賈慧珍，孫 朋，魯建美，吳 敏，許又凱

1中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園 熱帶植物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，勐臘 666303；2中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

爵床科(Acanthaceae)約有229屬，3 450種[1]。我國(guó)約有68屬311種，以云南地區(qū)種類(lèi)最多。老鼠簕屬(Acanthus)全球有30余種，其中有三種分布在中國(guó)，分別為老鼠簕Acanthusilicifolius，刺苞老鼠簕A.lecucostachyus和小花老鼠簕A.ebracteatus。在泰國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥中，老鼠簕屬植物常被用作瀉下、抗炎、治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、退熱、抗膿腫、抗?jié)兊?，其葉子被用于治療風(fēng)濕病、蛇咬、麻痹和哮喘，也可與胡椒一起作為滋補(bǔ)劑使用[2]。刺苞老鼠簕A.lecucostachyus，又名蛤蟆花，產(chǎn)云南南部且主要分布于西雙版納海拔550～1150米的密林中潮濕處，中南半島及印度也有分布[3]。傣名為“帕夯喃”，是傳統(tǒng)的傣藥，在多部傣醫(yī)藥經(jīng)書(shū)中均有記載[4,5]，主要用于治療腎結(jié)石。據(jù)《中國(guó)傣藥志》[4]中記載刺苞老鼠簕氣微，味淡，涼，入水、土塔，歸腎、膀胱經(jīng)，全草入藥具有清熱解毒，利尿化石的功效，并與盾翅藤、水紅木和腎茶等共同煎服治療慢性腎炎。傣醫(yī)使用刺苞老鼠簕治療疾病已有上千年歷史，并有明確療效，已收入2005年版第三冊(cè)傣族藥《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[5]中的法定藥材，是傣醫(yī)常用草藥之一，具有重要的藥用價(jià)值。Huo等[6]綜述國(guó)內(nèi)外老鼠簕屬植物的化學(xué)成分多為木脂素類(lèi)、苯乙醇苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)等。Babu等[7]通過(guò)藥理實(shí)驗(yàn)表明老鼠簕葉子具有抗氧化和抗腫瘤等活性。雖然刺苞老鼠簕已列為云南省法定藥材，但《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[5]只做了藥材的生藥鑒定和薄板層析等，刺苞老鼠簕的化學(xué)成分和藥理活性仍為空白。因此，本文對(duì)刺苞老鼠簕的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，并對(duì)其化合物進(jìn)行抗氧化和抗炎活性篩選，為刺苞老鼠簕的藥用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

AVANCE III 500MHz核磁共振波譜儀(德國(guó)Bruker公司)；Avance III 600MHz核磁共振波譜儀(瑞士布魯克公司)；UPLC-IT-TOF液相-離子阱飛行時(shí)間色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(島津制作所)；多功能熒光酶標(biāo)儀+搖床Varioskan Flash(美國(guó)Thermofisher)；Waters 600型高效液相色譜儀配備Waters 2996二極管陣列紫外檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)，色譜柱為YMC-Pack ODS-A(300 mm×10 mm，S-5 μm)半制備柱(TMS作內(nèi)標(biāo))；柱層層析硅膠(200～300目)和GF254薄層色譜硅膠購(gòu)自青島海洋化工廠(chǎng)分廠(chǎng)；薄層層析硅膠(10～40 μm)購(gòu)自青島美高化工有限公司；Sephadex LH-20(40～70 μm)購(gòu)自瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB公司；EYELA油浴鍋OSB-2100 和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1100(上海愛(ài)朗儀器有限公司)；倒置生物顯微鏡NIB-100(寧波永新光學(xué)股份有限公司)；臺(tái)式離心機(jī)TDL-40B(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng))；生物安全柜BSC-1100IIB2-X 和CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱QP-80(濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司)；小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7(中科院上海細(xì)胞庫(kù))；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(BI公司)；Griess Reagent、LPS及對(duì)照藥物L(fēng)-NMMA(Sigma公司)；乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、石油醚、濃硫酸等試劑均為分析純購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)。

