張 楊 范崇盛 郭 潔 趙 丹 魏珍星

喉癌是最常見的頭頸部惡性腫瘤之一，喉癌的發(fā)生率在我國呈逐年上升趨勢[1]。盡管喉癌的整體治療水平近年來有所提高，然而其總體生存率較差[2]。喉癌的發(fā)生和發(fā)展是一個非常復(fù)雜的過程，闡明喉癌的發(fā)病機(jī)制和研發(fā)新的靶向治療已成為亟待解決的問題。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類新型的內(nèi)源性非編碼RNA，在真核細(xì)胞中高度表達(dá)[3]。lncRNA可以充當(dāng)miRNA海綿，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、黏附、分化、凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)行為[4]。針對不同的靶基因和腫瘤類型，lncRNA既可作為腫瘤抑制因子又可作為癌基因[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MIR34AHG與肺腺癌患者的生存期有關(guān)，其可作為腫瘤抑制因子參與肺腺癌的發(fā)生和進(jìn)展[6]。MIR34AHG在喉癌中表達(dá)和作用機(jī)制研究甚少，本研究旨在研究MIR34AHG在喉癌細(xì)胞系中的表達(dá)，探討MIR34AHG影響喉癌細(xì)胞增殖和遷移的分子機(jī)制。

材料與方法

1.細(xì)胞系和主要試劑:支氣管上皮細(xì)胞系(16HBE)和喉癌細(xì)胞系(TU686、Hep-2、TU177、AMC-NH-8、TU212)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自美國Roche公司。陰性對照質(zhì)粒、MIR34AHG過表達(dá)質(zhì)粒、MIR34AHG野生型報告基因載體(WT)、突變型報告基因載體(MUT)、miR-296-5p mimics、miR-NC購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒購自美國Sigma公司。SRCIN1、GAPDH、Wnt1、β-catenin、MMP-9蛋白抗體購自美國CST公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:所有細(xì)胞均用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，均置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。取對數(shù)期的TU686細(xì)胞，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書將50ng陰性對照質(zhì)粒和MIR34AHG過表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至TU686細(xì)胞，分為對照組和MIR34AHG組。48h后進(jìn)行后續(xù)實驗。

3.qPCR檢測MIR34AHG、miR-296-5p和SRCIN1 mRNA表達(dá):用Trizol試劑提取細(xì)胞樣本總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。U6作為內(nèi)參檢測miR-296-5p的表達(dá)，GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量，qPCR引物序列詳見表1。

表1 qPCR引物序列

4.MTT法檢測MIR34AHG表達(dá)對TU686細(xì)胞增殖的影響:將兩組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TU686細(xì)胞鋪至96孔板，培養(yǎng)1、2、3、4、5天時，將10μl MTT溶液添加至每孔，孵育4h，吸去上清，將100μl DMSO溶液添加至每孔，搖床振蕩15min，使用自動酶標(biāo)儀檢測450nm波長處各孔的吸光度(A)值。

5.細(xì)胞劃痕實驗檢測MIR34AHG表達(dá)對TU686細(xì)胞遷移的影響:將兩組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TU686細(xì)胞鋪至24孔板，用移液槍槍頭在孔底劃痕。用PBS溶液洗3次，添加無血清培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。于0和24h取樣，在倒置顯微鏡下拍照、測量劃痕寬度。

6.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CMIR34AHG與靶基因之間的靶向關(guān)系:通過starBase v2.0數(shù)據(jù)庫分析MIR34AHG的靶基因可能是miR-296-5p，miR-296-5p的靶基因可能是SRCIN1。分別將MIR34AHG-WT、MIR34AHG-MUT與miR-296-5p mimics或miR-NC共轉(zhuǎn)染至TU686細(xì)胞中。48h后，采用雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測TU686細(xì)胞的熒光素酶活性。

