張蓓，何浩，吳海智，胡艷君，石鵬途

（湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，長(zhǎng)沙 410007）

0 引言

亞硝酸鹽不僅廣泛存在于環(huán)境中，還常常被用于食品中作為護(hù)色劑或防腐劑使用[1]，但被懷疑對(duì)人類健康有潛在影響，還可致癌[2-5]。根據(jù)GB10765-2010等國(guó)家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定[6-9]，嬰幼兒奶粉和米粉中亞硝酸鹽（以NaNO2計(jì)）含量不得超過(guò)2 mg/kg。目前國(guó)內(nèi)外定量測(cè)定食品中亞硝酸鹽的方法主要有分光光度法[10-13]、色譜法[1,14-24]、快速檢測(cè)法[12,25-26]等，但適用于以嬰幼兒奶粉和米粉為基質(zhì)的測(cè)定方法并不多，現(xiàn)行檢驗(yàn)依據(jù)GB 5009.33-2016中離子色譜法和分光光度法均有一定的局限性[27]。因此，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單、高效、低限的亞硝酸鹽檢測(cè)方法十分必要。本實(shí)驗(yàn)擬探究并優(yōu)化頂空-氣相色譜法檢測(cè)特定基質(zhì)中亞硝酸鹽的準(zhǔn)確定量方法，為快速檢測(cè)嬰幼兒配方食品和嬰幼兒谷類輔助食品中亞硝酸鹽提供新思路和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亞硝酸鈉（分析純）、四硼酸鈉（硼砂）（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）、二水乙酸鋅（分析純）、國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；環(huán)己基氨基磺酸鈉（99%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；濃硫酸（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DB-1石英毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.25μm），美國(guó)安捷倫科技有限公司；高純氮?dú)猓兌取?9.999%）、高純氫氣（純度≥99.999%）、高純空氣（純度≥99.999%），長(zhǎng)沙日臻氣體有限公司；實(shí)驗(yàn)所用嬰幼兒奶粉和米粉樣品均為市售。

1.2 儀器與設(shè)備

HS-20頂空進(jìn)樣器、Nexis GC-2030氣相色譜儀，日本島津公司；BSA224S-CW電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SQP SECURA225D-1CN電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

頂空參數(shù)：恒溫爐溫度50.0℃，樣品流路溫度90.0℃，傳輸線溫度150.0℃，GC循環(huán)時(shí)間13 min，樣品瓶恒溫時(shí)間30 min，定量閥體積1.0 mL。

柱溫升溫程序：初溫80℃保持1 min，40℃/min升溫至100℃保持2 min，40℃/min升溫至240℃保持2 min，共9 min。

進(jìn)樣口：氣化室150℃，進(jìn)樣量1 mL，色譜柱流量2.0 mL/min，分流比20∶1。

檢測(cè)器：氫火焰離子化檢測(cè)器（FID），溫度300℃。

載氣：高純氮?dú)?，流?0 mL/min，尾吹24 mL/min。

氫氣：32 mL/min；空氣：200 mL/min。

1.3.2 試劑配制

飽和硼砂溶液（質(zhì)量濃度50 g/L）：稱取5.0 g硼酸鈉，溶于100 mL熱水中，冷卻后備用。

環(huán)己基氨基磺酸鈉溶液（質(zhì)量濃度10 mg/m L）：稱取5.0 g環(huán)己基氨基磺酸鈉，用水溶解，并稀釋至500 m L。

硫酸溶液（質(zhì)量濃度100 g/L）：量取27 mL濃硫酸小心緩緩加入400 mL水中，后加水至500 mL。

亞鐵氰化鉀溶液（質(zhì)量濃度106 g/L）：稱取106.0 g亞鐵氰化鉀，用水溶解，并稀釋至1000 mL。

乙酸鋅溶液（質(zhì)量濃度220 g/L）：稱取220.0 g乙酸鋅，先加30 mL冰乙酸溶解，用水稀釋至1000 m L。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)品：亞硝酸根離子標(biāo)準(zhǔn)溶液（以亞硝酸根離子NO2-計(jì)，質(zhì)量濃度1 000μg/mL），具有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)。用水稀釋配制成質(zhì)量濃度為250.0μg/mL的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于1～4℃冰箱保存，可保存2個(gè)月。用水將亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為5.0，0.5，0.05μg/mL的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液，標(biāo)準(zhǔn)使用液現(xiàn)配現(xiàn)用。

