楊金輝 郝彤彤 楊凌博 康延杰 李小輝 魏澎濤 孫建濤

膀胱癌是最常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，具有易轉(zhuǎn)移和易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，患者預(yù)后往往較差[1]。研究表明，惡性增殖和侵襲是膀胱癌發(fā)展的主要原因[2]。研究膀胱癌惡性進(jìn)展的具體機(jī)制是尋找有效治療靶點(diǎn)的基礎(chǔ)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA，lncRNA)在不同類型細(xì)胞中發(fā)揮的功能不同，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、脂代謝、糖代謝、免疫等生理和病理進(jìn)程[3～5]。近年來(lái)研究顯示，lncRNA與膀胱癌的惡性進(jìn)展顯著相關(guān)，參與調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞的惡性增殖和侵襲，研究lncRNA在膀胱癌中的功能對(duì)膀胱癌的靶向治療具有重要意義[6～8]。CTC-425F1.4長(zhǎng)度為270個(gè)核苷酸，是一個(gè)全新的lncRNA，目前對(duì)于CTC-425F1.4在腫瘤細(xì)胞中的作用尚不明確。本研究旨在探討膀胱癌組織和細(xì)胞株中CTC-425F1.4的表達(dá)，觀察下調(diào)CTC-425F1.4對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響及探討其靶向調(diào)控機(jī)制，為CTC-425F1.4靶向治療膀胱癌提供參考。

材料與方法

1.材料:選取鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院泌尿外科2018年1月～2021年5月手術(shù)切除的膀胱癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織(距離腫瘤邊緣5cm)，患者術(shù)前均未接受過(guò)免疫治療、放療、內(nèi)分泌治療、化療等抗腫瘤治療。所有納入研究的組織標(biāo)本均經(jīng)病理檢查確診。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：LWLL-2021-07-15)，患者均已簽署知情同意書(shū)。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)康寧公司。LipofectamineTM3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。膀胱癌細(xì)胞UM-UC-3、T24、RT4、5637和正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。CTC-425F1.4抑制劑、陰性對(duì)照序列(control)、miR-146a-3p模擬物、陰性模擬物(NC)、野生型WT和突變型MUT熒光素酶報(bào)告載體購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司。一抗微管蛋白(α-tubulin)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子21(p21)、E盒結(jié)合鋅指蛋白1(Zeb1)、波形蛋白(Vimentin)、鋅指蛋白(Snail)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的培養(yǎng)箱中，T24、RT4、5637細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，UM-UC-3、SV-HUC-1細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。膀胱癌RT4細(xì)胞分成inhibitor組和control組，根據(jù)LipofectamineTM3000說(shuō)明書(shū)分別轉(zhuǎn)染CTC-425F1.4抑制劑和陰性對(duì)照序列。轉(zhuǎn)染后32h后，檢測(cè)CTC-425F1.4下調(diào)效果。

3.熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CTC-425F1.4、miR-146a-3p表達(dá)差異:在液氮中將膀胱癌組織和癌旁組織研磨成粉末，以TRIzol試劑提取組織和處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞的總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度，合成cDNA，建立熒光定量PCR體系。分別以β-actin和U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法分析CTC-425F1.4和miR-146a-3p表達(dá)水平。熒光實(shí)時(shí)定量PCR引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 熒光實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

4.生物信息學(xué)方法：生物信息學(xué)軟件GEPIA分析CTC-425F1.4在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異。生物信息學(xué)軟件LncBase Predicted v.2的CTC-425F1.4的靶基因。

5.CCK-8法檢測(cè)下調(diào)CTC-425F1.4對(duì)RT4細(xì)胞增殖能力的影響：將inhibitor組和control組以2000個(gè)/孔細(xì)胞接種在96孔板，分別在培養(yǎng)24、48、72、96、120h后終止培養(yǎng)。每孔加入70μl CCK-8反應(yīng)液，培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)2.5h，通過(guò)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀分析每孔在預(yù)設(shè)波長(zhǎng)(490nm)的吸光度(A)值。以A值為縱坐標(biāo)，時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)，繪制RT4細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

6.Transwell小室法檢測(cè)下調(diào)CTC-425F1.4對(duì)RT4細(xì)胞侵襲能力的影響:在Transwell小室加入稀釋后的基質(zhì)膠溶液，培養(yǎng)箱靜置5h凝固。將inhibitor組和control組以30000個(gè)/室細(xì)胞接種在上室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)32h，棉簽擦去未穿小室膜的RT4細(xì)胞，將小室在多聚甲醛溶液中固定40min，在0.7%結(jié)晶紫溶液中染色40min。通過(guò)光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)(放大倍數(shù)100倍)，隨機(jī)選取6個(gè)視野計(jì)算平均數(shù)。

