李 威 陳 靜 樊銳鋒 匡洪影 徐邱鴻 潘紫萌

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)屬中醫(yī) “閉經(jīng)”、“不孕”范疇，對中醫(yī)證候成因的研究表明，線粒體功能異?？赡苁恰捌⑹н\化，聚濕成痰”的生物學(xué)基礎(chǔ)[1，2]。PCOS患者的卵巢中ROS水平異常升高、線粒體DNA拷貝數(shù)降低，提示PCOS患者卵巢細(xì)胞功能變化可能與線粒體活性的改變相關(guān)[3]。PCOS患者卵巢組織存在磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信號通路異常，而PI3K通路及其下游的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是細(xì)胞調(diào)節(jié)線粒體活性關(guān)鍵機制之一[4]。這預(yù)示著胰島素信號通路的異常也可能影響細(xì)胞的線粒體功能。

中藥“蒼附導(dǎo)痰湯”能治療PCOS患者生殖及代謝異常表現(xiàn)，而且能通過調(diào)節(jié)PI3K/mTOR信號通路降低PCOS大鼠的胰島素抵抗指數(shù)及血清睪酮水平[5，6]。筆者推測該方劑的療效機制很可能與其對細(xì)胞線粒體活性的調(diào)節(jié)有關(guān)。本研究應(yīng)用蒼附導(dǎo)痰湯對PCOS模型大鼠進行干預(yù)治療，并應(yīng)用慢病毒包被的mTOR基因的shRNA表達載體進行卵巢原位注射，觀察關(guān)鍵因子表達水平的改變對中藥療效的影響，為闡明PCOS的可能病因及中藥復(fù)方療效機制提供證據(jù)支持。

材料與方法

1.實驗材料：(1)實驗動物：體質(zhì)量為50±5g的清潔級雌性23 日齡SD 大鼠購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，實驗動物許可證號[SCXK(黑)2013-001]。飼養(yǎng)于12h 晝夜交替環(huán)境下,自由攝取食水。實驗過程中對大鼠的操作均按照黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物使用與醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行,符合動物福利的基本原則。(2)主要試劑：實驗用“蒼附導(dǎo)痰湯”由蒼術(shù)、香附、半夏、陳皮、茯苓、膽南星、枳殼、生姜、炙甘草組成，組方中藥購自廣州康美藥業(yè)股份公司，煎煮濃縮至1.81g/ml生藥；抗體P110、AKT、mTOR、Drp-1、Fis-1、Mfn-1購自英國Abcam公司，抗體β-actin購自美國Santa Cruz公司；慢病毒包被的mTOR shRNA序列及scramble序列表達載體的慢病毒購自上?；鶆P生物公司，效價均為1×109TU/ml，其中載體自身攜帶的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)序列與所表達的mTOR siRNA序列或scramble序列為非融合表達。大鼠mTOR shRNA序列及相對應(yīng)的scramble序列參考已發(fā)表的文獻[7]。TUNEL染色試劑盒及Mito-Tracker Red CMXRos購自上海碧云天公司。