刺苞老鼠簕全草A.lecucostachyus于2019年8月采自于云南省西雙版納傣族自治州勐臘縣勐臘鎮(zhèn)補(bǔ)蚌村，經(jīng)中科院西雙版納熱帶植物園肖春芬高級(jí)實(shí)驗(yàn)員鑒定，標(biāo)本(No.60099)存放于中科院西雙版納熱帶植物園標(biāo)本館。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取分離

取干燥的刺苞老鼠簕全草3.8 kg，粉碎，室溫下用甲醇浸泡浸提3次(七天/次)，合并提取液，濾過(guò)，減壓濃縮得總浸膏515 g。將總浸膏加適量純水混勻，使其充分溶解，用乙酸乙酯萃取8次，減壓濃縮得到乙酸乙酯部位(186 g)。乙酸乙酯部位經(jīng)大孔樹(shù)脂(純水、30%、60%、90%、丙酮)洗脫，得到5個(gè)組分(Fr.1～5)。Fr.3經(jīng)硅膠(200～300目)柱色譜(二氯甲烷-甲醇梯度)洗脫后，得到3個(gè)部分(A.1、A.2、A.3)，其中A.1經(jīng)薄層層析硅膠柱色譜，反復(fù)硅膠柱色譜(石油醚-乙酸乙酯梯度)洗脫以及重結(jié)晶得到化合物1(461.8 mg)。A.2經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜，再經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱色譜分離純化，甲醇洗脫，得到化合物2(1.3 mg)。A.3經(jīng)硅膠柱(200～300目)分離，再經(jīng)硅膠柱(10～40 μm)分離，用不同溶劑體系(二氯甲烷-甲醇，石油醚-乙酸乙酯)洗脫，得到化合物3(2.6 mg)、4(13.5 mg)和5(13.0 mg)。A.3組分經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜得到化合物6(9.0 mg)和7(1.6 mg)。Fr.4經(jīng)硅膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇)洗脫，洗脫物經(jīng)SephadexLH-20凝膠色譜，TLC檢測(cè)合并相同部分，再經(jīng)薄層層析硅膠柱色譜洗脫得到化合物8(2.8 mg)和9(45.7 mg)，過(guò)半制備HPLC(乙腈-純水40∶60)分離得到化合物10(12.5 mg)。Fr.2經(jīng)硅膠柱(200～300目)色譜分離，TLC檢測(cè)并合并相同餾分，經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜層析分離，得到化合物11(6.8 mg)、12(5.9 mg)和13(2.9 mg)。

1.2.2 活性篩選

通過(guò)DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行抗氧化活性篩選，準(zhǔn)備好與化合物對(duì)應(yīng)的EP管，終濃度為100 μM，在96孔板進(jìn)行分組，每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照組加入100 μL無(wú)水乙醇，實(shí)驗(yàn)組加入100 μL待測(cè)化合物，將DPPH工作液分別加入96孔板分組中，避光反應(yīng)30 min后，在517 nm處測(cè)吸光值。

將RAW 264.7細(xì)胞接種在96孔板，用1 μg/mL LPS進(jìn)行誘導(dǎo)刺激，同時(shí)加入待測(cè)化合物處理至50 μM，設(shè)置不含藥物組和L-NMMA陽(yáng)性藥物組為對(duì)照。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后，取培養(yǎng)基檢測(cè)NO生成，在570 nm處測(cè)定吸光值。在剩余的培養(yǎng)基加入MTS進(jìn)行細(xì)胞存活率檢測(cè)，排除化合物毒性影響。

NO生成抑制率=(OD非藥物處理組-OD樣品組)/

OD非藥物處理組× 100%

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 化合物1～13的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1-13

化合物1白色粉末，可形成晶體(甲醇);EI-MS：m/z136 [M+H]+，分子式為C7H5NO2。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.21～7.18(1H，m，H-7)，7.14(1H，dd，J= 7.6，1.0 Hz，H-4)，7.10(1H，dd，J= 7.8，1.2 Hz，H-6)，7.06(1H，dd，J= 4.7，4.1 Hz，H-5)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：157.2(C-2)，123.4(C-4)，110.9(C-5)，110.7(C-6)，125.1(C-7)，131.6(C-8)，145.4(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]基本一致，故鑒定為2-苯并噁唑啉酮(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)。

