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        超聲和剪切聯(lián)合超臨界CO2法制備姜黃素脂質(zhì)體

        2022-03-29 14:05:36駱靚蕓
        生物化工 2022年1期
        關(guān)鍵詞:大豆磷脂脂質(zhì)體磷脂

        駱靚蕓

        (1.阿澤雷斯國際貿(mào)易有限公司,上海 201900;2.上海交通大學 化學化工學院,上海 201100)

        近年來,姜黃素儼然已成為天然藥物研究熱點之一,其具有治療炎癥、緩解關(guān)節(jié)疼痛、降低高血壓、抑制腫瘤細胞增殖等藥理活性[1]。但是姜黃素本身水溶性差,光照下易分解,在中性或堿性條件下易降解,在人體中容易被快速代謝而失去活性,導致其生物利用度極低[2]。針對其應(yīng)用局限性,學者們研究了各種姜黃素劑型,如乳液、納米顆粒、脂質(zhì)體等。其中,脂質(zhì)體具有獨特優(yōu)勢:(1)解決了水溶性差和穩(wěn)定性差等問題;(2)對人體安全無毒,具有生物降解性;(3)具有更好的生物相容性,可以提高姜黃素細胞滲透率;(4)容易在肝臟等部位富集,具有靶向富集效果[3]。超臨界CO2法是一種新型綠色制備脂質(zhì)體的方法,與傳統(tǒng)制備方法相比,其具有工藝簡單、條件可控、無溶劑殘留等優(yōu)勢[4-7]。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑

        乙醇,分析純,國藥集團化學試劑有限公司;姜黃素,95%,河南晨光科技有限公司;大豆磷脂,98%,北京美亞斯磷脂技術(shù)有限公司;膽固醇,95%,阿達瑪斯試劑(上海)有限公司。

        765PC紫外分光光度計,上海光譜儀器廠;SY1200超聲振蕩儀,上海聲源超聲波儀器;JEM-2100透射式電子顯微鏡,日本電子株式會社;ZS90納米粒度分析儀,英國馬爾文儀器。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 姜黃素標準曲線

        將姜黃素稀釋配制得到2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L和10 mg/L姜黃素梯度溶液,以425 nm處吸光度(A)對姜黃素濃度(W)進行線性回歸,獲得姜黃素標準曲線:A=0.114 2W+0.061 8,R2=0.998 9。

        1.2.2 姜黃素脂質(zhì)體制備條件優(yōu)化

        1.2.2.1 制備流程

        姜黃、大豆磷脂和膽固醇在研缽中研磨成餅狀,分次加入30 mL的PBS磷酸緩沖液(0.2 mol/L,pH=6.0),繼續(xù)研磨至均勻后加入高壓釜。在剪切、45 ℃條件下,通入超臨界CO2直至設(shè)定壓力后開啟超聲,保持超聲和剪切共同處理40 min。依次停止加熱、剪切和超聲,釋放CO2。加入100 mL的PBS磷酸緩沖溶液沖洗釜內(nèi)壁上的黃色顆粒,超聲和攪拌共同處理40 min,即得姜黃素脂質(zhì)體溶液。

        1.2.2.2 剪切速度優(yōu)化

        壓力20 MPa,溫度45 ℃,大豆磷脂占總脂質(zhì)(磷脂和膽固醇總和)質(zhì)量的83%,姜黃素占總脂質(zhì)質(zhì)量的5%,超聲功率45 W,超聲和剪切處理40 min,剪切速度分別設(shè)置為1 000 r/min、3 000 r/min、5 000 r/min和 7 000 r/min。

        1.2.2.3 超聲功率優(yōu)化

        壓力20 MPa,溫度45 ℃,大豆磷脂占總脂質(zhì)質(zhì)量的83%,姜黃素占總脂質(zhì)質(zhì)量的5%,剪切速度5 000 r/min,超聲和剪切處理40 min,超聲功率分別設(shè)置為0.0 W、22.5 W、45.0 W和180.0 W。

        1.2.2.4 大豆磷脂添加量優(yōu)化

        壓力20 MPa,溫度45 ℃,姜黃素占總脂質(zhì)質(zhì)量的5%,剪切速度5 000 r/min,超聲功率45 W,超聲和剪切處理40 min,磷脂質(zhì)量分別為總脂質(zhì)的50%、67%、83%和100%。

        1.2.2.5 姜黃素添加量優(yōu)化

        壓力20 MPa,溫度45 ℃,磷脂添加量占總脂質(zhì)的83%,剪切速度5 000 r/min,超聲功率45 W,超聲和剪切處理40 min,姜黃素質(zhì)量分別為總脂質(zhì)的3%、5%、8%和10%。

        1.2.3 姜黃素脂質(zhì)體包封率的測定

        將姜黃素脂質(zhì)體溶液混合均勻后在425 nm處測量吸光度 A1,計算Wz;溶液離心(5 000 r/min,15 min)后取上清液測量吸光度A2,計算W1。包封率(EE)的計算公式如(1)所示:

        1.2.4 姜黃素脂質(zhì)體粒徑分布

        姜黃素脂質(zhì)體溶液用去離子水稀釋50倍至清澈透明狀態(tài),在馬爾文粒度儀上測量姜黃素脂質(zhì)體粒徑和粒徑分布。

        1.2.5 姜黃素脂質(zhì)體形貌表征

        姜黃素脂質(zhì)體溶液離心(5 000 r/min,15 min)后取上清液,用4 μm濾膜過濾后滴在300目覆有碳膜的銅網(wǎng)上,待樣品完全干燥,觀察姜黃素脂質(zhì)體微觀結(jié)構(gòu)。