2.實驗方法：(1)實驗動物分組及模型構(gòu)建：共25只實驗大鼠除對隨機選出的對照組大鼠(5只)每日給予0.2ml大豆油頸背部皮下注射外，其余實驗動物均給予使用大豆油配制的6.0mg/100g DHEA，0.2ml頸背部皮下連續(xù)注射21天。按照本課題組已發(fā)表的PCOS大鼠模型評估方法隨機選取3只大鼠進行模型評估后，構(gòu)建模型成功的大鼠隨機分為模型組(n=5)、中藥治療組(n=6)及ShRNA注射組(n=6)[8]。(2)表達載體卵巢局部注射：實驗大鼠經(jīng)1%戊巴比妥麻醉，于背部開口暴露卵巢。使用微量進樣器抽取10μl病毒原液注射入卵巢包膜中：對照組、模型組及中藥治療組注射Lenti-GFP-mTOR shRNA scramble序列表達載體，shRNA干涉組注射Lenti-GFP-mTOR shRNA表達載體。(3)中藥治療：根據(jù)實驗動物藥物用量的換算公式，在卵巢局部注射慢病毒包被載體后，中藥治療組及shRNA干涉組給予每次1.5ml蒼附導(dǎo)痰湯濃縮藥物、對照組及模型組大鼠使用1.5ml 0.9%NaCl注射液每天灌胃2次，連續(xù)灌胃治療15天。(4)卵巢組織切片：實驗大鼠眶靜脈叢采血后斷頸處死，部分卵巢進行石蠟包埋并切片， HE染色觀察卵巢形態(tài)；其余卵巢組織冷凍切片后使用熒光顯微鏡觀察GFP表達情況。(5)排卵數(shù)統(tǒng)計：各組雌性大鼠，進行超數(shù)排卵后獲取的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體經(jīng)透明質(zhì)酸酶消化，統(tǒng)計卵細(xì)胞數(shù)量。(6)凋亡檢測：按照TUNEL染色試劑盒推薦步驟對卵巢組織切片進行染色后，觀察綠色熒光信號分布情況。(7)免疫熒光染色：分別使用兔抗大鼠mTOR一抗及羅丹明標(biāo)記二抗對卵巢組織切片中的mTOR蛋白進行熒光標(biāo)記，熒光顯微鏡下觀察卵巢組織mTOR因子的表達情況。(8)血清激素水平檢測：實驗大鼠眶靜脈叢取血后，靜置30min后2000r/min離心10min獲取血清。采用ELISA試劑盒按照推薦步驟對血清中睪酮(testosterone，T)、孕酮(progesterone，P)、雌二醇(estradiol，E2)進行檢測。(9)顆粒細(xì)胞線粒體活性及線粒體融合狀態(tài)檢測：獲取各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞進行體外培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，部分細(xì)胞更換含終濃度為50nmol/L的Mito-Tracker Red CMXRos培養(yǎng)基，37℃孵育30min后，觀察細(xì)胞內(nèi)590nm紅色熒光強度。其余顆粒細(xì)胞，固定后分別與兔抗大鼠TOM20一抗及FITC標(biāo)記山羊抗兔二抗雜交，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)線粒體聚集狀態(tài)。(10)實時定量熒光PCR：使用Trizol法抽提卵巢組織中的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶對mRNA進行反轉(zhuǎn)錄后，使用實時定量熒光PCR儀對目標(biāo)基因進行擴增。采用SYBR Green熒光染料定量試劑及2-ΔΔCT法計算目標(biāo)基因的相對表達水平，所檢測指標(biāo)的具體引物序列詳見表1。(11)蛋白印跡：使用RIPA裂解液卵巢組織，經(jīng)BCA法測定總蛋白濃度，按每組50μg總蛋白的標(biāo)準(zhǔn)進行SDS-PAGE凝膠電泳后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，經(jīng)脫脂奶粉封閉后采用相應(yīng)1∶1000稀釋后的一抗4℃孵育過夜，而后經(jīng)相應(yīng)1∶2000辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育1h后，加入ECL發(fā)光液，使用凝膠成像系統(tǒng)進行放射自顯影檢測。

表1 引物序列

3.統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，滿足正態(tài)分布的多組間差異采用單因素ANOVA分析中的Bonferroni或Dunnett′sT3進行校正，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.蒼附導(dǎo)痰湯對PCOS模型大鼠排卵功能及卵巢細(xì)胞活力的影響:模型組卵巢卵泡數(shù)較對照組增多。模型組單個視野下的平均卵泡數(shù)顯著高于對照組，但黃體數(shù)目顯著降低(圖1A)。中藥治療組單個視野內(nèi)的平均卵泡數(shù)較模型組有所下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。中藥治療組單個視野下的平均黃體數(shù)目較模型組顯著上升。超數(shù)排卵后，模型組大鼠獲卵數(shù)顯著低于對照組；中藥治療組獲卵數(shù)顯著高于模型組，shRNA注射組的獲卵數(shù)顯著低于中藥治療組(圖1B)。但在TUNEL染色的結(jié)果中并沒有發(fā)現(xiàn)各組TUNEL陽性細(xì)胞核的密度的明顯不同(圖2A)。

圖2 卵巢組織TUNEL染色結(jié)果(×200)