7.熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定CTC-425F1.4的靶基因:將NC、miR-146a-3p分別同熒光素酶報(bào)告載體(WT和MUT)共轉(zhuǎn)染膀胱癌RT4細(xì)胞，WT含有CTC-425F1.4的結(jié)合位點(diǎn)，MUT含有突變后的CTC-425F1.4的結(jié)合位點(diǎn)。培養(yǎng)箱孵育48h，通過(guò)熒光素酶活性測(cè)定試劑盒分析各組RT4細(xì)胞中的相對(duì)熒光素酶活性。

8.Western blot法檢測(cè)p21、Zeb1、Vimentin、Snail蛋白的表達(dá):磷酸緩沖液洗滌inhibitor組和control組細(xì)胞，添加裂解溶液冰上裂解。上樣至10%的SDS-PAGE凝膠，上層膠電壓為80V，下層膠電壓為130V。轉(zhuǎn)膜電流為290mA，轉(zhuǎn)膜后的硝酸纖維素膜在封閉液中封閉3h，在一抗反應(yīng)液中過(guò)夜孵育，在辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗中孵育1.5h。均勻孵育電化學(xué)發(fā)光試劑，曝光顯影，α-tubulin為內(nèi)參。

結(jié) 果

1.CTC-425F1.4在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達(dá):生物信息學(xué)軟件GEPIA分析顯示(圖1)，膀胱癌組織中CTC-425F1.4表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(P<0.01)。本研究通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR顯示，詳見(jiàn)圖2，膀胱癌組織和癌旁組織中CTC-425F1.4的表達(dá)分別為3.21±0.26和1.05±0.15，膀胱癌組織中CTC-425F1.4表達(dá)水平明顯明顯高于癌旁組織(P<0.01)。

圖1 GEPIA分析膀胱癌組織和癌旁組織中CTC-425F1.4表達(dá)水平

圖2 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)膀胱癌組織和癌旁組織中CTC-425F1.4表達(dá)水平

2.CTC-425F1.4在膀胱癌細(xì)胞和正常膀胱上皮細(xì)胞中的表達(dá):膀胱癌細(xì)胞UM-UC-3、T24、RT4、5637和正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1中CTC-425F1.4的表達(dá)分別為3.63±0.44、5.19±0.67、9.33±1.13、2.51±0.43和1.16±0.16，CTC-425F1.4在膀胱癌細(xì)胞株中表達(dá)水平顯著高于正常膀胱上皮細(xì)胞(P<0.05，圖3)。選用CTC-425F1.4表達(dá)最高的RT4細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 CTC-425F1.4在正常膀胱上皮細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)水平與SV-HUC-1細(xì)胞比較，*P<0.05，**P<0.01

3.各組RT4細(xì)胞中CTC-425F1.4的表達(dá):control組和inhibitor組RT4細(xì)胞中CTC-425F1.4表達(dá)分別為9.52±2.01和1.09±0.36，與control組比較，轉(zhuǎn)染CTC-425F1.4抑制劑后，inhibitor組CTC-425F1.4表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。

4.下調(diào)CTC-425F1.4對(duì)RT4細(xì)胞增殖能力的影響:應(yīng)用CCK-8法連續(xù)120h檢測(cè)各組RT4細(xì)胞的增殖，與control組比較，從24h起，inhibitor組細(xì)胞增殖能力顯著被抑制(P<0.05，圖4)。

圖4 CCK-8檢測(cè)各組膀胱癌RT4細(xì)胞增殖能力與control組比較，*P<0.05，**P<0.01

5.下調(diào)CTC-425F1.4對(duì)RT4細(xì)胞侵襲能力的影響:inhibitor組和control組RT4細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)分別為36.51±5.13個(gè)和88.87±11.39個(gè)，表明CTC-425F1.4能夠抑制RT4細(xì)胞的侵襲能力(P<0.01，圖5)。

6.CTC-425F1.4靶向結(jié)合miR-146a-3p：生物信息學(xué)軟件發(fā)現(xiàn)CTC-425F1.4與miR-146a-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，詳見(jiàn)圖6。熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定顯示，WT+miR-146a-3p組和WT+NC組相對(duì)熒光素酶活性分別為6.11±1.46和1.02±0.25，說(shuō)明CTC-425F1.4靶向結(jié)合miR-146a-3p(P<0.01)。