化合物2淺黃色晶體(甲醇);ESI-MS：m/z176 [M+H]+、174 [M-H]-，分子式為C10H9NO2。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.23(1H，s，H-2)，8.19(1H，d，J= 8.0 Hz，H-4)，7.45(1H，d，J= 8.0 Hz，H-7)，7.22(2H，s，H-5，H-6)，4.72(2H，s，H-9)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：195.8(C-8)，137.9(C-7a)，134.1(C-2)，127.1(C-3a)，124.3(C-6)，123.3(C-5)，122.7(C-7)，115.0(C-4)，113.0(C-3)，65.7(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]基本一致，故鑒定為3-羥基乙?；胚帷?/p>

化合物3無(wú)色針晶(甲醇);ESI-MS：m/z109 [M-H]-，分子式為C6H6O2。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.75(2H，m，H-3，H-5)，6.65(2H，m，J= 9.5，3.5 Hz，H-4，H-6)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：146.4(C-1，C-2)，120.9(C-4，C-5)，116.4(C-3，C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]基本一致，故鑒定為兒茶酚。

化合物4白色片狀結(jié)晶(甲醇);ESI-MS：m/z167 [M-H]-，分子式為C8H8O4。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.57(1H，d，J= 1.9 Hz，H-2)，7.47(1H，dd，J= 8.2，1.9 Hz，H-6)，6.75(1H，d，J= 8.2 Hz，H-5)，3.87(3H，s，-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：175.6(C = O)，150.1(C-3)，148.2(C-4)，130.5(C-6)，124.1(C-1)，115.0(C-2)，114.2(C-5)，56.4(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]基本一致，故鑒定為香草酸。

化合物5無(wú)色粉末;EI-MS：m/z169 [M+H]+，分子式為C8H8O4。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.54(1H，dd，J= 8.2，1.9 Hz，H-6)，7.52(1H，d，J= 1.9 Hz，H-2)，6.82(1H，d，J= 8.2 Hz，H-5)，3.88(3H，s，-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：170.0(C = O)，152.7(C-1)，148.7(C-3)，125.2(C-6)，123.1(C-4)，116.0(C-2)，113.90(C-5)，56.4(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]基本一致，故鑒定為methyl 3,4-dihydroxy-benzoate。

化合物6淡黃色粉末;ESI-MS：m/z138 [M+H]+，分子式為C7H7NO2。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.27(1H，s，H-8)，7.97-7.92(1H，dd，J= 8.1，1.3 Hz，H-5)，6.97-6.92(1H，dt，J= 1.5，8.1 Hz，H-3)，6.83(1H，dd，J= 8.1，1.3 Hz，H-4)，6.80-6.76(1H，dt，J= 8.1，1.5 Hz，H-2)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：161.9(C-8)，148.6(C-4)，126.8(C-5)，126.2(C-2)，122.6(C-1)，120.4(C-6)，116.3(C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]基本一致，故鑒定為N-(2-hydroxyphenyl) formamide。

化合物7白色粉末;ESI-MS：m/z168 [M+H]+，分子式為C12H9N。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.05～8.01(2H，dt，J= 8.1，0.9 Hz，H-1，H-9)，7.42(2H，dt，J= 8.1，0.9 Hz，H-3，H-12)，7.34(2H，ddd，J= 8.2，7.1，1.2 Hz，H-4，H-11)，7.13(2H，ddd，J= 8.0，7.1，1.0 Hz，H-5，H-10)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：141.5(C-2，C-13)，126.7(C-7，C-8)，124.3(C-4，C-11)，121.1(C-1，C-9)，119.5(C-5，C-10)，111.7(C-3，C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]基本一致，故鑒定為咔唑。