2.蒼附導(dǎo)痰湯對PCOS模型大鼠激素水平及甾體激素合成酶表達水平的影響:模型組大鼠的血清T水平顯著高于對照組，但P水平顯著降低。中藥治療組血清T水平顯著低于模型組，但P及E2的水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。shRNA注射組血清T水平較中藥治療組顯著上升(圖3A)。與對照組比較，HSD3β、CYP17a1及STAR的mRNA表達水平在模型組卵巢組織中顯著上升；與模型組比較，HSD3β、CYP17a1及STAR基因mRNA的表達水平在中藥治療組卵巢組織中顯著降低。而shRNA注射組卵巢組織CYP17a1的mRNA水平較中藥治療組顯著提高(圖3B)。

圖3 大鼠血清甾體激素水平及卵巢組織甾體激素合成酶表達水平

3.蒼附導(dǎo)痰湯對PCOS模型大鼠卵巢mTOR表達及顆粒細(xì)胞線粒體活性的影響:在各組大鼠卵巢組織的冷凍切片中都觀察到了GFP，慢病毒包被的載體在卵巢組織中能夠穩(wěn)定表達(圖4A)。模型組中mTOR因子的紅色熒光的強度明顯低于對照組，中藥治療組中mTOR信號強度較模型組顯著提高，shRNA注射組中mTOR的紅色熒光強度則較中藥治療組明顯降低 (圖4B)。代表線粒體活力的紅色熒光在模型組大鼠的顆粒細(xì)胞中與對照組比較明顯減弱。中藥治療組卵巢顆粒細(xì)胞的線粒體活性較模型組有所提高，但shRNA注射組的熒光強度較中藥治療組明顯減弱(圖4C)。

圖4 鼠卵巢組織免疫熒光染色及卵巢顆粒細(xì)胞活性線粒體檢測

4.蒼附導(dǎo)痰湯對線粒體動力學(xué)平衡相關(guān)因子表達及線粒體聚集狀態(tài)的影響:模型組卵巢組織中P110、AKT蛋白表達水平較對照組顯著降低，mTOR及Drp-1的蛋白表達水平也隨之降低；中藥治療組P110、AKT、mTOR、Drp-1蛋白表達水平較模型組均明顯上升。shRNA注射組P110、AKT蛋白的表達水平與中藥治療組差異不明顯，但Drp-1蛋白的表達水平明顯降低(圖5)。對照組大鼠顆粒細(xì)胞內(nèi)線粒體呈現(xiàn)連續(xù)的網(wǎng)狀分布，而模型組線粒體聚集程度增強；中藥治療組線粒體分布較模型組有趨向網(wǎng)狀態(tài)分布的趨勢，但shRNA注射組細(xì)胞內(nèi)的線粒體仍表現(xiàn)為聚集程度增強的分布狀態(tài)(圖6)。

圖5 卵巢組織關(guān)鍵因子蛋白表達

圖6 卵巢顆粒細(xì)胞TOM20免疫熒光染色(×1600)

討 論

1.蒼附導(dǎo)痰湯對PCOS模型大鼠卵巢功能的影響依賴于mTOR的表達:肥胖、月經(jīng)不調(diào)、稀發(fā)排卵與無排卵是PCOS患者臨床的典型特征[8]。本研究中，PCOS模型大鼠卵巢內(nèi)卵泡的密度較對照組顯著增加，但超數(shù)排卵后的獲卵數(shù)顯著降低，說明PCOS模型大鼠卵巢可能對促性腺激素的敏感度降低。蒼附導(dǎo)痰湯灌胃治療雖然沒有明顯改變PCOS模型大鼠的卵泡密度，但顯著增加了黃體密度，提示中藥治療很可能提高模型大鼠的排卵率。研究表明，蒼附導(dǎo)痰湯對PCOS模型大鼠AKT/mTOR通路具有調(diào)節(jié)作用[6]。而本研究中，蒼附導(dǎo)痰湯提高PCOS模型大鼠超排后排卵數(shù)的效果被mTOR基因的shRNA所抑制，說明中藥調(diào)節(jié)卵巢功能的藥效作用依賴于mTOR因子的表達。而mTOR的shRNA能夠抑制蒼附導(dǎo)痰湯對模型大鼠血清T水平及卵巢CYP17a1的mRNA表達的藥效作用，也說明mTOR在蒼附導(dǎo)痰湯調(diào)節(jié)卵巢雄激素分泌途徑中的關(guān)鍵作用。

