李新明,張雅君,郭尚,郭瀟飛
(山西農(nóng)業(yè)大學 山西功能食品研究院,山西太原 030000)
肥胖在臨床上被認為是一種代謝綜合征,主要表現(xiàn)在能量消耗、能量攝入和能量代謝紊亂。長期高脂高糖飲食是肥胖的主要誘因,一些疾?。ㄈ绺哐獕?、高血脂、腎臟疾病等)與肥胖有著緊密的關系。高脂高糖飲食導致的高脂血癥,是冠心病、心肌梗死、心臟猝死、腦卒中及動脈粥樣硬化等心腦血管疾病發(fā)病的潛在危險因素,嚴重威脅著人類、尤其是老年人健康[1-3]。近年來,對天然提取物潛在健康效應的研究發(fā)現(xiàn)了一系列相關的生物活性,包括抗氧化[4]、抗高脂血癥[5]和抗肥胖[6]等作用。
巴西菇(Agaricus blazeiMurill)又稱姬松茸,屬于傘菌目蘑菇科蘑菇屬[7]。巴西菇不僅味道鮮美,還具有藥理功效。巴西菇水提物具有許多藥理學功效,如抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗突變、抗病毒、抗衰老及抗炎癥等,還具有降血糖、降血脂、抗輻射、美容、抗過敏、預防心腦血管系統(tǒng)疾病及抑制細胞凋亡等功效[8-10]。
本文主要研究了巴西菇對高脂血癥大鼠血脂、氧化應激的影響,通過測定相關數(shù)據(jù)觀察了其在預防及治療血脂方面的效果。
巴西菇,購自太原集市。
TBA-40FR全自動生化分析儀,日本東芝公司;AL-204電子分析天平,瑞士METTLER-TOLEDO 公司;SOD試劑盒,E-30266,上海恒遠生物科技有限公司;MDA試劑盒,E-30265,上海恒遠生物科技有限公司;GSH-Px試劑盒,E-31036,上海恒遠生物科技有限公司;NANODrop2000紫外分光光度計,賽默飛世爾。
1.3.1 巴西菇水提物的制備
采用超聲波輔助水提醇沉法對巴西菇進行提取[11]。取干燥巴西菇,去除雜質(zhì),粉碎,過40目篩。按照固液比1∶10(g∶mL)加入蒸餾水混合攪拌,超聲波功率為400 W,60 ℃中提取50 min,重復3次。合并提取液,放在4 ℃的冰箱中靜置12 h,上清液用4層紗布過濾后離心。上清液用85 ℃水浴濃縮,濃縮液用Sevag法去除蛋白2次,按6倍量加無水乙醇進行沉淀,置于-20 ℃的冰箱中過夜,舍棄上清液收集沉淀,真空冷凍干燥后得到巴西菇水提取物。
1.3.2 α-葡萄糖苷酶抑制率測定
取80 μL的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)于96孔板中,再加入20 μL樣品溶液,100 μL的α-葡萄糖苷酶(0.5 U/mL)溶液,并在37 ℃搖床中孵育20 min后,加入50 μL的PNPG(5 mmol/L)溶液,并用酶標儀分別于0 min和5 min時,在405 nm處測定吸光度[12]。抑制率計算公式為:
式(1)中:A1樣品、A0樣品分別為樣品在 5 min、0 min時的吸光度;A1對照、A0對照分別為對照在5 min、0 min時的吸光度。
1.3.3 α-淀粉酶抑制率測定
采取3,5-二硝基水楊酸比色法測定α-淀粉酶的抑制作用[13]。取200 μL樣品溶液于試管中,依次加入128 μL蒸餾水、160 μL的α-淀粉酶(1 U/mL)溶液,在37 ℃搖床中孵育5 min后,加入0.5%淀粉溶液320 μL和200 μL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH=6.8),在37 ℃下反應10 min。再從中取出200 μL溶液于試管中,加入100 μL3,5-二硝基水楊酸(DNS)終止液,沸水浴15 min,取出冷卻后加入900 μL蒸餾水,混勻后取出200 μL于96孔板中,在540 nm下測定吸光值。以200 μL樣品的溶劑代替樣品,加入0.5%淀粉溶液288 μL和DNS溶液100 μL作為空白;以200 μL樣品的溶劑代替樣品,加入128 μL的蒸餾水,160 μL的α-淀粉酶(1 U/mL)溶液,100 μL的DNS終止液作為對照。測定吸光值,并按式(2)計算抑制率。