7.下調(diào)CTC-425F1.4對(duì)RT4細(xì)胞中miR-146a-3p表達(dá)的影響：inhibitor組和control組RT4細(xì)胞miR-146a-3p的表達(dá)分別為6.26±1.08和1.03±0.32， 說(shuō)明下調(diào)CTC-425F1.4可促進(jìn)miR-146a-3p的表達(dá)(P<0.01)。

8.下調(diào)CTC-425F1.4對(duì)p21、Zeb1、Vimentin、Snail蛋白表達(dá)的影響：與control組比較，轉(zhuǎn)染CTC-425F1.4抑制劑后，RT4細(xì)胞p21蛋白水平明顯升高，侵襲相關(guān)蛋白Zeb1、Vimentin、Snail水平顯著降低(圖7)。

圖7 Western blot法檢測(cè)p21、Zeb1、Vimentin、Snail蛋白表達(dá)水平

討 論

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA，lncRNA)是近年來(lái)被廣泛研究的非編碼RNA，數(shù)千種lncRNA被發(fā)現(xiàn)和鑒定[9, 10]。lncRNA是一種新型的基因調(diào)節(jié)分子，通過(guò)識(shí)別微小RNA(miRNA)進(jìn)而調(diào)控miRNA表達(dá)，影響細(xì)胞的各種生物學(xué)行為[11,12]。研究顯示，lncRNA與膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，表現(xiàn)類似抑癌基因或癌基因作用[13, 14]。Chen等[15]研究顯示，膀胱癌細(xì)胞分泌的外泌體含有l(wèi)ncRNA LNMAT2，其不僅在體外刺激人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞管形成和遷移，也可在體內(nèi)增強(qiáng)腫瘤淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Xu等[16]研究顯示，lncRNA TINCR在膀胱癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加，其高表達(dá)與膀胱癌患者的腫瘤轉(zhuǎn)移和晚期腫瘤、淋巴結(jié)、轉(zhuǎn)移分期以及低生存率有關(guān)，lncRNA TINCR表達(dá)沉默顯著減少膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Shan等[17]研究顯示，lncRNA MEG3在膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)降低，恢復(fù)其表達(dá)通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)miR-494，抑制UM-UC-3和SW780的增殖并觸發(fā)細(xì)胞凋亡。目前有關(guān)CTC-425F1.4在膀胱癌組織中表達(dá)和調(diào)節(jié)作用機(jī)制尚不明確。

本研究顯示，CTC-425F1.4在膀胱癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加，這與GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)的研究結(jié)果一致，均提示CTC-425F1.4在膀胱癌中表達(dá)上調(diào)，CTC-425F1.4在膀胱癌中表現(xiàn)類似癌基因的功能。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，下調(diào)CTC-425F1.4后的膀胱癌細(xì)胞增殖和侵襲能力降低，同時(shí)膀胱癌細(xì)胞的侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)降低，提示CTC-425F1.4可能通過(guò)參與膀胱癌細(xì)胞增殖和侵襲介導(dǎo)膀胱癌的進(jìn)展。

lncRNA通過(guò)靶向結(jié)合miRNA，影響靶miRNA表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)功能[18]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)軟件LncBase Predicted v.2發(fā)現(xiàn)CTC-425F1.4與miR-146a-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定miR-146a-3p受到CTC-425F1.4的靶向結(jié)合作用，miR-146a-3p可能是CTC-425F1.4影響膀胱癌進(jìn)展的重要機(jī)制。miR-146a-3p屬于miRNA家族成員之一，其在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中表現(xiàn)類似抑癌基因的功能[19]。miR-146a-3p在去勢(shì)抵抗性前列腺癌組織中低表達(dá)，能夠顯著抑制去勢(shì)抵抗性前列腺癌的進(jìn)展[20]。研究顯示，miR-146a-3p在膀胱癌組織和細(xì)胞株中表達(dá)降低，上調(diào)miR-146a-3p顯著促進(jìn)抑癌基因p21的表達(dá)，miR-146a-3p具有抗細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用[19]。本研究顯示，下調(diào)CTC-425F1.4可以明顯上調(diào)miR-146a-3p的表達(dá)，同時(shí)顯著上調(diào)p21蛋白的表達(dá)，提示下調(diào)CTC-425F1.4通過(guò)靶向調(diào)控miR-146a-3p參與膀胱癌的進(jìn)展過(guò)程。

綜上所述，CTC-425F1.4在膀胱癌組織中高表達(dá)，其在膀胱癌進(jìn)展中可能發(fā)揮癌基因作用，下調(diào)CTC-425F1.4明顯抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲，其作用機(jī)制與靶向調(diào)控miR-146a-3p表達(dá)相關(guān)。CTC-425F1.4可能作為一種癌基因成為膀胱癌治療的靶點(diǎn)。