王 媚，喬安平，賈小剛，劉 琳，李 佳，張小飛，史亞軍，段琳瑜

陜西中醫(yī)藥大學藥學院 陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，咸陽 712046

近年來，高血壓也成為全球性患病率較高的疾病之一，該病長期不控制會造成諸多靶器官的損傷，進而產(chǎn)生一系列諸如心血管，腎臟等方面的并發(fā)癥。我國的成年人患病率達到了46.4%。目前，相關研究表明，天麻配伍川芎常用于高血壓疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療[1,2,3]。天麻息風止痙、平抑肝陽，是治療肝陽上亢之眩暈、頭痛的要藥。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，天麻具有降低血壓、抗心肌缺血、改善腦部供血等藥理作用[4,5]。川芎活血化瘀，去除外風，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，川芎具有降低血壓、改善血管內皮功能、增加冠脈血流量等藥理作用[6,7]。兩藥配伍，不僅平抑肝陽、活血化瘀，還能改善血管內皮、降低血壓的同時，保護靶器官的損傷[8]。

中藥因其本身的成分復雜，作用寬泛的特點及其與機體相互作用的復雜性，從分子水平系統(tǒng)對天麻-川芎藥對治療高血壓的作用機制進行解釋困難重重。然而基于藥物-疾病-靶點相互作用基礎上的網(wǎng)絡藥理學，能夠揭示多分子藥物協(xié)同作用的過程，這與中醫(yī)藥診治疾病的原理殊途同歸[9]。本研究借助網(wǎng)絡藥理學和分子對接的方法，探討天麻-川芎藥對治療高血壓的作用靶點和機制，為后續(xù)治療高血壓及其藥物篩選(臨床應用)提供更多的科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 天麻和川芎活性成分篩選及靶點的獲取

在數(shù)據(jù)庫(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)分別輸入關鍵詞天麻(TIAN MA)，川芎(CHUAN XIONG)進行檢索，以口服生物利用度≥30%，藥物相似性≥0.18為條件，獲取整理得到天麻、川芎的活性成分和對應的潛在靶點。

1.2 高血壓相關靶點的獲取

在數(shù)據(jù)庫Drugbank(https://www.drugbank.ca/)和CTD(http://ctdbase.org/)中輸入關鍵詞“hypertension”進行檢索，整理獲得疾病的靶點。

1.3 藥對作用于高血壓的靶點篩選

將分別通過TCMSP數(shù)據(jù)庫、Drugbank和CTD數(shù)據(jù)庫獲取的天麻、川芎、高血壓對應的靶點，利用Rx64 3.6.2軟件繪制韋恩圖，得到天麻-川芎藥對干預高血壓的共同潛在作用靶點。

1.4 藥對-疾病-活性成分-靶點網(wǎng)絡構建

將獲得的共同潛在作用靶點在UniProt數(shù)據(jù)庫中選擇物種為“homo sapiens”，得到對應的官方名稱，進而獲取對應的活性成分，借助Cytoscape 3.2.1軟件進行可視化處理，構建藥對-疾病-活性成分-靶點的網(wǎng)絡圖。

1.5 蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡構建及核心靶點篩選

借助STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)研究蛋白與蛋白的相互作用，挖掘其關鍵靶點。將藥對與疾病的共同靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，設置物種為homo sapiens，設置交互分數(shù)為>0.4，去除單一蛋白，獲得PPI網(wǎng)絡圖。

1.6 GO功能富集分析與KEGG富集分析

利用Metascape(http://metascape.org/)對核心靶點進行GO功能富集分析與KEGG通路富集分析。

1.7 分子對接

借助Discovery Studio 4.0軟件實現(xiàn)分子對接。在天麻-川芎治理高血壓的蛋白互作圖中選取排名靠前的核心靶點，利用PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)找出與其對應的靶點蛋白結構，進一步在Drugbank上找到核心靶點對應的陽性藥物并下載其化合物的2D結構，再將其與靶點蛋白3D結構和化合物導入Discovery Studio進行分子對接，獲得核心靶點蛋白及其化合物以及與陽性藥物的相互作用圖。

2 結果

2.1 天麻和川芎活性成分篩選結果

天麻-川芎藥對是治療高血壓的常用藥對，將這兩味中藥在中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺TCMSP數(shù)據(jù)庫進行搜索。其中天麻活性成分11個，川芎活性成分96個；再對其活性成分潛在的作用靶點進行篩選收集，利用基因轉換文件將活性成分基因全稱轉化為基因簡稱，其中天麻11個活性成分，對應靶點138個；川芎96個活性成分，對應靶點2 087個；刪除其重復項，共得天麻-川芎藥對活性成分107個，作用靶點1 010個。

