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        尿酸測定試劑的抗干擾能力研究

        2022-03-29 14:05:40潘亞麗
        生物化工 2022年1期
        關(guān)鍵詞:脂肪乳回歸方程膽紅素

        潘亞麗

        (英科新創(chuàng)(廈門)科技股份有限公司,福建廈門 361022)

        尿酸(Uric Acid,UA)是嘌呤堿基代謝產(chǎn)物,既可以來自體內(nèi),也可以來自于食物中嘌呤的分解代謝,主要在肝臟中生成,小部分尿酸可經(jīng)肝臟隨膽汁排泄,其余大部分均從腎臟排泄[1]。臨床上常將血清尿酸檢測結(jié)果作為痛風(fēng)、腎功能損傷診斷的一個(gè)重要指標(biāo),因此尿酸檢測在臨床上具有重要的作用[2]。尿酸濃度的升高或降低均會對機(jī)體造成不利的影響,因而尿酸的準(zhǔn)確測定就顯得尤為重要[3]。檢測過程中,檢驗(yàn)樣本的狀態(tài)對測定結(jié)果的準(zhǔn)確性可產(chǎn)生嚴(yán)重影響,因此必須對檢測干擾因素進(jìn)行研究。干擾物質(zhì)按照來源可分為內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)。尿酸測定試劑所適用的臨床樣本一般為血清,離體的血液經(jīng)不同的方法處理從而得到檢測所需的樣本。由于從全血中分離獲得,因此血液中的一些物質(zhì)可能會成為潛在的內(nèi)源性干擾物。本研究采用在血清樣本中添加抗壞血酸(VC),模擬人體服用維生素后的干擾物樣本;在血清樣本中添加血紅蛋白,模擬溶血的內(nèi)源性干擾物樣本;在血清樣本中添加膽紅素,模擬黃疸的內(nèi)源性干擾物樣本;在血清樣本中添加甘油三酯、脂肪乳,模擬脂血的內(nèi)源性干擾物樣本。對在臨床工作中常見的干擾作用進(jìn)行尿酸測定試劑抗干擾能力研究,以期為尿酸的測定和應(yīng)用提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        所用血清樣品來源于健康體檢者,空腹?fàn)顟B(tài)下靜脈采血5 mL、3 000 r/min離心5 min后得到相應(yīng)血清,無脂血、溶血和黃疸血清樣本-20 ℃冰箱凍存。

        1.2 儀器與試劑

        尿酸測定試劑盒,英科新創(chuàng)(廈門)科技股份有限公司;日立7180型全自動(dòng)生化分析儀,日立集團(tuán)有限公司;校準(zhǔn)品及質(zhì)控品,英國朗道公司。干擾物質(zhì):抗壞血酸(VC),99.7%,默克Sigma;血紅蛋白(HB),98%,默克Sigma;膽紅素(TB),98%,Aladdin;甘油三酯(TG),99%,默克Sigma;10%脂肪乳,四川科倫公司。

        1.3 試驗(yàn)方法

        1.3.1 尿酸測定方法

        尿酸測定試劑盒采用尿酸酶法,反應(yīng)生成的紅色醌亞胺色素與樣本中尿酸的濃度成正比,測定吸光度,并計(jì)算尿酸的濃度。

        1.3.2 基礎(chǔ)血清的制備

        根據(jù)《干擾實(shí)驗(yàn)指南》(WS/T 416—2013),按尿酸濃度選取2個(gè)濃度的樣本:將尿酸濃度約500 μmol/L的樣本混合,制備成高值基礎(chǔ)混合血清;將尿酸濃度約200 μmol/L的血清樣本混合,制備成低值基礎(chǔ)混合血清。

        1.3.3 干擾物篩選樣本制備

        根據(jù)《干擾實(shí)驗(yàn)指南》(WS/T 416—2013),選擇醫(yī)學(xué)決定水平、參考范圍的上限或病理濃度,確定干擾實(shí)驗(yàn)時(shí)干擾物的濃度。Vc干擾樣本的濃度為1 704 μmol/L(0.3 g/L),HB干擾樣本的濃度10 g/L,TB干擾樣本濃度為684 μmol/L,TG干擾樣本濃度為37 mmol/L,脂肪乳干擾樣本濃度為0.03%。干擾物分別配制成20倍的貯存液,將不同濃度的5種干擾物質(zhì)分別與高、低混合血清按1∶19稀釋,得到10組高濃度干擾樣本。

