒等不同釀造環(huán)境下的白酒作為分析目標，分別闡述不同香型白酒釀酒微生物多樣性的變化情況，總結(jié)出相關(guān)規(guī)律。若這些微生物的相關(guān)研究成果能實際應(yīng)用于傳統(tǒng)釀酒工藝中，必將能進一步提高白酒的釀造品質(zhì)。