蘆曉芳，唐雨薇，高春艷，張永坡，岳愛琴，趙晉忠

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，太谷 030801

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)莧科藜屬雙子葉植物，原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)，具有營養(yǎng)成分全面、保健功效顯著、耐逆境脅迫能力強(qiáng)等特點(diǎn)[1]。其中皂苷是其主要的營養(yǎng)物質(zhì)[2]，它具有抗氧化清除自由基、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗真菌等生物活性，可作為制藥工業(yè)原料[3,4]。在藜麥皂苷生物活性的研究上，多為抗氧化活性、抑菌活性以及免疫增強(qiáng)等方面[5]。基于傳統(tǒng)提取法，Dong等[6]通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)，獲得藜麥麩皮總皂苷的最佳提取工藝組合：乙醇濃度75%、超聲溫度45 ℃、料液比15 mL/g、超聲時(shí)間1.5 h，此條件下皂苷得率可達(dá)(2.370+0.022)%。Du等[7,8]利用高速逆流色譜法，分離得到藜麥種皮皂苷。為進(jìn)一步提高藜麥皂苷的提取率，國內(nèi)外學(xué)者引入超聲、微波等輔助作用[9]達(dá)到改進(jìn)藜麥皂苷的提取方法。

本文以白藜麥籽粒為原料，基于超聲輔助提取法，引入外加負(fù)壓，探尋超聲時(shí)間、溫度及負(fù)壓等操作條件對藜麥皂苷提取率的影響，通過響應(yīng)面試驗(yàn)獲得超聲-負(fù)壓輔助提取藜麥皂苷的最佳工藝條件，為藜麥皂苷的提取及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)高效、綠色提取提供數(shù)據(jù)支撐。采用飽和正丁醇萃取法分離純化藜麥皂苷粗提物，得到藜麥總皂苷，對其進(jìn)行體外活性實(shí)驗(yàn)，考察其體外抗氧化活性，這將為藜麥皂苷的生產(chǎn)制備及在醫(yī)藥和功能食品開發(fā)應(yīng)用及其作用機(jī)制提供重要參考依據(jù)，也有利于其進(jìn)一步開發(fā)利用，擴(kuò)大藜麥的應(yīng)用范圍及商業(yè)價(jià)值，達(dá)到藜麥資源的充分、高效利用。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 材料與儀器

齊墩果酸標(biāo)品(110709-201607，中國食品藥品檢定研究院)；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)(PRPDE-JO，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；其他試劑均為分析純。

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州普天儀器制造有限公司)；UV1100分光光度計(jì)(長沙科美分析儀器有限公司)；DL-0506低溫冷卻液循環(huán)泵(河南兄弟儀器設(shè)備有限公司)；YRE2000E旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵(鄭州予華儀器制造有限公司)；YXSF-500中藥粉碎機(jī)(上海百航實(shí)業(yè)有限公司)；KM-300DE中文液晶臺(tái)式超聲波清洗器(昆山美美超聲儀器有限公司)；掃描電子顯微鏡VEGA Ⅱ RSU型(TESCAN公司)。

1.2 測試方法

1.2.1 材料預(yù)處理

白藜麥種子(山西嵐縣)粉碎后過孔徑0.42 mm篩，制得藜麥粉末。將藜麥粉末置于石油醚中浸泡過夜，反復(fù)2～3次，至石油醚溶液無色為止，抽濾后自然晾干，即為脫脂藜麥粉末樣品，備用。

1.2.2 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取4.000 0 mg齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，無水甲醇溶解并定容，得到濃度0.20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別準(zhǔn)確吸取0、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、0.90 mL的齊墩果酸甲醇溶液，置于20 mL具塞試管中，70 ℃水浴揮干溶劑，冰水浴中冷卻后，加入0.20 mL 5%的香草醛-冰醋酸顯色劑和0.80 mL 80%濃硫酸，搖勻；70 ℃水浴加熱15 min，冰水浴冷卻后加入5.00 mL冰醋酸稀釋，搖勻，靜置15 min；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于分光光度計(jì)300～900 nm處進(jìn)行掃描，選定最大吸收波長，即為檢測波長；以空白為對照，在最大吸收波長處測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程[10]。