式(2)中:A1、A2、A3分別為550 nm下樣品管、空白管、對照管的吸光值。
1.3.4 蔗糖酶抑制率測定
試管中加入0.5 mL 2%蔗糖溶液,加入1.0 mL 40 mg/L的樣品溶液到抑制管和抑制對照管中,1.0 mL蒸餾水加入空白管和空白對照管中。之后,將0.5 mL蔗糖酶(20 U/mL)分別加入空白管和抑制管,0.5 mL蒸餾水加入對照管,在37 ℃下水浴10 min。接著加入1.0 mL DNS,5 min沸水浴后再加入10.0 mL蒸餾水。降低至室溫,在550 nm處測定吸光值[14],并按式(3)計算抑制率。
式(3)中:A4、A5、A6、A7分別為550 nm下空白管、空白對照管、抑制管和抑制對照管的吸光值。
1.3.5 高脂大鼠模型建立及藥物處理
實驗SD大鼠40只,隨機分為5組,每組8只,分別為基礎對照組、模型對照組、巴西菇水提取物低、中、高劑量組,每天定時喂食,自由飲水。基礎對照組喂食基礎飼料,高脂模型對照組喂食高脂飼料,巴西菇水提取物劑量組按照10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg的低、中、高劑量每天灌胃一次,同時每天定時喂食高脂飼料,自由飲水,連續(xù)飼喂40 d。
高脂飼料由1%膽固醇、10%豬油、10%蛋黃粉和79%基礎飼料組成。
在第41天從鼠股靜脈取血、2 000 r/min離心20 min分離血清。血脂指標(TG、TC、LDL-c、和HDL-c)的測定使用全自動生化分析儀來檢測。按照FFA試劑盒說明測定FFA水平。附睪脂肪組織的處理參考文獻[15]進行。
1.3.6 肝、腎組織中MDA和抗氧化酶活力的分析
各處理組大鼠進行處死,取出肝臟、腎臟來制備組織勻漿,按試劑盒說明書操作過程分別測定肝、腎組織中MDA、SOD、CAT和GSH-Px活力值。
1.3.7 脂肪系數(shù)的分析計算
式(4)中:m1為睪脂總數(shù),g;m2為鼠的體重,g。
1.3.8 測定空腹血糖、胰島素和胰島素敏感指數(shù)
分別參照空腹血糖、胰島素試劑盒說明書測定空腹血糖和胰島素水平。
按照空腹血糖和胰島素濃度的測定數(shù)據(jù),通過公式(5)計算胰島素敏感指數(shù)(Insulin Sensitive Index,ISI)。
式(5)中:ISI表示胰島素敏感指數(shù);FBG表示空腹血糖的濃度,mmol/L;INS表示胰島素濃度,mIU/L。
1.3.9 UCP-1及PPAR-γ mRNA的表達
(1)肝、腎組織的總RNA提取。按照說明書,采用RNA提取試劑盒(離心柱型)來提取總RNA,濃度及純度經(jīng)紫外分光光度計分析,不符合標準樣品被去除。
(2)cDNA合成。cDNA使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成,所有過程按照試劑盒說明書進行,反應體系總體積20 μL,每個體系試樣含2 μL 10×RT緩沖液、1 μg RNA、2 μL 隨機引物、0.8 μL dNTP、1 μL 逆轉(zhuǎn)錄酶;反應程序為:25 ℃ 10 min、37 ℃120 min、85 ℃5 min,之后取出樣品,在-20 ℃保存。