        1.3.4 干擾評價(jià)(劑量效應(yīng))樣本制備

        當(dāng)干擾物篩選試驗(yàn)顯示被評價(jià)干擾物對尿酸有明顯干擾作用時(shí),制備一系列不同濃度的干擾測試樣本。對照樣本(干擾物質(zhì)的緩沖液與混合血清按1∶19稀釋)和干擾樣本(干擾物質(zhì)貯備液與混合血清按1∶19稀釋)配制為5個(gè)濃度梯度樣本,對照樣本與干擾樣本分別按體積比例(4∶0、3∶1、2∶2、1∶3和0∶4)混合為5個(gè)濃度[4]。

        1.3.5 操作

        (1)在儀器狀態(tài)最佳條件下,用尿酸試劑對上述樣品進(jìn)行測定。(2)每種干擾樣本均為現(xiàn)配現(xiàn)測。(3)為排除測量程序的精密度對干擾效果的影響,根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)的置信水平、檢驗(yàn)效能及測量程序的批內(nèi)精密度和干擾標(biāo)準(zhǔn)[5],計(jì)算出dmax/S=2.5,查詢95%置信水平與檢驗(yàn)效能下不同干擾標(biāo)準(zhǔn)所需要的樣品,重復(fù)測定次數(shù)為5次。(4)劑量效應(yīng)試驗(yàn)在同一分析批之內(nèi)檢測5個(gè)樣本的濃度,第一組按照升序測定各樣本,第二組按降序測定,以此類推,從而能夠平均系統(tǒng)漂移產(chǎn)生的影響。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        所有數(shù)據(jù)應(yīng)用Microsoft Excel 2013軟件處理和作圖分析,檢測結(jié)果取均值。配對差異計(jì)算添加樣本和對照樣本測量均值差的絕對值(B),B=干擾管測定結(jié)果-對照管測定結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn):當(dāng)篩選試驗(yàn)顯示被評價(jià)干擾物對被評價(jià)方法有明顯干擾作用,則進(jìn)一步通過劑量效應(yīng)試驗(yàn)確定小于偏倚臨界值(相對偏差均在±10%范圍內(nèi)(干擾率≤10%),即高值差值在±50 μmol/L,低值差值在±20 μmol/L)即可接受。確定不同干擾物濃度的干擾程度,以干擾物濃度為x軸,以各干擾物濃度結(jié)果與對照樣本結(jié)果的差值為y軸,繪制散點(diǎn)圖,然后依次對各點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)對點(diǎn)連線,采用點(diǎn)對點(diǎn)法估計(jì)不同濃度干擾物的干擾效果。計(jì)算的干擾濃度,即為該干擾物質(zhì)不對分析物造成干擾的最大濃度。如果不同的分析物濃度試驗(yàn)得到的可接受干擾物濃度不同,則取其中最低的可接受干擾物濃度作為最終結(jié)果。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 干擾物篩選結(jié)果

        通過計(jì)算添加樣本和對照樣本測量均值差的絕對值,HB、TG、脂肪乳樣本和對照樣本測量均值差<偏倚臨界值,無明顯干擾作用。Vc、TB的測量均值差>偏倚臨界值,VC和TB有明顯干擾作用。結(jié)果見表1。

        表1 VC、HB、TB、TG、脂肪乳干擾物篩選結(jié)果(單位:μmol/L)

        2.2 劑量效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

        隨著干擾物VC和TB濃度的增加,其干擾程度也逐漸增加,見表2。

        表2 VC、TB干擾物干擾評價(jià)(單位:μmol/L)

        2.3 VC對尿酸測定的影響

        在尿酸濃度約為200 μmol/L及500 μmol/L分析水平下,VC對尿酸試劑產(chǎn)生負(fù)向干擾,其干擾呈非線性干擾趨勢,結(jié)果見圖1(a)和圖1(b)。低值樣品(約200 μmol/L)回歸方程為y=-0.022x-2.912,高值樣品(約500 μmol/L)回歸方程為y=-0.040 5x-3.152,干擾效果可以從圖1中進(jìn)行估計(jì),也可以通過回歸方程計(jì)算。通過斜率和截距關(guān)系,計(jì)算出低值樣本VC的干擾劑量為686.1 μmol/L,高值樣本VC的干擾劑量為1 072.4 μmol/L,則本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)血清中VC≤686 μmol/L不影響尿酸試劑的測定結(jié)果。