1.2.3 樣品溶液的制備

1.000 0 g去脂藜麥粉末中加入20.00 mL濃度為70%的乙醇溶液，于一定的超聲時(shí)間、超聲溫度和附加負(fù)壓條件下提取藜麥皂苷，過濾，將濾液置于70 ℃水浴鍋上水浴蒸干，用甲醇溶解并定容至25.00 mL，即得樣品溶液。

1.2.4 藜麥皂苷含量的測定

準(zhǔn)確量取0.25 mL樣品溶液置于20.00 mL具塞試管中，70 ℃ 水浴揮干溶劑，采用“1.2.2”的方法，最大吸收波長處測定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得到皂苷濃度。

1.2.5 皂苷得率計(jì)算

藜麥皂苷得率計(jì)算如公式(1)所示。

(1)

式中，皂苷得率的單位為mg/g；C表示根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的皂苷濃度(mg/mL)；V表示提取液總體積(mL)；m表示樣品質(zhì)量(g)。

1.2.6 藜麥皂苷提取的單因素試驗(yàn)

精密稱取脫脂藜麥粉末1.000 0 g，按表1所示考察超聲時(shí)間、超聲溫度和負(fù)壓等單因素條件對藜麥皂苷提取得率的影響。乙醇濃度70%，料液比1∶20，超聲功率270 W，超聲溫度40 ℃時(shí)，考察超聲時(shí)間對皂苷得率的影響；乙醇濃度70%，料液比1∶20，超聲功率270 W，超聲20 min時(shí)，考察超聲溫度對皂苷得率的影響；乙醇濃度70%，料液比1∶20，超聲功率270 W，負(fù)壓10 min，超聲20 min，超聲溫度60 ℃時(shí)，考察負(fù)壓對皂苷得率的影響。采用“1.2.4”方法測定藜麥皂苷的濃度，采用“1.2.5”方法計(jì)算藜麥皂苷得率。

1.2.7 響應(yīng)面試驗(yàn)

在基于單因素實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取上述三個(gè)影響因素為自變量，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

1.2.8 藜麥總皂苷SEM表征

利用掃描電子顯微鏡分析和描述藜麥籽粒細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)在不同提取條件下提取皂苷后的變化。SEM表征檢測條件為：加速電壓(HV)20.0 kV，工作距離(WD)7.08 mm，放大(MAG)200 kx。

表1 藜麥皂苷提取單因素實(shí)驗(yàn)條件(n=3)Table 1 Single factor experimental conditions for extraction of quinoa saponin (n=3)

1.2.9 藜麥皂苷的純化

藜麥皂苷純化過程中，針對大孔樹脂吸附法分離純化效率低和硅膠柱層析法易吸附難脫附的局限，采用正丁醇萃取法精制藜麥皂苷，具體步驟：甲醇溶解藜麥皂苷粗提物，水飽和的正丁醇溶液萃取，合并正丁醇萃取液，旋蒸冷卻，藜麥皂苷析出。經(jīng)正丁醇萃取得到的藜麥皂苷純度及產(chǎn)量都顯著高于大孔樹脂吸附法和硅膠柱層析法。

1.2.10 藜麥總皂苷活性

將樣品母液稀釋不同倍數(shù)，以Vc為陽性對照分析藜麥皂苷的抗氧化活性。采用普魯士藍(lán)顯色法[11]通過皂苷還原Fe3+能力評價(jià)皂苷總還原力；皂苷對清除DPPH自由基的能力按Bai等[12]的方法評價(jià)。

(2)

式中，Ac表示未加樣品溶液的DPPH溶液的吸光度；Ai表示藜麥皂苷樣品或抗壞血酸與DPPH試劑混合液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以O(shè)rigin 2017繪制單因素試驗(yàn)等圖表(n=3)采用Design Expert 12 軟件進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)及分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 最大吸收波長的確定

按照“1.2.1”的方法將齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色后，用紫外分光光度計(jì)在300～900 nm處進(jìn)行掃描，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和藜麥皂苷提取液顯色后吸收曲線圖如圖1a和1b所示。由圖1a可知，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品在551 nm附近有最大吸收，由圖1b可知，藜麥皂苷提取液在551 nm附近有較大吸收，確定551 nm為其最大吸收波長。