(3)PCR擴增??偡磻w系(10 μL)為cDNA模 板 2 μL,TaqManRMaster 5 μL,ddH2O 2.5μL、引物0.5 μL(序列見表1)。反應程序為:95 ℃10 min;95 ℃ 10 s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 20 s,共 40 個循環(huán);72 ℃ 5 min。每個qPCR重復3次,以β-actin作為內(nèi)參照基因,目的基因的相對表達量通過公式2-△△Gt計算。
表1 各基因引物堿基序列
巴西菇水提物對α-葡萄糖苷酶的影響如圖1所示,在一定濃度范圍內(nèi)巴西菇水提物對α-葡萄糖苷酶的活力有明顯的抑制效果,隨著質(zhì)量濃度的增大而增大。當濃度為7 mg/mL時,α-葡萄糖苷酶抑制率為78.9%。
圖1 巴西菇水提物對α-葡萄糖苷酶的影響
巴西菇水提物對α-淀粉酶的影響如圖2所示,在一定濃度范圍內(nèi)巴西菇水提物對α-淀粉酶有較好的抑制,隨著質(zhì)量濃度的增大而增大。當濃度為7 mg/mL時,α-淀粉酶抑制率為84.92%。
圖2 巴西菇水提物對α-淀粉酶的影響
巴西菇水提物對蔗糖酶的影響如圖3所示,在一定濃度范圍內(nèi)巴西菇水提物對蔗糖酶有顯著的抑制,隨著質(zhì)量濃度的增大而增大。當濃度為7 mg/mL時,蔗糖酶抑制率為92.17%。
圖3 巴西菇水提物對蔗糖酶的影響
如表2所示,高脂膳食(HFD)組大鼠血液中TC、TG、LDL-c和FFA水平較正常膳食組顯著增加HDL-c水平顯著降低,(P<0.01)。與HFD組比,HFD+巴西菇水提物組大鼠血液中TC、TG和FFA水平含量顯著升高(P<0.05,P<0.01),HDL-c水平顯著降低(P<0.05,P<0.01),且隨著巴西菇水提物劑量的增加而增加或降低,有明顯的量效關系。
表2 巴西菇水提物對實驗大鼠血脂水平的影響
如表3所示,HFD組大鼠體重和脂肪系數(shù)較正常膳食組顯著增加(P<0.01)。與HFD組比,HFD+巴西菇水提物組大鼠體重和脂肪系數(shù)顯著降低(P<0.05,P<0.01),且隨著巴西菇水提物劑量的增加而增加或降低,有明顯的量效關系。
表3 巴西菇水提物對實驗大鼠體重、脂肪系數(shù)的影響
由表4數(shù)據(jù)可知,與正常膳食對照組相比,高脂膳食模型組空腹血糖和胰島素水平增加,而胰島素敏感指數(shù)降低,有顯著性差異(P<0.01);與高脂膳食模型組相比,HFD+巴西菇水提物組的大鼠空腹血糖和胰島素水平下降,而胰島素敏感指數(shù)增加,具有顯著性差異(P<0.05,P<0.01),而且隨著巴西菇水提物劑量的增加,這一變化越顯著(P<0.01)。
表4 巴西菇水提物對實驗大鼠血糖、胰島素水平和胰島素敏感指數(shù)的影響
與正常膳食組比,高脂膳食能引起大鼠肝、腎中抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px活力顯著降低(P<0.01),MDA水平上升;與HFD組比,巴西菇水提物干預后,均顯著提高了大鼠肝、腎中SOD、CAT和GSH-Px活力(P<0.05,P<0.01),降低了MDA水平,而且這些酶活力增長與藥物劑量的增加而呈正比例關系(表5,表6)。
表5 巴西菇水提物對實驗大鼠肝臟抗氧化水平的影響
表6 巴西菇水提物對實驗大鼠腎臟抗氧化水平的影響
與正常膳食組比,高脂膳食能引起大鼠肝、腎中PPAR-γ mRNA水平顯著上升和UCP-1 mRNA水平顯著降低(P<0.01);與HFD組比,巴西菇水提物干預后,顯著降低了大鼠肝PPAR-γ mRNA表達水平、提高了腎中UCP-1 mRNA表達水平(P<0.05,P<0.01),見表7。
表7 巴西菇水提物對實驗大鼠肝、腎臟PPAR-γ mRNA和UCP-1 mRNA水平的影響
α-葡萄糖苷酶、蔗糖酶、淀粉酶是與血糖代謝有著緊密關系的3種酶[16]。本體外實驗發(fā)現(xiàn)巴西菇水提物對3種酶均能發(fā)揮良好的抑制效果。