2.2 高血壓相關靶點的篩選和韋恩圖繪制

將高血壓(hypertension)在Drugbank和CTD數(shù)據(jù)庫搜索靶點，以Score值從大到小排列，選取Score≥73為條件進行篩選，獲得與高血壓相關的靶點2 268個。將天麻-川芎藥對得到的1 010個靶點和高血壓的2 268個靶點借助Rx64.3.6.2軟件找出藥對-疾病共同的靶點428個。韋恩圖如圖1。

2.3 藥對活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡構建

借助Cytoscape 3.2.1軟件進行“藥對活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡構建，運用network ananlyzer對所得的網(wǎng)絡圖進行分析，得到degree平均值為8.314，再按照大于平均值(8.314)小于最大值(428)進行篩選，得到活性成分-靶點-疾病圖，即70個活性成分，83個相關靶點。說明天麻-川芎藥對治療高血壓可能是通過這70個活性成分，83個靶點發(fā)揮作用的。節(jié)點標記3種不同顏色成分來分別表示2種藥物的活性成分和靶點，藍色節(jié)點代表靶點，紫色節(jié)點為川芎，綠色節(jié)點為天麻成分，紅色代表疾病高血壓，如圖2所示。其所對應的活性成分如表1所示。

圖1 藥對靶點與疾病靶點的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of chemical component target of herb pair and hypertension target

圖2 “藥對活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡構建Fig.2 “Chemical component-target-disease core” network of Gastrodiae Rhizoma-Chuanxiong Rhizoma herb pair

表1 天麻-川芎藥對化合物名稱對應表Table 1 Corresponding table of compound names of Gastrodiae Rhizoma-Chuanxiong Rhizoma herb pair

2.4 PPI網(wǎng)絡構建及核心靶點篩選

將篩選后的83個靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫，對83個關鍵靶點進行PPI網(wǎng)絡構建，如圖3所示，將score大于0.70的通過Cytoscape 3.2.1進行可視化處理，進行靶點-靶點網(wǎng)絡構建，根據(jù)度值(degree)將核心靶點排序得到圖4。度值越大，顏色越深(紅色)，圓點也越大，在內圈；度值越小，顏色越淡(黃色)，圓點就越小，在外圈。其中最主要的靶蛋白有degree=28的腫瘤壞死因子(TNF)；degree=26的前列腺素G/H合成酶2(PTGS2)、人內皮素1(EDN1)；degree=24的重組人白介素(IL1B)；人瘦素(LEP)；類胰島素生長因子(IGF1)；degree=23的過氧化氫酶(CAT)、雌激素受體基因(ESR1)；degree=22的多巴胺受體(DRD2)、糖皮質激素受體基因(NR3C1)；degree=19的載脂蛋白(APOE)；degree=18的白細胞介素(IL10)；degree=17的膜連蛋白(ANXA1)；degree=16的催產(chǎn)素(OXT)、雄激素受體(AR)、c反應蛋白(CRP)、β連環(huán)蛋白(CTNNB1)。

圖3 天麻-川芎藥對治療高血壓的蛋白質相互作用(PPI)網(wǎng)絡圖Fig.3 PPI network of Gastrodiae Rhizoma-Chuanxiong Rhizoma herb pair in treatment of hypertension

圖4 核心靶點排序圖Fig.4 Core target ranking chart

2.5 GO功能富集分析與KEGG富集分析

將83個核心靶點上傳至Metascape，參數(shù)設置為H species，進行GO功能富集分析，共獲得1 366條GO條目，其中生物進程主要涉及血液循環(huán)(blood circulation)、循環(huán)系統(tǒng)過程(circulatory system process)、細胞對有機環(huán)化合物的反應(cellular response to organic cyclic compound)、系統(tǒng)過程調節(jié)(regulation of system process)、化學性突觸傳遞(chemical synaptic transmission)、順行跨突觸信號(anterograde trans-synaptic signaling)等方面。分子功能主要涉及核受體活性(nuclear receptor activity)、轉錄因子活性(transcription factor activity)等方面。細胞組分主要涉及突觸膜(synaptic membrane)、突觸后膜(post synaptic membrane)、突觸后(post synapse)等方面(如圖5)。

圖5 GO分析結果Fig.5 GO analysis results注：BP：生物進程；CC：細胞組分；MF：分子功能。Note:BP:Biological process;CC:Cell component;MF:Molecular function.