化合物8無(wú)色油狀物;ESI-MS：m/z279[M+H]+，分子式為C16H22O4。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.68～7.65(2H，m，H-2，H-5)，7.56(2H，dt，J= 5.8，2.9 Hz，H-3，H-4)，4.23(4H，t，J= 6.6 Hz，H-13，H-16)，1.71～1.62(4H，m，H-14，H-15)，1.44～1.3(4H，m，H-17，H-20)，0.93(6H，t，J= 7.1 Hz，H-18，H-19)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：169.3(C-7，C-10)，133.6(C-1，C-2)，132.4(C-4，C-5)，129.9(C-3，C-6)，66.7(C-13，C-16)，31.7(C-14，C-15)，20.3(C-17，C-20)，14.1(C-18，C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]基本一致，故鑒定為鄰苯二甲酰正二丁酯。

化合物9無(wú)色針晶;ESI-MS：m/z207 [M+H]+，分子式為C12H14O3。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.68(2H，d，J= 10 Hz，H-2，H-6)，6.89(3H，m，overlapped，H-1′，H-3，H-5)，5.81(1H，d，J= 12.8 Hz，H-2′)，4.16(2H，q，J= 7.1 Hz，H-1′′)，3.80(3H，s，-OCH3)，1.25(3H，t，J= 7.1 Hz，H-2′′)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：168.4(C-3′)，161.8(C-4)，144.3(C-1)，133.3(C-1′)，117.8(C-2，C-6)，114.2(C-3，C-5)，61.1(C-1′′)，55.8(-OCH3)，14.1(C-2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]基本一致，故鑒定為ethylp-methoxy-trans-cinnamate。

化合物10白色蠟狀物;ESI-MS：m/z177 [M+H]+，分子式為C11H12O2。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.67(1H，d，J= 16.0 Hz，H-7)，7.59(2H，m，H-2，H-6)，7.40(3H，dd，J= 9.5，6.0 Hz，H-3，H-4，H-5)，6.51(1H，dd，J= 16.0，1.1 Hz，H-8)，4.23(2H，q，J= 7.1 Hz，H-10)，1.30(3H，m，H-11)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：168.7(C-9)，146.1(C-7)，135.7(C-1)，131.5(C-4)，130.0(C-3，C-5)，129.2(C-2，C-6)，119.0(C-8)，61.6(C-10)，14.7(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]基本一致，故鑒定為肉桂酸乙酯。

化合物11白色針狀晶體(氯仿);ESI-MS：m/z413 [M+H]+，分子式為C29H48O。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.34(1H，dd，J= 3.4，1.8 Hz，H-6)，5.15(1H，dd，J= 15.2，8.6 Hz，H-22)，5.02(1H，dd，J= 15.2，8.7 Hz，H-23)，3.52(1H，ddd，J= 15.2，10.9，4.5 Hz，H-3)，1.01(3H，q，J= 6.5 Hz，H-19)，0.90(3H，d，J= 6.5 Hz，H-21)，0.86～0.78(3H，overlapped，H-26，H-27，H-29)，0.68(3H，d，J= 9.2 Hz，H-18)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：140.8(C-5)，138.4(C-22)，129.4(C-23)，121.9(C-6)，71.9(C-3)，57.0(C-14)，56.1(C-17)，51.4(C-9)，50.2(C-24)，42.4(C-4，C-13)，40.6(C-20)，39.7(C-12)，37.4(C-1)，36.7(C-10)，32.0(C-7，C-2，C-25)，31.8(C-8)，29.0(C-16)，25.5(C-28)，24.5(C-15)，21.3(C-21)，21.1(C-11，C-27)，19.6(C-26)，19.1(C-29)，12.3(C-19)，12.1(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]基本一致，故鑒定為豆甾醇。

化合物12無(wú)色油狀物;ESI-MS：m/z126 [M+H]+，分子式為C6H7NO2。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.57(1H，s，H-2)，7.47(1H，dd，J= 8.2，1.8 Hz，H-6)，6.76-6.73(1H，m，H-5)，3.87(3H，s，CH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：150.2(C-4)，148.1(C-3)，124.2(C-6)，115.4(C-2)，114.0(C-5)，56.2(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]基本一致，故鑒定為3-hydroxy-4-methoxypyridine。