2.2 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，由圖2可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=66.74x-0.034 19，R2=0.998 7，在此范圍內(nèi)(0～0.03 mg/mL)有良好的線性關(guān)系。

圖1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)和藜麥皂苷提取液(b)顯色后吸收曲線Fig.1 Absorption curve of oleanolic acid standard solution (a) and quinoa saponin extract (b) after coloration

該齊墩果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于檢測樣品中藜麥皂苷含量范圍為0～14.40 mg/g。

圖2 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of oleanolic acid

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 超聲時(shí)間對藜麥總皂苷得率的影響

乙醇濃度70%、料液比1∶20、超聲功率270 W和超聲溫度40 ℃條件下，超聲時(shí)間對藜麥總皂苷提取得率的影響結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，超聲時(shí)間為5 min到20 min之間時(shí)，皂苷得率隨超聲時(shí)間的增加整體呈增加的趨勢；當(dāng)超聲時(shí)間由20 min到25 min時(shí)，藜麥皂苷得率隨時(shí)間的增加呈減少趨勢。這可能是因?yàn)楫?dāng)超聲時(shí)間較短時(shí)，藜麥中皂苷的提取率隨著時(shí)間的增加而增多，而當(dāng)時(shí)間過長時(shí)，提取量隨時(shí)間的變化不顯著，且超聲波有可能會(huì)對皂苷的結(jié)構(gòu)造成了破壞，導(dǎo)致皂苷得率下降。因此，超聲時(shí)間為20 min時(shí)是最優(yōu)提取條件，此時(shí)藜麥皂苷提取率達(dá)到10.58±0.007 mg/g。

圖3 超聲輔助提取法中超聲時(shí)間對藜麥總皂苷得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of saponins in ultrasound-assisted extraction

2.3.2 超聲溫度對藜麥總皂苷得率的影響

乙醇濃度70%、料液比1∶20、超聲功率270 W和超聲20 min條件下，超聲溫度對藜麥總皂苷得率的影響結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，在超聲溫度在20 ℃到60 ℃的范圍內(nèi)，藜麥皂苷得率與超聲溫度呈正相關(guān)。因?yàn)樵碥赵诟邷叵赂兹芙猓珳囟冗^高可能會(huì)使皂苷失活，所以把超聲溫度為60 ℃作為最優(yōu)提取條件，此時(shí)藜麥皂苷提取率達(dá)到11.82±0.027 mg/g。

圖4 超聲輔助提取法中超聲溫度對藜麥總皂苷得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the yield of saponins in ultrasound-assisted extraction

2.3.3 負(fù)壓對藜麥總皂苷得率的影響

乙醇濃度70%、料液比1∶20、超聲功率270 W、超聲20 min、超聲溫度 60 ℃和負(fù)壓10 min條件下，負(fù)壓對藜麥皂苷得率的影響如圖5所示。由圖5可知，在負(fù)壓0.03 MPa到0.04 MPa以及0.06 MPa到0.07 MPa間皂苷得率與負(fù)壓呈正相關(guān)，在0.04 MPa到0.06 MPa間皂苷得率隨負(fù)壓增加呈下降趨勢，且整體誤差偏大，有可能是因?yàn)橥饧拥呢?fù)壓不好控制操作所導(dǎo)致的。因?yàn)樵谪?fù)壓為0.04 MPa時(shí)藜麥的皂苷得率最高，所以選擇0.04 MPa作為最優(yōu)提取條件，此時(shí)藜麥皂苷提取率達(dá)到11.83±0.025 mg/g。

圖5 超聲-負(fù)壓輔助提取法中外加負(fù)壓對藜麥總皂苷得率的影響Fig.5 Effect of negative pressure on the yield of saponins in ultrasonic-negative pressure assisted extraction

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

根據(jù)超聲-負(fù)壓輔助提取法的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取超聲時(shí)間、超聲溫度以及負(fù)壓三個(gè)因素，以藜麥皂苷得率為影響值，利用Design Expert 12軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平表見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平表Table 2 Box-Behnken test factor level