標(biāo)準(zhǔn)工作液1～7：分別準(zhǔn)確移取質(zhì)量濃度為0.05 μg/mL的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液0.10，0.20，0.50，1.00，5.00 mL于頂空瓶中；補(bǔ)齊水至5.0 mL，此為標(biāo)準(zhǔn)工作液1～5；分別準(zhǔn)確移取質(zhì)量濃度為0.5μg/mL的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液1.00 mL和2.00 mL于頂空瓶中，補(bǔ)齊水至5.0 mL，此為標(biāo)準(zhǔn)工作液6～7。再向標(biāo)準(zhǔn)工作液1～7分別加入1.0 mL環(huán)己基氨基磺酸鈉溶液（質(zhì)量濃度10 mg/mL），用手輕微搖勻后，再分別加入1.0 m L硫酸溶液（質(zhì)量濃度100 g/L），迅速壓緊瓶蓋，并保持頂空進(jìn)樣瓶直立，在水平桌面上做快速的圓周轉(zhuǎn)動(dòng)，使物質(zhì)充分混合（轉(zhuǎn)動(dòng)過(guò)程中溶液不能接觸到密封墊，如果有接觸，需重新配制）。標(biāo)準(zhǔn)工作液1～7現(xiàn)用現(xiàn)配，待上機(jī)分析。

1.3.4 樣品前處理

稱取1.25 g（精確至0.0001 g）嬰幼兒配方食品和輔助食品樣品于25 m L比色管中，加入1.5 m L飽和硼砂溶液（質(zhì)量濃度50 g/L），混勻，再加入17.5 mL水，超聲30 min。（或者再加入17.5 mL 40℃左右的溫水，40℃水浴15 min，然后冷卻至室溫。）向溶液中加入0.5 mL亞鐵氰化鉀（質(zhì)量濃度106 g/L），混勻，再加入0.5 mL乙酸鋅溶液（質(zhì)量濃度220 g/L），混勻，用水定容至刻度，混勻后靜置20 min。用定性濾紙過(guò)濾，混勻，然后吸取濾液5.0 mL至頂空瓶中，加入1.0 m L環(huán)己基氨基磺酸鈉溶液（質(zhì)量濃度10 mg/m L），用手輕微搖勻后，再加入1.0 mL硫酸溶液（100 g/L），迅速壓緊瓶蓋，并保持頂空進(jìn)樣瓶直立，在水平桌面上做快速的圓周轉(zhuǎn)動(dòng)，使物質(zhì)充分混合（轉(zhuǎn)動(dòng)過(guò)程中溶液不能接觸到密封墊，如果有接觸，需重新配制），待上機(jī)分析。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

圖譜的采集采用島津LabSolutions軟件（版本5.98），實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Ori ginPro 8.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

本研究采用頂空-氣相色譜法對(duì)嬰幼兒配方食品和輔助食品樣品中亞硝酸鹽含量進(jìn)行測(cè)定，因此氣相部分和頂空部分參數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果起到關(guān)鍵作用。設(shè)定氣相部分參數(shù)：柱溫升溫程序按照初溫80℃保持1 min，40℃/min升溫至100℃保持2 min，40℃/min升溫至240℃保持2 min，共9 min。進(jìn)樣口氣化室溫度為150℃，色譜柱流量為2.0 mL/min，分流比為20∶1。氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）溫度300℃；設(shè)定頂空部分參數(shù)：恒溫爐溫度為50.0℃，樣品流路溫度為90.0℃，傳輸線溫度為150.0℃，樣品瓶恒溫時(shí)間30 min。采用該色譜條件對(duì)亞硝酸鹽有良好的保留作用，可以使目標(biāo)物質(zhì)亞硝酸鹽衍生產(chǎn)物環(huán)己烯[1]得到有效分離，亞硝酸鹽衍生產(chǎn)物環(huán)己烯的保留時(shí)間為1.77 min，獲得的峰形正常且分離度較好，可以對(duì)其進(jìn)行定量分析。1.0μg亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和樣品中亞硝酸鹽的氣相色譜圖分別如圖1和圖2所示。

