覃亮,劉航博,韋宇,吳貽淋,周曉橦,戴思敏
(肇慶學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院,廣東肇慶 526061)
石楠藤為胡椒科植物毛蒟[Piper puberulum(Benth.)Maxim.]的干燥枝葉,又名爬巖香、巴巖香等,性辛,溫,歸肝、脾經(jīng),常用于治療風(fēng)寒濕痹、筋骨疼痛[1-2]。研究表明,石楠藤的化學(xué)成分主要有木脂素、新木脂素類、酰胺生物堿類、有機(jī)酸、甾醇類和揮發(fā)油等[3-4]。我國(guó)科研工作者對(duì)石楠藤含有的有效成分做了大量活性研究。許寶華等[5]發(fā)現(xiàn),石楠藤提取物對(duì)急性出血性壞死性胰腺炎大鼠內(nèi)毒素血癥具有較好的防治作用。陳少奇等[6]發(fā)現(xiàn),石楠藤提取物使小鼠的逃避潛伏期以及尋找平臺(tái)游泳距離均出現(xiàn)明顯地縮短(P<0.05),明顯提高AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,拮抗或修復(fù)Aβ25-35對(duì)小鼠學(xué)習(xí)能力的損傷。為拓展人們對(duì)石楠藤應(yīng)用價(jià)值的認(rèn)識(shí),本試驗(yàn)將優(yōu)化石楠藤多糖提取工藝,并評(píng)價(jià)其抗氧化活性,為石楠藤作為藥用植物資源的進(jìn)一步開發(fā)提供一定的理論參考。
石楠藤,廣東清源中藥飲片有限公司(批號(hào):1952167)。
1,1-二苯基-2-苦味基肼(DPPH,C14114102)、二甲基亞砜(DMSO,C17354346),上海麥克林生化科技有限公司;石油醚、無水乙醇、葡萄糖、苯酚等,分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;所用水為蒸餾水。
XL-30C新型高速連續(xù)式超微粉碎機(jī),廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司;TDL-40C低速大容量離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;UV-1800型紫外可見分光光度計(jì),上海美譜達(dá)儀器有限公司。
1.2.1 藥材的脫脂處理
石楠藤粉末以石油醚為溶劑,索式提取法脫脂,藥渣置于通風(fēng)處晾干,得到脫脂石楠藤干粉,備用。
1.2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
吸取0.1 mg/mL葡萄糖溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL和1.4 mL,到標(biāo)好序號(hào)的試管中,并用膠頭滴管滴加蒸餾水到2.0 mL,使之濃度稀釋為0.010 mg/mL、0.015 mg/mL、0.020 mg/mL、0.025 mg/mL、0.030 mg/mL、0.035 mg/mL和0.040 mg/mL,往試管依次滴加1.0 mL的5%苯酚溶液,輕輕振蕩加搖動(dòng),小心準(zhǔn)確地加入濃硫酸5.0 mL,靜置數(shù)分鐘。根據(jù)紫外分光光度法,在490 nm處記錄吸光度[7]。以葡萄糖溶液的濃度X(mg/mL)為橫坐標(biāo),以葡萄糖溶液的吸光度A為縱坐標(biāo),即得線性方程A=23.711X-0.1148,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7,可見在0.010~0.040 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
1.2.3 單因素試驗(yàn)
(1)提取溫度對(duì)石楠藤多糖提取率的影響。采用水提醇沉法提取石楠藤多糖,具體工藝為:將脫脂石楠藤粉末50 g置于圓底燒瓶中,加入2 L蒸餾水,分別在50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃條件下加熱攪拌提取60 min,過濾得粗多糖溶液。溶液經(jīng)脫蛋白、脫色后,再次過濾,濃縮,加入無水乙醇至乙醇含量為60%,醇沉過夜,離心得粗多糖,冷凍干燥24 h,取出存好,備用。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,多糖得率的計(jì)算如式(1)。
式(1)中,m為多糖質(zhì)量,g;M為脫脂石楠藤粉末的質(zhì)量,g。
(2)提取時(shí)間對(duì)石楠藤多糖提取率的影響。參考(1)的方法,料液比1∶40(g∶mL)、提取溫度80 ℃,加熱攪拌50 min、60 min、70 min、80 min和90 min,提取液經(jīng)脫蛋白、脫色、濃縮處理后,加入無水乙醇至乙醇含量為60%,醇沉得到多糖并按式(1)計(jì)算多糖得率。