        圖1 VC劑量效應(yīng)回歸分析

        2.4 TB對尿酸測定試劑的影響

        在尿酸濃度約為 200 μmol/L及 500 μmol/L分析水平下,TB對尿酸試劑也產(chǎn)生負(fù)向干擾。其干擾呈非線性干擾趨勢,結(jié)果見圖2(a)和圖2(b)。低值樣品(約200 μmol/L)回歸方程為y=-0.0706x+2.608,高值樣品(約500 μmol/L)回歸方程為y=-0.0831x+2.22,干擾效果可以從圖2中進(jìn)行估計(jì)也可以通過回歸方程計(jì)算。通過斜率和截距關(guān)系,計(jì)算出低值樣本TB的干擾劑量為368.4 μmol/L,高值樣本TB的干擾劑量為617.3 μmol/L,則本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)TB≤368 μmol/L不影響尿酸試劑的測定結(jié)果。

        圖2 TB劑量效應(yīng)回歸分析

        3 結(jié)論

        由于人體血清成分復(fù)雜,其中的某些成分會引起試劑盒測定的干擾。本實(shí)驗(yàn)只選取了5種干擾物質(zhì),在尿酸濃度約為200 μmol/L及約500 μmol/L分析水平下,當(dāng)HB≤10 g/L,TG≤37 mmol/L,脂肪乳≤0.03%時(shí),尿酸測定結(jié)果不受影響,即干擾率≤ 10%。 當(dāng) Vc≤ 686 μmol/L,TB≤ 368 μmol/L時(shí),計(jì)算得到的相對偏差均在士10%范圍內(nèi),為臨床可接受范圍,且此時(shí)VC的干擾濃度大于《干擾實(shí)驗(yàn)指南》(WS/T 416—2013)中表C規(guī)定的最高病理濃度(114 μmol/L),TB的干擾濃度大于《干擾實(shí)驗(yàn)指南》(WS/T 416—2013)中表C規(guī)定的建議實(shí)驗(yàn)濃度(342 μmol/L)。因此,試劑盒VC抗干擾能力完全能夠滿足臨床的要求。而當(dāng)樣本中TB>368.4 μmol/L時(shí),對尿酸的測定結(jié)果與對照比較相對偏差會超出士10%的范圍,說明尿酸測定試劑盒對膽紅素的抗干擾能力存在一定的局限。因此,為了保證數(shù)據(jù)結(jié)果準(zhǔn)確真實(shí),在該項(xiàng)目測定之前應(yīng)對黃疸樣本進(jìn)行鑒別,否則得到的尿酸檢測結(jié)果將不能反映樣本中真實(shí)水平。

        維生素C是一種機(jī)體運(yùn)行必需的維生素,具有較強(qiáng)的抗氧化性,能夠通過減少氧化中間產(chǎn)物的產(chǎn)生及減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生作用機(jī)制減少尿酸的合成,從而對機(jī)體血清尿酸產(chǎn)生影響。Vc會對尿酸測定中產(chǎn)生的最終產(chǎn)物苯醌亞胺和中間產(chǎn)物過氧化氫(H2O2)進(jìn)行還原,從而影響尿酸水平,對最終的測定結(jié)果產(chǎn)生影響[6]。

        膽紅素對尿酸測定的干擾分為光譜干擾和化學(xué)干擾,光譜干擾主要是由于膽紅素被主反應(yīng)中間產(chǎn)物過氧化氫(H2O2)氧化,在400~540 nm波長吸光度的下降可掩蓋主反應(yīng)吸光度的增高;而化學(xué)干擾主要是由于高濃度膽紅素破壞了Trinder的中間反應(yīng),導(dǎo)致有色終反應(yīng)產(chǎn)物減少而使測定結(jié)果偏低[7]。

        當(dāng)發(fā)現(xiàn)尿酸測定結(jié)果受到維生素C和膽紅素的濃度干擾影響時(shí),要分析原因,找到解決辦法,可采取稀釋樣本的辦法減少干擾,也可進(jìn)一步嘗試加入抗干擾物質(zhì),研究開發(fā)抗干擾能力更強(qiáng)的尿酸試劑。

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