對83個核心靶點進行KEGG通路富集分析后，依據(jù)P值≤0.5排序篩選出前20條通路(如圖6)。圓點大小代表富集到此通路的基因數(shù)目，顏色代表lg P value值，從藍色到紅色，表示lg P value從大到小，富集程度越來越顯著。結合文獻，鈣信號通路(calcium signaling pathway)可能是天麻-川芎藥對治療高血壓的最重要通路[22](如圖7)。神經(jīng)活性配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、癌癥的途徑(pathways in cancer)、cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)等可能是較重要的信號通路。

2.6 分子對接分析

利用Discovery Studio 4.5軟件選取天麻-川芎藥對治療高血壓的蛋白互作核心靶點排序中度值最高的前三個靶點TNF、PTGS2、EDN1以及與其相對應的化合物進行分子對接，同時以相應靶蛋白的陽性藥進行對照驗證(見表2)。其中間羥基苯甲酸、油酸、亞油酸乙酯、反式β-金合歡烯、十四烷與靶點TNF、PTGS2、EDN1有著良好的結合力(見圖8)。對接結果說明天麻川芎藥對治療高血壓是通過多靶點，多成分進行干預的。

3 討論與結論

目前高血壓是我國發(fā)病率較高的疾病之一，慢性的長期高血壓會引起一系列的并發(fā)癥。在中醫(yī)上將其歸為“眩暈”“頭痛”范疇。文獻顯示，天麻、川芎配伍，天麻息風止痙，主頭風、頭痛，是治療高血壓的前十位中藥之一[10]，川芎活血化瘀、祛風止痛。兩者配伍相輔相成，是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面的經(jīng)典藥對[11]，也在治療高血壓的方劑中作為重要藥對經(jīng)常配伍出現(xiàn)[10,12,13]。

本研究分析得到了天麻-川芎藥對治療高血壓的潛在作用靶點83個，涉及活性成分71個，其中天麻素、谷甾醇、間羥基苯甲酸、對羥基苯甲醇等活性成分是天麻治療高血壓的有效成分；阿魏酸、川芎哚、洋川芎醌、洋川芎內酯、谷甾醇等活性成分是川芎治療高血壓的有效成分，運用用藥規(guī)律分析也挖掘到天麻-川芎參與治療高血壓的主要藥物[14-16]；有研究表明，天麻-川芎藥對在藥效學上，天麻能夠提高川芎中阿魏酸等有效成分的吸收并延長其作用時間，川芎中洋川芎內酯可增加天麻有效成分的入腦量，延長半衰期，進而提高生物利用度[17]。

圖6 天麻-川芎治療高血壓潛在靶點KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis of potential targets of Gastrodiae Rhizoma-Chuanxiong Rhizoma herb pair in treatment of hypertension

圖7 天麻-川芎藥對治療高血壓的重要通路-鈣信號通路Fig.7 An important pathway of Gastrodiae Rhizoma-Chuanxiong Rhizoma herb pair in treatment of hypertension disease-calcium signaling pathway

表2 核心靶點與對應化合物結合活性得分Table 2 Score of binding activity between core targets and corresponding compounds

續(xù)表2(Continued Tab.2)

圖8 核心靶點與核心成分、陽性藥物分子對接圖Fig.8 Molecular docking results of core targets combined with core components and positive drugs注：A：腫瘤壞死因子和間羥基苯甲酸；B：腫瘤壞死因子和7,8-二甲基-10-(1′-D-核糖基)-異咯嗪；C：前列腺素G/H合成酶2和間羥基苯甲酸；D：前列腺素G/H合成酶2和二十碳五烯酸的乙酯；E：人內皮素1和反式β-金合歡烯；F：人內皮素1和TBC-3711。Note:A:TNF and m-hydroxybenzoic acid;B:TNF and riboflavin;C:PTGS2 and m-hydroxybenzoic acid;D:PTGS2 and icosapent;E:EDN1 and trans-β-farnesene;F:EDN1-TBC-3711.