(3)料液比對(duì)石楠藤多糖提取率的影響。參考(1)的方法,提取溫度80 ℃,提取時(shí)間70 min,料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60(g∶mL),提取液經(jīng)脫蛋白、脫色、濃縮處理后,加入無水乙醇至乙醇含量為60%,醇沉得到多糖并按式(1)計(jì)算多糖得率。
(4)醇沉體積分?jǐn)?shù)含量對(duì)石楠藤多糖提取率的影響。參考(1)的方法,料液比1∶50(g∶mL)、提取溫度80 ℃,提取時(shí)間70 min,提取液經(jīng)脫蛋白、脫色、濃縮處理后,分別加入無水乙醇至乙醇含量為50%、60%、70%、80%和90%,醇沉得到多糖并按式(1)計(jì)算多糖得率。
1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,以提取溫度、提取時(shí)間、料液比和醇沉體積分?jǐn)?shù)作為影響因素,設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)(見表1),每組3個(gè)平行。
表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表
1.2.5 多糖抗氧化試驗(yàn)
將2 mL的0.2 mmol/L DPPH(溶于95%乙醇中)添加到2 mL的樣品溶液中?;旌暇鶆蚝笤谑覝叵卤芄夥磻?yīng)15 min,在517 nm處測(cè)量上清液的吸光度,清除率計(jì)算公式如式(2)[8]。
對(duì)照用無水乙醇代替DPPH進(jìn)行,無水乙醇替代樣品作空白,維生素C用作陽性標(biāo)準(zhǔn),每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
溫度對(duì)多糖提取率的影響如圖1所示,當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時(shí),石楠藤多糖提取率達(dá)到最高,隨后多糖的提取率開始下降,因此選擇70 ℃、80 ℃、90 ℃作進(jìn)一步優(yōu)化。提取時(shí)間對(duì)多糖含量的影響如圖2所示,當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí),多糖提取率達(dá)到最高,隨后提取率趨于平緩并有下降趨勢(shì),因此選擇60 min、70 min、80 min作進(jìn)一步優(yōu)化。料液比對(duì)多糖含量的影響如圖3所示,多糖提取率隨著料液比的增大逐漸上升,當(dāng)料液比達(dá)到1∶50(g :mL)時(shí)多糖提取率達(dá)到最高,隨后趨于平穩(wěn),因此選擇1∶40、1∶50、1∶60(g :mL)的料液比作進(jìn)一步優(yōu)化。醇沉體積分?jǐn)?shù)對(duì)多糖含量的影響如圖4所示,當(dāng)醇沉體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí),多糖提取率達(dá)到最高,隨后提取率趨于平緩,故選擇50%、60%、70%作進(jìn)一步優(yōu)化。
圖1 提取溫度對(duì)多糖含量的影響
圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖含量的影響
圖3 料液比對(duì)多糖含量的影響
圖4 醇沉體積分?jǐn)?shù)對(duì)多糖含量的影響
從表2可知,石楠藤多糖提取各因素影響程度依次為醇沉體積分?jǐn)?shù)>提取溫度>料液比>提取時(shí)間,最優(yōu)提取工藝為A2B2C2D3,即提取溫度為80 ℃,提取時(shí)間70 min,料液比為1∶50(g :mL),醇沉體積分?jǐn)?shù)為70%。
表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
為驗(yàn)證工藝的穩(wěn)定性,按照優(yōu)化的工藝平行提取3次,多糖提取率分別為5.38%、5.40%、5.36%,工藝穩(wěn)定性良好。
試驗(yàn)結(jié)果表明(圖5),當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為0.2~5.0 mg/mL時(shí),石楠藤多糖對(duì)DPPH·的清除率隨著多糖濃度的增加而增加,半最大效應(yīng)濃度(EC50)為0.801 mg/mL。
圖5 多糖對(duì)DPPH·清除率的影響
本文對(duì)石楠藤多糖進(jìn)行了研究,通過正交試驗(yàn)確定了最優(yōu)提取工藝,即提取溫度為80 ℃、提取時(shí)間70 min、料液比為1∶50(g :mL)、醇沉體積分?jǐn)?shù)為70%。深入研究發(fā)現(xiàn),石楠藤多糖對(duì)DPPH·表現(xiàn)出較好的清除效果,EC50為0.801 mg/mL。石楠藤作為廣東地區(qū)常見的一味中藥材,許多有效成分尚未被人發(fā)現(xiàn),本文對(duì)其多糖的提取和抗氧化活性進(jìn)行了初步研究,為石楠藤資源的深入研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。