將各因素按表2所示的因素水平，通過響應(yīng)面分析法進(jìn)行三因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲-負(fù)壓輔助提取法的工藝條件，結(jié)果如表3所示。

通過Design Expert 12軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，得到藜麥皂苷得率與超聲時(shí)間(A)、超聲溫度(B)、負(fù)壓(C)之間的多元二次回歸模型方程為：

Y=12.12+0.066 7×A-0.101 8×B+0.200 2×C+0.033 9×AB-0.004 5×AC-0.052 0×BC-0.360 6×A2-0.810 7×B2-0.043 9×C2

試驗(yàn)結(jié)果方差分析如表4所示。由表4可知，模型的P值=0.003 2<0.01，回歸模型具有高度的顯著性，失擬值P=0.307 4>0.05，失擬不顯著，說明二次響應(yīng)曲面回歸方程能夠很好地?cái)M合本試驗(yàn)所得的結(jié)果。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Box-Behnken experimental design and results

由表4可知，二次項(xiàng)A2、B2的P值均小于0.01，對皂苷得率的影響高度顯著，一次項(xiàng)C的P值小于0.05，對皂苷得率的影響顯著，其余項(xiàng)對皂苷得率影響不顯著。

從F值的大小可以看出，三個(gè)因素對藜麥皂苷得率的影響次序?yàn)椋贺?fù)壓>超聲溫度>超聲時(shí)間。

基于二次回歸模型，各因素間交互影響的響應(yīng)面和等高線如圖6所示。由圖6a可知，皂苷得率隨著超聲時(shí)間和超聲溫度兩因素強(qiáng)度的增大而增大，到達(dá)極值后隨著超聲時(shí)間的增大而減??；由圖6b可知，超聲時(shí)間與超聲溫度的變化等高線呈橢圓形，說明超聲時(shí)間和超聲溫度兩因素對皂苷得率影響的交互作用顯著，且超聲溫度較超聲時(shí)間對皂苷得率影響稍大，與方差分析結(jié)果相符。由圖6c可知，皂苷得率隨著超聲時(shí)間的增大而增大，到達(dá)極值后隨著超聲時(shí)間的增大而減小，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)(0.03～0.05 MPa)皂苷得率隨著負(fù)壓的增大而增大；由圖6d可知，負(fù)壓的變化曲面比超聲時(shí)間的變化曲面陡峭，說明負(fù)壓較超聲時(shí)間對皂苷得率影響更顯著，與方差分析結(jié)果相符。由圖6e可知，皂苷得率隨著超聲溫度的增加而增大，到達(dá)極值后隨著超聲溫度的增大而減小，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)(0.03～0.05 MPa)皂苷得率隨著負(fù)壓的增大而增大；由圖6f可知，負(fù)壓的變化曲面比超聲溫度的變化曲面陡峭，說明負(fù)壓較超聲溫度對皂苷得率影響更顯著，與方差分析結(jié)果相符。

表4 回歸方程方差分析表Table 4 Regression equation analysis of variance table

圖6 因素交互作用對藜麥皂苷提取得率的影響Fig.6 Factors interaction effects on total saponins extraction yield from quinoa

綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，依據(jù)響應(yīng)面分析得到超聲-負(fù)壓輔助提取法提取藜麥皂苷的最佳工藝條件為：超聲時(shí)間20 min、超聲溫度59 ℃、負(fù)壓0.065 MPa，該工藝參數(shù)下藜麥皂苷得率預(yù)測值為12.37 mg/g。該條件下重復(fù)3次平行實(shí)驗(yàn)，皂苷提取量為11.95±0.034 mg/g，與皂苷得率預(yù)測值相近，說明響應(yīng)面優(yōu)化獲得的最佳提取工藝參數(shù)可靠。

