陳 健， 李成潔， 李 媛

(1.海南省儋州市海南西部中心醫(yī)院麻醉科， 海南 儋州 571700 2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科， 海南 海口 570102)

腦動(dòng)脈栓塞引起的缺血性腦卒中可引起局部血供紊亂，導(dǎo)致高發(fā)病率和死亡率，占腦血管疾病的60%～80%。腦缺血再灌注(I/R)損傷是缺血性腦卒中的常見并發(fā)癥之一，腦I/R損傷的細(xì)胞和分子機(jī)制涉及氧化應(yīng)激、自噬、凋亡、炎癥反應(yīng)和壞死等多種病理過程，這些機(jī)制影響腦I/R損傷的預(yù)后[1]。因此，迫切需要一種有效的腦I/R損傷治療方法。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)自噬在腦I/R損傷的這些病理過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[2]。自噬是一個(gè)高度保守的動(dòng)態(tài)過程，降解長(zhǎng)壽命或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器，其功能隨著年齡的增長(zhǎng)而下降。作為神經(jīng)退行性疾病、癌癥和心血管疾病等慢性疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，衰老是一個(gè)不可逆的生物學(xué)過程。研究表明，自噬調(diào)節(jié)衰老相關(guān)疾病，尤其是神經(jīng)退行性疾病，包括阿爾茨海默病、帕金森病和缺血性卒中[3]。自噬可能因腦I/R損傷期間的缺血、缺氧和應(yīng)激反應(yīng)而加劇。七氟醚是一種揮發(fā)性麻醉劑，起效快，易于控制，對(duì)顱內(nèi)壓和腦氧代謝率影響極小。這些因素使其成為的神經(jīng)外科手術(shù)可行的麻醉劑。研究表明，七氟醚后處理可改善缺血再灌注后的神經(jīng)功能，并通過抑制氧自由基的產(chǎn)生來保護(hù)神經(jīng)元，從而防止細(xì)胞內(nèi)鈣超載和興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性作用[4]。盡管有研究報(bào)道七氟醚對(duì)缺血再灌注損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用，但尚不清楚七氟醚是否通過SIRT1-FOXO1信號(hào)通路調(diào)節(jié)自噬來改善腦I/R損傷。

1 材料與方法

1.1主要試劑儀器:七氟醚(江蘇恩華藥業(yè)有限公司)；SIRT1抑制劑EX527化合物(Sigma-Aldrich公司)；TUNEL染色試劑盒(羅氏公司)；TTC染色試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；紫外分光光度計(jì)(NanoDrop Technologies公司)；熒光顯微鏡(尼康儀器有限公司)；石蠟切片機(jī)(Leica公司)；透射電子顯微鏡(JEOL公司)。

1.2方 法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:60只雄性SD大鼠(240±20g)飼養(yǎng)溫度為22±2℃，相對(duì)濕度為55～65%，光照/黑暗周期為12h，可自由獲得食物和水的動(dòng)物房中。將大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)(Sham)組、缺血再灌注損傷(I/R)組、缺血再灌注損傷組+七氟醚(I/R+Sev)組、缺血再灌注損傷組+七氟醚組+EX527(I/R+Sev+EX527)組。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物已獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.2構(gòu)建大鼠腦缺血再灌注損傷模型:使用戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，正中切口暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。將單絲尼龍縫線從右側(cè)CCA插入ICA，距Willis環(huán)約18～20mm，以阻斷右側(cè)大腦中動(dòng)脈血流。MCAO誘導(dǎo)腦缺血90min后，緩慢拉出縫線，再灌注24h。整個(gè)手術(shù)過程中，大鼠直腸溫度保持在37℃。將大鼠置于室溫環(huán)境下，術(shù)后恢復(fù)正常飲食。Sham組僅分離動(dòng)脈，但無栓動(dòng)脈閉塞。I/R+Sev組大鼠再灌注后立即吸入2%七氟醚15min。I/R+Sev+EX527組大鼠在再灌注后立即吸入2%七氟醚15min和腹腔注射EX527(5mg/kg)。當(dāng)大鼠吸入七氟醚時(shí)，將其放入呼吸箱內(nèi)，入口孔通入含七氟醚的空氣，將麻醉氣體分析儀連接在出口孔處監(jiān)測(cè)氣體濃度，使七氟醚濃度調(diào)節(jié)為2%。所有大鼠均可保持自主呼吸。

1.2.3莫里斯水迷宮試驗(yàn)(Morris):Morris水迷宮由一個(gè)圓形水箱組成，水溫保持在24±2℃。將一個(gè)黑色目標(biāo)平臺(tái)固定在東南象限中部水面以下2cm處，確保該平臺(tái)對(duì)大鼠不可見。將大鼠從隨機(jī)的位置放入水中自由游泳以尋找隱藏的平臺(tái)，記錄大鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間為逃避潛伏期。如果大鼠在120s內(nèi)找不到平臺(tái)，由研究將大鼠放置在平臺(tái)上30s，記錄逃逸潛伏期為120s。每只大鼠每天測(cè)試4次，每次間隔15～20min，連續(xù)5d。在第6天，撤除上述隱藏平臺(tái)，將大鼠從第一象限放入水中，觀察并記錄大鼠在90s內(nèi)穿越原始平臺(tái)次數(shù)。