7.Western blot法檢測SRCIN1蛋白表達(dá):用RIPA裂解液裂解并提取兩組TU686細(xì)胞總蛋白，蛋白高溫變性后上樣，進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳和硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉，加入一抗在4℃孵育過夜。加入二抗山羊抗兔IgG抗體(1∶5000稀釋)，室溫孵育2h，用凝膠成像系統(tǒng)曝光、顯影。

結(jié) 果

1.MIR34AHG在支氣管上皮細(xì)胞和喉癌細(xì)胞系的表達(dá):qPCR檢測結(jié)果顯示，與16HBE細(xì)胞比較，在5種喉癌細(xì)胞系中均觀察到MIR34AHG低表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，其中，TU686細(xì)胞中MIR34AHG表達(dá)最低(P<0.01)，故選擇TU686細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗(圖1)。

圖1 MIR34AHG在支氣管上皮細(xì)胞和喉癌細(xì)胞系中的表達(dá)與16HBE細(xì)胞比較，*P<0.01

2.轉(zhuǎn)染MIR34AHG過表達(dá)質(zhì)粒明顯促進(jìn)MIR34AHG的表達(dá):qPCR檢測結(jié)果顯示，對照組和MIR34AHG組TU686細(xì)胞中MIR34AHG表達(dá)量分別為1.15±0.32和13.31±1.47(P<0.01)，表明成功構(gòu)建MIR34AHG過表達(dá)細(xì)胞系。

3.過表達(dá)MIR34AHG可抑制TU686細(xì)胞的增殖:MTT檢測結(jié)果顯示，與對照組比較， MIR34AHG組TU686細(xì)胞增殖從第2天開始明顯降低(P<0.05或P<0.01)，表明過表達(dá)MIR34AHG可抑制TU686細(xì)胞的增殖(圖2)。

圖2 過表達(dá)MIR34AHG對喉癌細(xì)胞TU686增殖的影響與MIR34AHG組比較，*P<0.05，**P<0.01

4.過表達(dá)MIR34AHG可抑制TU686細(xì)胞的遷移:細(xì)胞劃痕實驗檢測結(jié)果顯示，對照組和MIR34AHG組TU686細(xì)胞遷移率分別為62.98%±3.21%和34.57%±6.64%(P<0.01)，表明過表達(dá)MIR34AHG可抑制TU686細(xì)胞的遷移能力(圖3)。

圖3 過表達(dá)MIR34AHG對喉癌細(xì)胞TU686遷移的影響

5.MIR34AHG與靶基因之間的靶向關(guān)系:生物信息學(xué)工具(圖4)顯示，miR-296-5p可能是MIR34AHG的候選目標(biāo)，miR-296-5p的靶基因可能是SRCIN1。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測結(jié)果表明，與miR-NC比較，miR-296-5p mimics顯著抑制了攜帶MIR34AHG-WT的熒光素酶活性(P<0.01，圖5)。

圖4 生物信息學(xué)工具預(yù)測MIR34AHG的靶基因

圖5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CMIR34AHG與靶基因的結(jié)合

6.過表達(dá)MIR34AHG可調(diào)控miR-296-5p、SRCIN1 mRNA的表達(dá):對照組和MIR34AHG組TU686細(xì)胞中miR-296-5p相對表達(dá)量分別為1.05±0.19和0.31±0.06，MIR34AHG負(fù)調(diào)控miR-296-5p的表達(dá)(P<0.01)。對照組和MIR34AHG組TU686細(xì)胞中SRCIN1 mRNA表達(dá)量分別為1.03±0.14和5.44±0.56，MIR34AHG正調(diào)控SRCIN1 mRNA的表達(dá)(P<0.01)。

7.過表達(dá)MIR34AHG對SRCIN1蛋白及Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達(dá)的影響:Western blot法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，轉(zhuǎn)染MIR34AHG后，SRCIN1蛋白表達(dá)增加，Wnt/β-catenin信號通路蛋白Wnt1、β-catenin、MMP-9表達(dá)降低(圖6)。