        1.2.6 姜黃素脂質(zhì)體體外釋放分析

        PBS緩沖溶液(pH=7)和乙醇以1∶25的體積比混合作為釋放介質(zhì),稱取姜黃素溶解于釋放介質(zhì)制成和姜黃素脂質(zhì)體相同濃度的溶液,將姜黃素脂質(zhì)體和姜黃素溶液放入已經(jīng)預處理過的孔徑0.001 μm濾袋中,夾緊開口后浸入100 mL的釋放介質(zhì)中,(37±0.5)℃水浴攪拌,分別于 0.5 h、1.0 h、2.0 h、4.0 h、6.0 h、8.0 h、12.0 h和24.0 h取5 mL樣品,取樣后立即補充5 mL空白釋放介質(zhì)。分別測量各個樣品425 nm下的吸光度,計算其累積釋放率[3]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 制備工藝優(yōu)化

        由于姜黃素水溶性極差,通過濕法研磨前處理可以使磷脂分子包裹姜黃素均勻混合。采用高速剪切設(shè)備來破壞超臨界CO2和水相之間的界面張力以及水膨脹的大豆磷脂凝聚,磷脂分子在剪切應(yīng)力作用下形成球形膠束,釋放CO2后形成球形雙層分子層囊泡,將表面張力降低至零。超聲和剪切聯(lián)合作用會使得脂質(zhì)體顆粒更小,分布更均勻,所以超聲和剪切作用是該方法的關(guān)鍵[4]。

        2.1.1 剪切速度

        如圖1所示,隨著剪切速度的提高,姜黃素脂質(zhì)體包封率顯著升高后變化平緩,粒徑減小。當轉(zhuǎn)速達到5 000 r/min時,包封率達到最大,為87.45%±0.30%;粒徑為323.00 nm±2.86 nm。因此,選擇5 000 r/min作為最佳的剪切速度參數(shù)。

        圖1 剪切速度對姜黃素脂質(zhì)體的影響

        2.1.2 超聲功率

        如圖2所示,隨著超聲功率的增加,姜黃素脂質(zhì)體包封率顯著升高,達到最大值后略有下降;粒徑則先減小后增加。當超聲功率為45 W時,包封率最高,為87.11%±0.21%,此時粒徑為321.50 nm±13.40 nm。過度超聲會引起脂質(zhì)體融合,導致脂質(zhì)體泄漏,粒徑變大,分布不均勻[8]。因此,以45 W作為最佳超聲功率。

        圖2 超聲功率對姜黃素脂質(zhì)體的影響

        2.1.3 大豆磷脂添加量

        如圖3所示,隨著大豆磷脂添加量變大,姜黃素脂質(zhì)體包封率先升高后降低,粒徑則持續(xù)減小。當大豆磷脂添加量為83%時,包封率最大,為78.82%±0.47%;當大豆磷脂添加量為100%時,脂質(zhì)體粒徑最小,為165.93 nm±7.98 nm。通常情況下,適量膽固醇的加入可以提高脂質(zhì)膜的流動性,比單一大豆磷脂組成的雙分子層膜穩(wěn)定性更好[9]。因此,綜合考慮以83%作為大豆磷脂的添加量。

        圖3 大豆磷脂添加量對姜黃素脂質(zhì)體的影響

        2.1.4 姜黃素添加量

        如圖4所示,隨著姜黃素添加量升高,姜黃素脂質(zhì)體包封率逐漸下降,粒徑持續(xù)變大。姜黃素含量為3%時,包封率最大,為94.23%±0.22%;粒徑最小,為171.13 nm±13.60 nm。研究證實,姜黃素引入脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)中會導致結(jié)構(gòu)松弛,使得脂質(zhì)體穩(wěn)定性變差,脂質(zhì)體顆粒尺寸增大[10]。因此,綜合考慮以5%作為姜黃素的最佳添加量。

        2.2 姜黃脂質(zhì)體微觀形貌

        如圖5所示,由超聲和剪切聯(lián)合超臨界CO2法制備得到分布均勻的球形小囊泡,粒徑為200 nm左右,外膜平滑顏色較深,中間內(nèi)核透明,符合脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)特征。

        2.3 姜黃素脂質(zhì)體釋放動力學

        如圖6所示,姜黃素在24 h后累計釋放了5.5%,姜黃素脂質(zhì)體在24 h內(nèi)持續(xù)釋放,共釋放了53.50%姜黃素,說明姜黃素脂質(zhì)體在體外具有緩慢釋放、提高溶解度的特點。

        圖6 姜黃素和姜黃素脂質(zhì)體體外釋放曲線

        3 結(jié)論

        本研究中建立了一種新的姜黃素脂質(zhì)體制備方法,使用超臨界CO2代替有機溶劑制備得到包封率較高的姜黃素脂質(zhì)體,具有操作簡單、無溶劑殘留、包封率高、粒徑均勻等優(yōu)點,且制備得到的姜黃素脂質(zhì)體體外釋放率是姜黃素的10倍。其中,剪切速度和超聲強度對產(chǎn)品影響最大,隨著剪切速度的增大和超聲強度增強,姜黃素脂質(zhì)體包封率顯著增大,顆粒尺寸明顯變?。坏羟兴俣冗^大或超聲強度過強會導致姜黃素脂質(zhì)體破裂,影響產(chǎn)品質(zhì)量。

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