1.2.42,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色:將大鼠麻醉后，快速解剖取腦，然后將其放入-20℃的冰箱中20min。將每個(gè)大腦切成6個(gè)連續(xù)2mm厚度的切片，立即浸入0.2% TTC溶液中，在37℃下避光染色30min，并置于含有4%多聚甲醛的溶液中24h。正常腦組織被染成紅色，梗塞組織被染成白色。在顯微鏡下拍照，并使用Image J計(jì)算梗死面積。

1.2.5TUNEL染色:腦組織在4%甲醛溶液中室溫固定24h，隨后進(jìn)行石蠟包埋，制作5μm厚度的組織切片。隨后對(duì)切片進(jìn)行二甲苯脫蠟，梯度酒精水合。根據(jù)TUNEL染色試劑盒說明書進(jìn)行染色，最后在光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察。正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡陽性細(xì)胞核呈棕黃色。

1.2.6電鏡觀察自噬體空泡形成:將固定在2.5%戊二醛溶液中的大腦皮質(zhì)組織在PBS中漂洗，并在室溫下用1%檸檬酸固定1h。用分級(jí)丙酮系列脫水后，在室溫下用Pon812環(huán)氧樹脂包埋12h，將大腦皮質(zhì)組織切成1μm的切片。切片在室溫下用乙酸鈾酰染色30min，用雙蒸水沖洗。然后，切片在室溫下用檸檬酸鉛染色10min，用雙蒸水沖洗。通過電子顯微鏡觀察自噬體中液泡的形成。室溫下采用盲法統(tǒng)計(jì)自噬體數(shù)量，每個(gè)樣本選取5個(gè)區(qū)域進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.7Western blotting檢測(cè)自噬和凋亡相關(guān)蛋白:使用RIPA裂解緩沖液從周圍皮質(zhì)組織中提取總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)印跡分析通過10～12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分離。從每個(gè)樣品中取等量的總蛋白30g加入到凝膠中進(jìn)行電泳。隨后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上1.5h。接著在室溫下用5%脫脂牛奶封閉膜1h，然后與一抗4℃過夜孵育。PVDF膜在TBST中洗滌3次，每次10min，然后與辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔二抗(1∶3000)在室溫下孵育1h，TBST洗滌3次。根據(jù)制造商的說明，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑顯示蛋白質(zhì)條帶，以β-actin作為內(nèi)部對(duì)照，采用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組之間比較分析采用單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1七氟醚對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠神經(jīng)功能的影響:Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Sham組比較，I/R組大鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少；與I/R組比較，I/R+Sev組大鼠逃避潛伏期減少，穿越平臺(tái)次數(shù)增多；與I/R+Sev組比較，I/R+Sev+EX527組大鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 七氟醚對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠神經(jīng)功能的影響

2.2七氟醚處理后對(duì)腦梗死體積的影響:TTC染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠腦組織沒有白色梗死灶，與Sham組比較，I/R組大鼠腦梗死體積顯著增加；與I/R組比較，I/R+Sev組大鼠腦梗死體積減少；與I/R+Sev組比較，I/R+Sev+EX527組大鼠腦梗死體積增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 七氟醚處理后對(duì)腦梗死面積的影響

2.3七氟醚處理后對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響:TUNEL染色結(jié)果顯示，與Sham組比較，I/R組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著升高；與I/R組比較，I/R+Sev組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率降低；與I/R+Sev組比較，I/R+Sev+EX527組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3-1、圖3-2。

圖3-1 七氟醚處理后對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

圖3-2 七氟醚處理后對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

2.4七氟醚處理后對(duì)自噬的影響:透射電鏡結(jié)果顯示，與Sham組比較，I/R組自噬空泡數(shù)量明顯增加；與I/R組比較，I/R+Sev組自噬空泡數(shù)量顯著減少；與I/R+Sev組比較，I/R+Sev+EX527組自噬空泡數(shù)量增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 七氟醚處理后對(duì)自噬的影響

2.5七氟醚處理后對(duì)自噬和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響:Western blotting結(jié)果顯示，與Sham組比較，I/R組的Bad，cleaved caspase-3，Beclin-1,LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低；與I/R組比較，I/R+Sev組的Bad，cleaved caspase-3，LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2、p62蛋白表達(dá)顯著升高；與I/R+Sev組比較，I/R+Sev+EX527組的Bad，cleaved-caspase-3，LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)顯著升高，p62、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 七氟醚處理后對(duì)自噬和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.6七氟醚處理后對(duì)SIRT1-FOXO1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響:Western blotting結(jié)果顯示，與Sham組比較，I/R組的SIRT1、FOXO1蛋白表達(dá)顯著降低；與I/R組比較，I/R+Sev組的SIRT1、FOXO1蛋白表達(dá)顯著升高；與I/R+Sev組比較，I/R+Sev+EX527組的SIRT1、FOXO1蛋白表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