2.5 不同方法提取藜麥皂苷樣品粉末SEM表征

超聲時(shí)間20 min時(shí)，超聲溫度及負(fù)壓對藜麥細(xì)胞壁破損程度的影響結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，反光越強(qiáng)，細(xì)胞壁越完整，由此可知，不同提取條件下藜麥籽細(xì)胞的破損程度依次為：(Ⅳ)超聲溫度59 ℃、負(fù)壓0.065 MPa > (Ⅲ)超聲溫度60 ℃、負(fù)壓0.04 MPa > (Ⅱ)超聲溫度60 ℃ > (Ⅰ)超聲溫度40 ℃；其對應(yīng)的藜麥皂苷得率分別為11.95±0.034 mg/g> 11.83±0.025 mg/g > 11.82±0.027 mg/g> 10.58±0.007 mg/g。細(xì)胞破損程度越大，藜麥皂苷得率越高。

圖7 藜麥粉不同提取條件作用后的SEM圖Fig.7 SEM image of quinoa powder after different extraction conditions注：(Ⅰ)超聲溫度40 ℃；(Ⅱ)超聲溫度60 ℃；(Ⅲ)超聲溫度60 ℃，負(fù)壓0.04 MPa；(Ⅳ)超聲溫度59 ℃，負(fù)壓0.065 MPa。Note:(Ⅰ) Ultrasonic temperature is 40 ℃;(Ⅱ) Ultrasonic temperature is 60 ℃;(Ⅲ) Ultrasonic temperature is 60 ℃,negative pressure is 0.04 MPa;(Ⅳ) Ultrasonic temperature is 59 ℃,negative pressure is 0.065 MPa.

2.6 藜麥皂苷的活性測定

2.6.1 還原力的測定

藜麥皂苷總還原力結(jié)果如圖8所示。藜麥皂苷的總還原力與其濃度呈正相關(guān)，雖然藜麥皂苷較抗壞血酸的還原力差，但也具有一定的還原能力。藜麥皂苷在濃度為0.25 mg/mL時(shí)的還原能力分別是濃度為0.05 mg/mL時(shí)的6.1倍、濃度為0.10 mg/mL時(shí)的2.9倍，在實(shí)驗(yàn)的濃度范圍(0～0.25 mg/mL)內(nèi)，總還原力隨著濃度的增加而增大。

圖8 藜麥皂苷的總還原力Fig.8 Total reducing power of quinoa saponins

2.6.2 清除DPPH自由基能力的測定

藜麥皂苷清除DPPH自由基能力結(jié)果由圖9所示。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)(0～0.25 mg/mL)，藜麥皂苷對DPPH自由基有清除能力與皂苷濃度呈正相關(guān)，當(dāng)濃度達(dá)到0.25 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到了(78.93±2.052)%，是濃度為0.05 mg/mL時(shí)的7.6倍、濃度為0.10 mg/mL時(shí)的4.7倍，與抗壞血酸相比略低，但也有良好的清除能力。

圖9 藜麥皂苷清除DPPH自由基的能力Fig.9 The ability of quinoa saponins to scavenge DPPH free radicals

3 結(jié)論

采用超聲-負(fù)壓輔助提取藜麥種子中的皂苷，基于單因素(超聲時(shí)間、超聲溫度和負(fù)壓)試驗(yàn)，以藜麥皂苷得率為考察指標(biāo)，考察超聲時(shí)間、超聲溫度和負(fù)壓等條件對藜麥皂苷得率的影響，通過響應(yīng)面法優(yōu)化藜麥皂苷提取工藝條件，獲得藜麥皂苷最佳提取工藝條件：超聲時(shí)間20 min、超聲溫度59 ℃、負(fù)壓0.064 MPa，該條件下藜麥皂苷提取得率(11.95±0.034 mg/g)最高，接近藜麥皂苷提取得率的預(yù)測值(12.37 mg/g)。提取三因素對藜麥皂苷得率的影響順序?yàn)椋贺?fù)壓>超聲溫度>超聲時(shí)間。經(jīng)正丁醇萃取純化后的藜麥皂苷抗氧化活性研究結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)選取的濃度范圍內(nèi)(0～0.25 mg/mL)，藜麥皂苷有較強(qiáng)的還原力和清除DPPH自由基的能力，且與其濃度呈正相關(guān)，當(dāng)濃度達(dá)到0.25 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到了(78.93±2.052)%。