化合物13淺黃色粉末;ESI-MS：m/z592 [M+NH4]+、597[M+Na]+，619[M+COOH]-，分子式為C35H58O6。1H NMR(500 MHz，CDCl3∶CD3OD = 3∶1)δ：5.30(1H，s，H-6)，5.08(1H，dd，J= 15.1，8.6 Hz，H-22)，4.95(1H，dd，J= 15.2，8.8 Hz，H-23)，4.34(1H，d，J= 7.8 Hz，H-1′)，3.51(1H，m，H-3)，1.19(3H，s，H-21)，0.94(3H，s，H-19)，0.77(3H，d，J= 6.1 Hz，H-26)，0.63(3H，s，H-18)；13C NMR(125 MHz，CDCl3∶CD3OD = 3∶1)δ：140.2(C-5)，138.4(C-22)，129.2(C-23)，122.3(C-6)，101.1(C-1′)，79.2(C-3)，76.3(C-3′)，75.7(C-5′)，73.5(C-2′)，70.2(C-4′)，61.9(C-6′)，56.8(C-14)，56.1(C-17)，51.2(C-9)，50.2(C-24)，42.2(C-13)，40.5(C-12)，39.6(C-20)，38.7(C-4)，37.2(C-1)，36.8(C-10)，31.9(C-7)，31.9(C-8)，31.9(C-25)，29.7(C-2)，28.9(C-16)，25.4(C-28)，24.3(C-15)，21.2(C-11)，21.1(C-21)，19.3(C-27)，19.2(C-19)，18.9(C-26)，12.2(C-29)，12.0(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]基本一致，故鑒定為豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.2 活性篩選

清除DPPH自由基[20]初篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(見(jiàn)表1)，化合物1～13均具有一定的抗氧化活性，其中化合物3和6的DPPH自由基清除率較高，表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。對(duì)其進(jìn)一步復(fù)篩，計(jì)算其IC50值，分別為105.18、299.89 μM。

3 討論與結(jié)論

本研究對(duì)刺苞老鼠簕的化學(xué)成分進(jìn)行分析，從刺苞老鼠簕全草甲醇提取物的乙酸乙酯部位中分離鑒定了13個(gè)化合物，其中包括5個(gè)生物堿(其中1、6為苯并噁唑啉酮類(lèi)生物堿，2為吲哚類(lèi)生物堿，7為β-卡波林類(lèi)生物堿、12為吡啶類(lèi)生物堿)、2個(gè)苯丙素類(lèi)及2個(gè)甾醇類(lèi)化合物。苯并噁唑啉酮類(lèi)生物堿為老鼠簕屬的主要和特征性成分，與文獻(xiàn)報(bào)道的同屬植物的化學(xué)成分相同[23]。在自然條件下，苯并噁唑嗪酮也可降解為苯并噁唑啉酮，是禾本科作物中重要的次生代謝產(chǎn)物，可通過(guò)抑制葉綠體的光合磷酸化抑制一些幼苗生長(zhǎng)，其作為除草劑的研制開(kāi)發(fā)具有廣闊的應(yīng)用前景[24]。咔唑生物堿為首次在老鼠簕屬植物中分離得到。咔唑是蕓香科植物的主要成分，不僅可插入DNA，還能抑制端粒酶和調(diào)節(jié)蛋白磷酸化，其在天然產(chǎn)物抗癌治療中扮演著重要的角色[25]?；衔镏袃翰璺?3)不僅顯示了較好的清除DPPH自由基的能力，而且體外抗炎實(shí)驗(yàn)中也顯示了較好的活性。Ramalingam等[26]研究中也表明兒茶酚衍生物具有較好的抗氧化活性，其治療慢性腎炎的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究探討。

表1 化合物1～13的抗氧化活性篩選Table 1 Screening of antioxidant activities of the compounds 1-13

表2 化合物1～10的抗炎活性篩選Table 2 Anti-inflammatory activity screeningof the compounds 1-10