圖6 七氟醚處理后對(duì)SIRT1-FOXO1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

七氟醚是一種理想的神經(jīng)外科麻醉藥，具有血?dú)夥植枷禂?shù)低、蘇醒誘導(dǎo)快、腦氧代謝率降低的特點(diǎn)。七氟醚后處理可抑制腦組織的過度氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，減輕腦I/R損傷的嚴(yán)重程度。此外，七氟醚通過調(diào)控PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路，可降低神經(jīng)元凋亡，抑制自噬，減輕腦I/R損傷。在本研究中，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和TCC染色證實(shí)了七氟醚減輕神經(jīng)功能缺損，并顯著減少腦梗死體積，提示七氟醚在大鼠MCAO后再灌注期發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

腦I/R損傷是缺血性腦血管病溶栓治療過程中加重的繼發(fā)性損傷，主要涉及能量代謝紊亂、炎癥介質(zhì)釋放、自由基損傷、興奮性氨基酸釋放、誘導(dǎo)凋亡。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種形式，是由基因調(diào)控的一種活躍的細(xì)胞死亡過程。在腦I/R損傷中，大量腦組織凋亡直接導(dǎo)致神經(jīng)功能損害。抑制腦I/R損傷后caspase依賴的細(xì)胞凋亡可減少皮質(zhì)組織損傷，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)，從而改善患者預(yù)后。在本研究中，TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，七氟醚可通過抑制腦I/R損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡來保護(hù)神經(jīng)元，且七氟醚降低了促凋亡因子caspase-3和Bax的表達(dá)，并上調(diào)了抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)，從而改善神經(jīng)功能。

自噬是一種在所有真核生物中高度保守的細(xì)胞降解和循環(huán)過程。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，自噬在腦I/R損傷后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，特別是神經(jīng)元中起著雙刃劍作用。在再灌注的最初幾小時(shí)，自噬通過溶酶體系統(tǒng)降解受損的細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，在腦I/R損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。在再灌注后期，過度的自噬會(huì)過度降解具有正常功能的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)，最終導(dǎo)致自噬細(xì)胞死亡和細(xì)胞組織的繼發(fā)性損傷。已發(fā)表的數(shù)據(jù)顯示，腦I/R損傷后通過激活自噬相關(guān)蛋白LC3誘導(dǎo)自噬體的形成[5]。自噬體是一種含有受損細(xì)胞器或蛋白質(zhì)的雙膜囊泡。自噬體與溶酶體融合后，進(jìn)化為自噬溶酶體，即具有單層膜的囊泡。LC3誘導(dǎo)前自噬體結(jié)構(gòu)的形成，促進(jìn)自噬液泡的形成，使其成為自噬的標(biāo)志物。已證實(shí)LC3以兩種形式存在，即LC3I(可溶性形式)和LC3-Ⅱ(膜結(jié)合形式)，并且LC3-Ⅱ富集于囊泡膜上，促進(jìn)成熟自噬體的形成。此外，LC3-Ⅱ還通過與p62的C端結(jié)合參與自噬的降解。本研究表明，七氟醚處理后，自噬空泡的形成減少。此外，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)受到抑制，而p62蛋白水平升高，提示七氟醚的神經(jīng)保護(hù)作用與抑制神經(jīng)元自噬有關(guān)。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)是一種NAD依賴性脫乙酰酶，能夠通過脫乙酰化組蛋白調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、凋亡和自噬。之前研究表明，使用一種SIRT1抑制劑EX527對(duì)腦I/R損傷進(jìn)行預(yù)處理，可以消除SIRT1的腦保護(hù)作用[6]。FOXO1是SIRT1的下游靶標(biāo)，有報(bào)道稱，F(xiàn)OXO1在維持自噬降解活性和發(fā)育中神經(jīng)元的形態(tài)成熟方面起著至關(guān)重要的作用。研究表明，NAD+依賴性蛋白去乙?；窼IRT1在抑制自噬和抑制細(xì)胞凋亡以及FOXO1通路的下游信號(hào)傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用[7]。在本研究中，七氟醚處理上調(diào)了SIRT1/FOXO1信號(hào)通路的活性，而EX527處理時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡和自噬水平增加。以上結(jié)果提示，SIRT1/FOXO1信號(hào)通路可能與七氟醚對(duì)海馬神經(jīng)元的抗凋亡能力和抑制自噬有關(guān)。

綜上所述，本研究表明七氟醚可能通過抑制自噬對(duì)腦I/R損傷有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制與SIRT1/FOXO1信號(hào)通路有關(guān)。以上結(jié)果進(jìn)一步揭示了七氟醚發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制，并提示七氟醚治療腦I/R損傷可能是一種潛在的治療策略。