2.蒼附導(dǎo)痰湯治療PCOS模型大鼠表型的藥效作用可能與線粒體功能的調(diào)節(jié)有關(guān):PCOS患者不僅具有生殖功能的異常，還往往伴隨有代謝功能的異常[9]。雖然PI3K、MAPK等經(jīng)典的胰島素代謝信號通路被證明與PCOS病因之間密切相關(guān)，但目前仍未找到代謝途徑異常導(dǎo)致PCOS的直接證據(jù)[10]。線粒體即是細(xì)胞合成能量物質(zhì)的場所也是參與甾體激素合成的細(xì)胞色素的主要分布場所，線粒體功能的異常很可能同時導(dǎo)致代謝的異常及甾體激素合成的紊亂[11]。mTOR是PI3K通路中受AKT磷酸化調(diào)控的細(xì)胞因子，并能通過提高線粒體分裂調(diào)控因子Drp-1的磷酸化促進線粒體的分裂[12]。研究表明，在PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞中mTOR的蛋白表達水平呈現(xiàn)降低的趨勢[13]。本研究中PCOS模型大鼠卵巢組織中mTOR蛋白的表達水平較對照組顯著下降，同時伴隨著線粒體總活力的降低。蒼附導(dǎo)痰湯治療能夠提升模型動物卵巢mTOR的表達水平及卵巢顆粒細(xì)胞中線粒體的活性，提示著在卵巢組織中，胰島素信號通路與線粒體功能之間存在著密切的聯(lián)系。而多個對胰島素增敏劑作用機制的研究也證實，線粒體功能的改善可能是某些胰島素增敏劑及代謝調(diào)節(jié)藥物發(fā)揮藥效作用的潛在機制[14,15]。

3.蒼附導(dǎo)痰湯的藥效機制可能與線粒體動力學(xué)平衡有關(guān)：在正常細(xì)胞中線粒體相互融合形成網(wǎng)狀或管狀結(jié)構(gòu)來發(fā)揮正常的功能[14]。PCOS患者顆粒細(xì)胞中線粒體的分布態(tài)勢也與正常人群存在著顯著差異，預(yù)示著PCOS患者卵巢細(xì)胞的線粒體動力學(xué)平衡已經(jīng)發(fā)生了改變[13]。線粒體分裂由細(xì)胞核編碼的Drp-1因子調(diào)控，是線粒體清除受損脂膜及突變mtDNA的重要機制[16]。本研究中，PCOS模型大鼠卵巢細(xì)胞中Drp-1的表達水平降低，且顆粒細(xì)胞中線粒體的集聚狀態(tài)與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示模型大鼠的線粒體動力學(xué)平衡可能發(fā)生了變化。而mTOR因子的shRNA抑制蒼附導(dǎo)痰湯提高線粒體分裂相關(guān)因子蛋白表達水平及改善顆粒細(xì)胞內(nèi)線粒體的異常集聚狀態(tài)的研究結(jié)果則表明，mTOR是蒼附導(dǎo)痰湯調(diào)節(jié)PCOS模型大鼠卵巢細(xì)胞線粒體分裂機制的關(guān)鍵因子，胰島素信號通路活性的變化很可能通過影響mTOR的活性進而對卵巢細(xì)胞的線粒體功能產(chǎn)生影響。

綜上所述，蒼附導(dǎo)痰湯對PCOS模型大鼠血清T水平異常及排卵功能異常有明確的治療作用，其藥效機制很可能與其對線粒體功能的調(diào)節(jié)有關(guān)。mTOR是蒼附導(dǎo)痰湯發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵因子。而mTOR既是胰島素信號通路PI3K的下游關(guān)鍵因子，也是調(diào)節(jié)線粒體分裂的重要因子，提示卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)線粒體活性及功能的變化很可能是連接細(xì)胞代謝與內(nèi)分泌功能變化的關(guān)鍵節(jié)點。而在PCOS患者體內(nèi)存在的代謝綜合征等異常病理表現(xiàn)是否會通過影響卵巢細(xì)胞線粒體功能，進而對生殖功能造成影響，還有待于開展深入研究。