甘 卓， 李艷平， 史 冰， 王 群

(湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學科， 湖南 長沙 410007)

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)中最為多見的惡性腫瘤之一，2017年美國的最新數據顯示前列腺癌有161360例的新發(fā)病例，發(fā)病率仍位居男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病的第1位[1]。微小RNA-182(miR-182)是微小RNA-183(miR-183)基因簇[miR-183、miR-182、微小RNA-96(miR-96)]的成員，它參與了多種癌癥的重要功能并影響腫瘤的發(fā)展[2]。miR-182介導了細胞的運動性和遷移，下調miR-182表達可調控多種靶標抑制腫瘤細胞的侵襲、存活和化學抵抗性。羅俊波等[3]研究顯示，下調miR-182可促進細胞命運決定子(NUMB)過表達進而抑制結直腸癌HT-29細胞的增殖、遷移、侵襲。異黏蛋白(MTDH)是一類多功能細胞增殖調控因子，其過表達影響惡性腫瘤的生物學特性。MTDH可以促進癌細胞的增殖、生長、轉移和抑制凋亡，阻斷MTDH的信號傳導將會恢復細胞的表型、促進凋亡、提高化療的敏感性，并減少癌細胞轉移的傾向[4]。李文超等[5]研究顯示，MTDH基因沉默可抑制B淋巴瘤細胞增殖和遷移。但miR-182的表達情況是否影響前列腺癌細胞生物學行為尚未見報道。因此，本研究以前列腺癌PC-3細胞為對象，探討miR-182對前列腺癌PC-3細胞增殖、凋亡、遷移的及MTDH表達的影響，以期為前列腺癌的治療尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1細胞來源、主要試劑與儀器:人前列腺癌PC-3細胞(上海弘順生物科技有限公司，批號EY-J0907)；miR-182過表達載體(miR-182 mimics)、miR-182低表達載體(miR-182 inhibitor)由北京西美杰科技有限公司合成，批號JS009R、JS011R；胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000轉染試劑、細胞計數試劑盒8(CCK-8)、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細胞凋亡試劑盒(美國Hyclone公司，批號HD70313、HD70529、HD90657、HD10356、HD10257)；TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒、蛋白裂解液、蛋白定量試劑盒(美國Invitrogen公司，批號BI5478、BI6917、B7915、B3749K、B8011)；MTDH、β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體、兔抗鼠二抗、化學發(fā)光檢測試劑盒(美國Proteintech Group公司，批號12560-1-AP、11357-4-AP、20674-9-AP、3449-3-AP)；酶標儀、凝膠成像系統(tǒng)(美谷分子儀器上海有限公司，型號SpectraMax iD3、ImageXpress Micro 4)；顯微鏡(閎龍生物科技上海有限公司，批號BX53M)；流式細胞儀(北京吉源生物科技有限公司，型號CyFlow Cube8)；Transwell小室(北京冬璞泰和科技有限責任公司，型號353102)；熒光定量PCR儀(濟南愛來寶儀器設備有限公司，型號LEPGEN-96)。

1.2細胞培養(yǎng)及分組:前列腺癌PC-3細胞在DMEM培養(yǎng)基中(補充有10% FBS)，放置于37℃、5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數生長期的前列腺癌PC-3細胞隨機分為：對照組、miR-182 inhibitor組、miR-182 mimics組。各組培養(yǎng)方法如下，對照組：將前列腺癌PC-3細胞提供有10% FBS和青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為：5%CO2、37℃、95%N2。miR-182 inhibitor組：前列腺癌PC-3細胞培養(yǎng)方法同對照組，并使用Lipofectamine 2000試劑轉染miR-182 inhibitor。miR-182 mimics組：前列腺癌PC-3細胞培養(yǎng)方法同對照組，并使用Lipofectamine 2000試劑轉染miR-182 mimics。以上各組細胞每孔設6個平行樣，培養(yǎng)72h。