在PPI分析中靠前的靶點有腫瘤壞死因子(TNF)、前列腺素G/H合成酶2(PTGS2)、人內皮素1(EDN1)、重組人白介素(IL1B)、人瘦素(LEP)、類胰島素生長因子(IGF1)、雌激素受體基因(ESR1)、多巴胺受體(DRD2)、糖皮質激素受體基因(NR3C1)、過氧化物酶體增殖物受體基因(PPARG)、載脂蛋白(APOE)等。其中PTGS2主要引起炎癥反應[18]；END1是血管收縮調節(jié)的內源性重要因子，在維持血管張力和心血管穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[19,20]。此外，雄激素受體(AR)和雌激素受體(ER)α、β在血管內皮細胞、血管平滑肌細胞等重要血管組織中均有表達。AR作為雄激素的中介物質，其通過與雄激素結合而發(fā)揮作用。雌激素受體基因(ESR1)編碼了ERα，ERα在舒張血管、促進新血管形成和心肌細胞凋亡中起著比ERβ更重要的心臟保護作用[21]。PPARG主要表達在脂肪組織，與胰島素抵抗、脂肪細胞分化、機體免疫有密切關系[2]。故推測天麻-川芎可以在炎癥反應、胰島素抵抗、調控血脂等方面產(chǎn)生作用以調節(jié)血壓水平。

在GO和KEGG分析中，篩選出天麻-川芎20條信號通路與高血壓相關，鈣信號通路可能與其密切相關[22]。既往研究表明，血管內皮損傷導致炎癥介質的釋放參與了高血壓的病理過程，促進并加重了高血壓的發(fā)展[22]。有研究表明，TLR4/NF-κB通路介導的炎癥反應以及免疫系統(tǒng)異常是造成高血壓發(fā)生的病理機制之一[23]，TNF-α即腫瘤壞死因子能夠與受體結合后激活TNF通路產(chǎn)生促炎復合物，可見，TNF-α能夠通過多種信號通路促使平滑肌細胞增殖，進而導致細胞內鈣濃度增大，引發(fā)血管收縮，血壓升高[24]。鈣信號通路通過鈣離子傳感器STIM1調節(jié)鈣離子的穩(wěn)態(tài)，從而調節(jié)血管細胞穩(wěn)定性，并通過發(fā)揮調脂、抗炎、改善內皮功能等多種效應，進而對高血壓發(fā)生發(fā)展過程中的多因素多環(huán)節(jié)起到調節(jié)作用，起到延緩病理進展的作用[25]。這與文獻報道的天麻-川芎藥對通過降低TNF等炎癥因子水平抑制NF-κB通路，調節(jié)血管內皮細胞，調節(jié)細胞內鈣、鈉的穩(wěn)態(tài)，抑制炎癥反應而實現(xiàn)降壓是一致的[26,27]?，F(xiàn)代藥理研究表明平肝潛陽類藥物可通過改善血管內皮功能、調節(jié)RAAS系統(tǒng)、調節(jié)中樞交感神經(jīng)等方式起到降壓的作用[20]。進一步從分子對接的角度說明蛋白與配體的結合活性，結合文獻，選取了排名靠前的三個關鍵靶點TNF、PTGS2、END1，再結合與蛋白有關的3個陽性藥，配體選擇與其對應的成分化合物，結果表明，天麻-川芎藥對對于高血壓的干預效果中，其蛋白配體的結合活性優(yōu)于與陽性藥的結合；天麻中的天麻素、間羥基苯甲酸與靶點作用力強，川芎中的阿魏酸、洋川芎內酯與靶點作用力強，表明兩者協(xié)同起作用，與文獻一致[17]。其對應的靶點也顯著富集在鈣信號通路、TNF信號通路等多條信號通路上，充分證明了該藥對是多途徑協(xié)同作用的。

綜上，本研究通過借助網(wǎng)絡藥理學和分子對接的方法，對天麻-川芎藥對治療高血壓的作用機制進行了初步的探討，揭示了天麻-川芎藥對可能通過谷甾醇、間羥基苯甲酸、對羥基苯甲醇、天麻素、阿魏酸、川芎哚、洋川芎醌等潛在有效成分，共同作用于TNF、PTGS2、EDN1等多個靶點；通過鈣信號通路、癌癥的途徑和TNF信號通路等，參與細胞內鈣鈉離子轉運，血管內皮功能、炎癥反應、糖脂代謝和氧化應激等發(fā)揮降壓的作用，證明了該藥對通過多成分、多途徑和多靶點協(xié)同作用治療高血壓的，為進一步研究天麻-川芎藥對治療高血壓的分子生物學驗證奠定了理論基礎。