心、腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展與脂代謝紊亂有著緊密的關系,主要的生理生化顯示在血清中TC、TG、LDL-c水平的升高與HDL-c的降低這幾個方面。許多實驗表明脂代謝紊亂與長期高脂膳食的攝取有關[17]。本實驗通過飼喂大鼠高脂飼料建立高脂血癥動物模型,模擬人類高脂膳食導致的脂代謝異常,然后通過巴西菇水提取物飼喂干預,觀察其對高脂膳食誘導的大鼠脂代謝紊亂的影響。作為藥食同源的蘑菇,巴西菇顯示出較好的改善高脂血癥的效果[18-19]。在本實驗中,巴西菇水提物可以改善高脂膳食鼠的TG、TC、LDL-c、FFA及HDL-c等血脂指標,進而改善了血脂紊亂。同時,巴西菇水提物降低了高脂膳食大鼠空腹血糖和胰島素水平,提高了胰島素敏感指數(shù)。這些都表明巴西菇有著良好的降血糖血脂的功效。
在生物機理正常的情況下,抗氧化系統(tǒng)處于良好的平衡狀態(tài),然而,在發(fā)生疾病時,生物機體的氧化水平與抗氧化水平間的平衡就會被破壞。大量研究表明,長期的高糖高脂膳食攝取會誘導生物機體自由基蓄積,造成抗氧化水平的降低,從而誘發(fā)各種疾病[20-21]。SOD、CAT和GSH-Px是生物體內(nèi)清除自由基的重要酶,能有效維護機體氧化與抗氧化的平衡。因此,機體中SOD、CAT和GSH-Px水平的高低與機體抗氧化的能力成正比。MDA是細胞膜不飽和脂肪酸過氧化反應產(chǎn)生的,是機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的重要指標,MDA水平的變化表現(xiàn)脂質(zhì)過氧化作用的程度,間接顯示出細胞的受損程度[22-24]。本實驗結(jié)果表明,飼高脂膳食的大鼠體內(nèi)抗氧化酶水平降低,巴西菇水提物能顯著增強高脂膳食大鼠肝臟、腎臟中SOD、CAT和GSH-Px活性,降低肝臟、腎臟中MDA含量,提高機體的抗氧化能力。
脂肪組織中PPAR-γ在脂肪細胞分化、協(xié)調(diào)脂類代謝相關基因過程中具有重要作用,PPAR-γ受體的活化可促進脂肪組織中脂肪酸的利用[24]。模型組鼠的肝臟PPAR-γ mRNA的相對表達量較高,這可能與鼠脂肪酸水平較高有關。PPAR-γ活化使轉(zhuǎn)運至肝臟的脂肪酸減少,脂肪合成量降低。與模型組比,巴西菇水提物低、中、高劑量組鼠脂肪組織中PPAR-γ mRNA的相對表達量下降,表明巴西菇水提物可有效降低高脂鼠肝臟脂肪沉積。這些作用可能與PPAR-γ mRNA的表達調(diào)節(jié)有關。
線粒體內(nèi)膜蛋白UCP-1能夠降低線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的跨膜質(zhì)子濃度差,減低利用質(zhì)子濃度差驅(qū)動的氧化磷酸化過程的速度,抑制三磷酸腺苷(ATP)的產(chǎn)生;UCP-1可作為檢驗棕色脂肪存在及功能活躍與否的指標[25-26]。外界刺激能促進甘油三酯脂肪酶分解甘油三酯釋放出脂肪酸,脂肪酸被轉(zhuǎn)移到線粒體產(chǎn)生熱量或進入細胞核以增加UCP-1的表達并激活棕色脂肪的活性。本實驗中肥胖大鼠經(jīng)巴西菇水提物干預后,腎周脂肪組織UCP-1 mRNA表達明顯增加,這可能是巴西菇水提物的干預抑制了肥胖大鼠白色脂肪細胞的成脂,并且保護了其糖脂代謝平衡。
巴西菇水提物具有降脂、預防肥胖、改善機體氧化應激的作用。另外,巴西菇水提物改善脂代謝與它對PPAR-γ mRNA和UCP-1 mRNA表達水平有關,該作用存在量效關系,這為巴西菇的開發(fā)利用提供一定的科學依據(jù)。