1.3細胞存活率及單克隆形成數目測定:各組細胞在96孔板中培養(yǎng)72h后，將5μL CCK-8試劑添加到每個孔中，并在37℃下孵育1h，另設空白組(只加培養(yǎng)液、CCK-8試劑)，使用酶標儀測定每個樣品在570nm處的吸光度(OD值)，計算細胞存活率，細胞存活率=實驗組OD值/空白組OD值×100%。各組細胞接種在6孔板中(300個/孔)培養(yǎng)72h后，用4%多聚甲醛固定并用結晶紫染色，顯微鏡隨機拍攝10張圖像，并進行細胞計數。

1.4細胞凋亡率測定:各組細胞培養(yǎng)72h后，采用胰蛋白酶消化收集前列腺癌PC-3細胞，在PBS中洗滌兩次，并重懸于500μL結合緩沖液中，然后加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI，在室溫下黑暗中孵育10 min后，用流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.5細胞遷移能力測定:采用Transwell小室進行細胞遷移能力測定，具體操作如下：將各組細胞(每組1×105個)接種在上室中，含有10% FBS的0.6mL DMEM培養(yǎng)基作為化學吸引劑施加到下室中，溫育24h后，用棉簽去除上室中的細胞，將下室中的細胞用4%多聚甲醛固定并用結晶紫染色，以顯微鏡進行拍照并計數(穿膜數)。

1.6細胞miR-182、MTDH mRNA表達水平測定:各組細胞培養(yǎng)72h后，使用TRIzol試劑提取前列腺癌PC-3細胞的總RNA，逆轉錄合成cDNA，然后進行熒光定量PCR反應。miR-182、MTDH、U6引物由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司合成，引物序列如下：miR-182正向：5'-TTGTGCGGCTCCTACTAA-3'，miR-182反向：5'-CATCATCATAGAGGGCAT-3'；MTDH正向：5'-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3'，MTDH反向：5'-GCGGCGCAATACGAATGCAT-3'；U6正向：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，U6反向：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。按PCR試劑盒說明書合成反應體系，然后在以下條件下進行反應：95℃ 4 min，95℃ 15 s、75℃ 10 s進行40個循環(huán)，60℃ 20 s。2-ΔΔCt法評估m(xù)iR-182、MTDH mRNA表達水平。

1.7細胞MTDH蛋白表達水平測定:各組細胞培養(yǎng)72h后，使用蛋白裂解液從前列腺癌PC-3細胞中提取總蛋白，對總蛋白進行定量分析之后，上樣進行凝膠電泳，將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上，然后將膜在封閉緩沖液中封閉1h，并與MTDH、β-actin一抗在4oC下孵育過夜。用TBST緩沖溶液洗滌后，將膜與兔抗鼠二抗在室溫下孵育1h，并用TBST洗滌3次，使用化學發(fā)光檢測試劑盒進行顯影，并分析蛋白質的灰度值。

2 結 果

2.1各組前列腺癌PC-3細胞存活率和單克隆形成數目比較:與對照組比較，miR-182 inhibitor組細胞存活率、單克隆形成數目明顯降低(P<0.05)，miR-182 mimics組細胞存活率、單克隆形成數目明顯升高(P<0.05)；與miR-182 inhibitor組比較，miR-182 mimics組細胞存活率、單克隆形成數目明顯升高(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 各組前列腺癌PC-3細胞存活率和單克隆形成數目比較

圖1 各組前列腺癌PC-3細胞單克隆形成數目比較(結晶紫染色，×200)

2.2各組前列腺癌PC-3細胞凋亡率比較:與對照組比較，miR-182 inhibitor組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，miR-182 mimics組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；與miR-182 inhibitor組比較，miR-182 mimics組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，見表2、圖2。

圖2 各組前列腺癌PC-3細胞凋亡率比較

表2 各組前列腺癌PC-3細胞凋亡率比較

2.3各組前列腺癌PC-3細胞遷移能力的比較:與對照組比較，miR-182 inhibitor組穿膜數明顯降低(P<0.05)，miR-182 mimics組穿膜數明顯升高(P<0.05)；與miR-182 inhibitor組比較，miR-182 mimics組穿膜數明顯升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組前列腺癌PC-3細胞穿膜數比較