討 論

lncRNA是由超過200個核苷酸構(gòu)成的單鏈RNA，由于缺乏開放閱讀區(qū)，不具有編碼蛋白的功能[7]。lncRNA可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種生物學(xué)功能，在疾病的發(fā)展、轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用[8]。越來越多的研究顯示，喉癌細(xì)胞中存在大量lncRNA的異常表達(dá)，lncRNA有可能作為喉癌新型的生物學(xué)標(biāo)志物或治療靶點[9]。Huang等[10]研究表明，喉癌組織中l(wèi)ncRNA-ATB的表達(dá)明顯增強(qiáng)，其與患者的臨床分期，高表達(dá)lncRNA-ATB的患者總生存率明顯低于低表達(dá)患者。Zheng等[11]研究表明，喉癌組織中的LINC00152表達(dá)水平顯著高于鄰近正常組織，敲低LINC00152敲低顯著抑制了喉癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，miR-613是LINC00152的靶基因。研究發(fā)現(xiàn)，MIR34AHG由4211個核苷酸組成，其在肺腺癌中呈低表達(dá)，MIR34AHG表達(dá)較高的患者總體生存期較長，MIR34AHG可作為肺腺癌患者的獨立預(yù)后因素[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，在喉癌細(xì)胞系中MIR34AHG表達(dá)顯著低于人支氣管上皮細(xì)胞，MIR34AHG可能參與喉癌的發(fā)生、發(fā)展。通過構(gòu)建MIR34AHG過表達(dá)細(xì)胞系，過表達(dá)MIR34AHG可顯著抑制TU686細(xì)胞的增殖和遷移能力，MIR34AHG在喉癌細(xì)胞中具有抑癌作用。

lncRNA通過海綿作用以不完全配對方式結(jié)合miRNA，抑制miRNA的表達(dá)[12]。本研究借助生物信息學(xué)工具預(yù)測MIR34AHG與miR-296-5p存在結(jié)合位點，雙熒光素酶報告基因檢測進(jìn)一步證實了MIR34AHG與miR-296-5p的靶向關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，miR-296-5p在喉癌組織中表達(dá)增加，miR-296-5p高表達(dá)與喉癌放療抵抗和復(fù)發(fā)呈正相關(guān)，miR-296-5p可能成為喉癌預(yù)后不良的指標(biāo)[13]。本研究顯示，過表達(dá)MIR34AHG后TU686細(xì)胞中miR-296-5p表達(dá)降低，提示MIR34AHG直接靶向負(fù)調(diào)控miR-296-5p的表達(dá)。miRNA主要在轉(zhuǎn)錄后水平互補(bǔ)結(jié)合靶基因mRNA，抑制靶基因的表達(dá)[14]。本研究借助生物信息學(xué)工具預(yù)測miR-296-5p與SRCIN1 mRNA存在結(jié)合位點。SRC激酶信號抑制劑1(SRCIN1)基因定位于染色體17q21.1，SRCIN1蛋白由兩個高電荷氨基酸區(qū)域、兩個富含脯氨酸的區(qū)域及兩個螺旋結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[15]。SRCIN1在多種腫瘤如胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌中呈現(xiàn)低表達(dá)，在腫瘤中起著抑癌基因作用[16]。Wnt/β-catenin信號通路在喉癌細(xì)胞中被異常激活，加速喉癌細(xì)胞惡性發(fā)展[17]。SRCIN1蛋白可拮抗Wnt/β-catenin信號通路活性，抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展[18]。本研究顯示，MIR34AHG下調(diào)miR-296-5p表達(dá)后，SRCIN1基因表達(dá)明顯增加，Wnt/β-catenin信號通路被抑制。

綜上所述，MIR34AHG在喉癌細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)MIR34AHG通過miR-296-5p/SRCIN1軸，拮抗Wnt/β-catenin信號通路，抑制喉癌細(xì)胞的增殖和遷移，MIR34AHG可能是喉癌治療潛在的靶點。