圖1 1.0μg亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)氣相色譜

圖2 嬰幼兒配方食品和輔助食品樣品中亞硝酸鹽氣相色譜

2.2 前處理方法優(yōu)化

本研究比較了同一個(gè)樣品分別在常溫超聲30 min和40℃水浴15 min的條件下提取時(shí)的亞硝酸鹽加標(biāo)回收率，以不同樣品為橫坐標(biāo)，亞硝酸鹽的加標(biāo)回收率為縱坐標(biāo)，結(jié)果如圖3所示。兩種前處理方式均可將亞硝酸鹽提取出來(lái)，加標(biāo)回收率并無(wú)顯著性差異，均落在90%～120%的范圍內(nèi)，考慮到前處理操作的簡(jiǎn)便性以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性，因此，本研究選擇在常溫超聲30 min的條件下進(jìn)行提取。

圖3 不同前處理?xiàng)l件下加標(biāo)回收率對(duì)比實(shí)驗(yàn)

2.3 線性范圍與檢出限

分別配制終質(zhì)量濃度為0.001，0.002，0.005，0.01，0.05，0.1，0.2μg/mL的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)衍生化處理后，進(jìn)行上機(jī)測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各濃度目標(biāo)峰與該濃度呈現(xiàn)線性相關(guān)，見(jiàn)圖4。以亞硝酸鈉進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性方程與線性相關(guān)系數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖5。隨同做空白實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果扣除實(shí)驗(yàn)用水中本身含有的微量亞硝酸鹽。結(jié)果表明，亞硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=11857.2x+219.094，R2為0.9997，在濃度范圍內(nèi)線性良好。以S/N=3作為檢出限，結(jié)果表明，本研究方法檢出限為0.03 mg/kg，優(yōu)于GB 5009.33-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》中的檢出限（0.5 mg/kg）[27]。取樣量為1.25 g時(shí)，對(duì)應(yīng)的檢測(cè)范圍為0.03～18.58 mg/kg。

圖4 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度依賴性曲線

圖5 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線（以NaNO2計(jì)）

2.4 精密度

分別選取低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，按樣品前處理步驟衍生化處理后上機(jī)分析，重復(fù)6次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，亞硝酸鹽的精密度在1.05%～5.98%之間，具有良好的精密度和準(zhǔn)確性。

表1 測(cè)定亞硝酸鹽方法的精密度（n=6）

2.5 樣品加標(biāo)回收率

稱取同一種嬰幼兒配方食品和輔助食品樣品作三水平加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，分別向其中加入0.125μg、2.50μg、12.5μg亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按照樣品前處理步驟衍生處理后，平行測(cè)定6次，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表2。亞硝酸鹽的加標(biāo)回收率在94.37%～104.14%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于9.03%。均滿足GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》的要求[28]。

表2 嬰幼兒配方食品和輔助食品中亞硝酸鹽的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

（續(xù)表2）

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本研究方法對(duì)9種市售嬰幼兒配方食品和輔助食品樣品進(jìn)行檢測(cè)（結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的3次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的平均值表示），其中5個(gè)樣品均未檢出亞硝酸鹽，4個(gè)樣品均檢出亞硝酸鹽，質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.544～1.570 mg/kg之間，具體含量見(jiàn)表3。

表3 嬰幼兒配方食品和輔助食品樣品中亞硝酸鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（n=3） mg/kg

3 結(jié)果與討論

本研究采用超聲輔助衍生最大限度地提取了嬰幼兒配方食品和輔助食品中的亞硝酸鹽，并實(shí)現(xiàn)了利用頂空-氣相色譜法對(duì)亞硝酸鹽進(jìn)行準(zhǔn)確定量測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)對(duì)前處理步驟進(jìn)行了優(yōu)化，并比較了不同因素對(duì)加標(biāo)回收率的影響。結(jié)果表明，亞硝酸鹽可在1.7 min左右實(shí)現(xiàn)有效分離，并且在濃度范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線線性良好，R2為0.9997。取樣量為1.25 g時(shí)，對(duì)應(yīng)的檢測(cè)范圍為0.03～18.58 mg/kg。該方法檢出限為0.03 mg/kg，精密度在1.05%～5.98%之間。在常溫超聲30 min的條件下嬰幼兒配方食品和輔助食品樣品中亞硝酸鹽提取最充分，加標(biāo)回收率在94.37%～104.14%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均低于9.03%。該方法操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性好，檢出限低，線性范圍寬，重復(fù)性和回收率好，是快速檢測(cè)嬰幼兒奶粉和米粉中亞硝酸鹽較好的方法。