2.4各組前列腺癌PC-3細胞miR-182、MTDH mRNA表達水平比較:與對照組比較，miR-182 inhibitor組前列腺癌PC-3細胞miR-182、MTDH mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)，miR-182 mimics組前列腺癌PC-3細胞miR-182、MTDH mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)；與miR-182 inhibitor組比較，miR-182 mimics組前列腺癌PC-3細胞miR-182、MTDH mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)，見表4。

表4 各組前列腺癌PC-3細胞miR-182 MTDH mRNA表達水平比較

2.5各組前列腺癌PC-3細胞MTDH蛋白表達水平比較:與對照組比較，miR-182 inhibitor組前列腺癌PC-3細胞MTDH蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，miR-182 mimics組前列腺癌PC-3細胞MTDH蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與miR-182 inhibitor組比較，miR-182 mimics組前列腺癌PC-3細胞MTDH蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，見表5、圖3。

圖3 各組前列腺癌PC-3細胞MTDH蛋白印跡圖

表5 各組前列腺癌PC-3細胞MTDH蛋白表達水平比較

3 討 論

我國前列腺癌發(fā)病率處于升高趨勢，多數患者診斷時已處于晚期，預后較差[6]。近幾十年來，前列腺癌的主要治療方法有所改進。然而，晚期前列腺癌患者的生存率仍然很差。因此，了解前列腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制具有重要意義。

miR-182已被證明是一種腫瘤促進因子。梁喜鵬等[7]研究發(fā)現在非小細胞肺癌組織中miR-182過表達，miR-182過表達可促進非小細胞肺癌細胞增殖。Baumann等[8]研究表明miR-182的異常表達在前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，可能成為治療前列腺癌的潛在靶點。陳燦等[9]研究發(fā)現上調miR-182表達可提高直腸癌細胞增殖、侵襲和遷移能力。武云飛等[10]發(fā)現胃癌組織中miR-182呈高表達，且miR-182高表達的早期胃癌患者內鏡黏膜下剝離術后復發(fā)率較高。本研究結果顯示，miR-182 inhibitor組細胞存活率、單克隆形成數目、穿膜數、miR-182表達水平低于對照組，凋亡率高于對照組；miR-182 mimics組細胞存活率、單克隆形成數目、穿膜數、miR-182表達水平高于對照組，凋亡率低于對照組。表明miR-182轉染成功，且miR-182低表達對前列腺癌PC-3細胞增殖、遷移具有明顯抑制作用，對其凋亡具有促進作用；miR-182過表達可逆轉前列腺癌PC-3細胞的生物學行為?？赡茉蚴莔iR-182作為促癌基因對前列腺癌具有促進作用。

MTDH位于染色體8q22，是一種多功能癌基因，在多種人類癌癥中過度表達，包括胃癌、食管鱗狀細胞癌和乳腺癌等，MTDH有助于癌癥發(fā)生和進展過程中的多種生物學過程，包括細胞生長、凋亡、轉移、侵襲、化學抗性和血管生成[11]。Li等[12]研究表明，上調MTDH表達可促進結直腸癌細胞的生長和侵襲。楊淑慧等[13]發(fā)現肺癌組織中MTDH表達水平高于癌旁正常組織，且MTDH過表達可促進肺癌細胞的活力。研究證實MTDH被鑒定為miR-182的靶基因[14]。前列腺癌細胞中MTDH呈過度表達，下調MTDH可抑制前列腺癌的進展[15]。本研究結果顯示，miR-182 inhibitor組MTDH mRNA和蛋白表達水平低于對照組，miR-182 mimics組MTDH mRNA和蛋白表達水平高于對照組。表明抑制miR-182表達可降低MTDH的表達，并阻止前列腺癌PC-3細胞的生長和轉移?？赡茉蚴莔iR-182和MTDH具有靶向關系，調控miR-182可影響MTDH的水平進而影響前列腺癌PC-3細胞的生物學行為。

綜上所述，miR-182低表達對前列腺癌PC-3細胞增殖、遷移具有明顯抑制作用，對其凋亡具有明顯促進作用；其機制可能與miR-182低表達靶向抑制前列腺癌PC-3細胞MTDH mRNA和蛋白的表達有關。