秦 晗 龔永慶 徐宏志

牙齒萌出需要多種細(xì)胞因子通過多條信號通路協(xié)同調(diào)節(jié)，共同維持成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞間動態(tài)平衡，從而保證萌出通道的正常形成[1]。TGF-β1是由成骨細(xì)胞產(chǎn)生的，目前被認(rèn)為是最為復(fù)雜和多樣化的生長因子之一，然而，其與成骨細(xì)胞相互作用的機(jī)制尚不清楚[2]。NF-κB信號通路是調(diào)節(jié)骨代謝的重要途徑，它通過調(diào)節(jié)成骨-破骨細(xì)胞分化信號和骨基質(zhì)的形成，在牙齒萌出通道形成過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[3]。自噬是一種保守的細(xì)胞自我降解方式，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中具有重要意義[4，5]。

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，阻斷 NF-κB信號通路后，成骨細(xì)胞的自噬功能降低，提示NF-κB信號通路和自噬間呈正相關(guān)[6]。那么作為成骨細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)因子，TGF-β1與NF-κB信號通路和自噬之間存在怎樣的關(guān)系，能否通過對其相關(guān)性的探討為牙齒萌出通道形成機(jī)制研究提供新的實驗依據(jù)是本項目的研究重點。本研究對體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的分組，分別觀察不同濃度的TGF-β1對成骨細(xì)胞自噬功能的影響，以及SN50阻斷NF-κB信號通路后，再次加入的TGF-β1對成骨細(xì)胞自噬因子表達(dá)的影響，以期揭示TGF-β1、NF-κB信號通路和自噬在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能中相互作用，進(jìn)而為牙齒萌出過程中分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)機(jī)制的研究提供新的理論和實驗依據(jù)。

材料與方法

1.成骨細(xì)胞培養(yǎng)和分組:從液氮罐中取出小鼠成骨細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，復(fù)蘇后吸去凍存液上清，加入新鮮培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜態(tài)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期時，用胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液，并以2×104/cm2密度接種到已加入消毒蓋玻片的培養(yǎng)板中。分別加入NF-κB信號通路阻斷劑SN50(美國Senta Cruz公司)和人重組TGF-β1蛋白(英國Abcam公司)。按照加入NF-κB信號通路阻斷劑SN50和TGF-β1濃度不同，將成骨細(xì)胞分為以下12組:①NC組：無SN50+無TGF-β1;②KD1組:無SN50+TGF-β1(0.01ng/ml);③KD2組:無SN50+TGF-β1(100ng/ml)； ④KD3組: SN50(6.25μg/ml)+無TGF-β1;⑤KD4組:SN50 (6.25μg/ml)+TGF-β1(0.01ng/ml); ⑥KD5組: SN50 (6.25μg/ml)+TGF-β1(100ng/ml);⑦KD6組:SN50 (12.25μg/ml)+無TGF-β1; ⑧KD7組: SN50 (12.25μg/ml)+TGF-β1 (0.01ng/ml)；⑨KD8組: SN50 (12.25μg/ml)+TGF-β1 (100ng/ml)； ⑩KD9組: SN50 (25μg/ml)+無 TGF-β1;KD10組: SN50 (25μg/ml)+TGF-β1 (0.01ng/ml)；KD11組: SN50 (25μg/ml)+TGF-β1 (100ng/ml)，加入藥物后繼續(xù)培養(yǎng)24h。

2.MDC法檢測自噬小體:將貼壁培養(yǎng)的成骨細(xì)胞于培養(yǎng)板內(nèi)爬片至所需要的匯合度，棄去培養(yǎng)液，加入300μl 1×Wash Buffer清洗2次。MDC染色試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)有限公司，KGATG001)。按照1×Wash Buffer∶MDC染色液體積比=9∶1的比例進(jìn)行染色液稀釋，計算一次實驗所需要的染色液體積，配制MDC染色工作液，輕輕混勻。而后每孔加入100μl MDC染色工作液，室溫避光染色20～30min后，棄去染色液，以1×Wash Buffer，300μl清洗3次，再以100μl收集緩沖液覆蓋蓋玻片，使用激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光顆粒形成和分布情況, 400倍高倍鏡下計數(shù)1000個細(xì)胞，計算綠色熒光顆粒細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比，而后進(jìn)行拍照。

3.Simple Western assays 檢測LC3a表達(dá):從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，PBS洗滌2次加入適量的RIPA裂解液，于冰上裂解1h。使用移液槍頭吹打至細(xì)胞充分裂解后將細(xì)胞裂解樣品轉(zhuǎn)入EP管中， 4℃，12000×g，離心 5min后放入沸水浴 10min。而后4℃，12000×g，離心1min，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肳ES全自動蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng)(美國ProteinSimple公司，WS-2471)檢測待測樣本中目的基因的蛋白表達(dá)量。選用Wes12-230kDa 試劑盒(美國ProteinSimple公司，#77960)，將上機(jī)前稀釋的抗體及其他試劑和稀釋變性后的蛋白樣本按設(shè)定程序加入板中。一抗使用兔抗 MAP1 LC3a (英國Abcam公司，ab52628,1∶30,16kDa)，內(nèi)參使用鼠抗β-actin (美國Santa Cruz公司，sc-69879,1∶20,49kDa)，二抗分別使用抗鼠IgG抗體(美國ProteinSimple公司，PS-MK15,1∶1000) 和抗兔IgG抗體(美國ProteinSimple公司，PS-MK 15,1∶1000)。抗體封閉15min，一抗、二抗各孵育30min。使用WES 全自動蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng)的Compass軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行灰度分析，制作實驗報告。

4.統(tǒng)計學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗組和對照組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.MDC染色結(jié)果:實驗結(jié)果顯示,NC組成骨細(xì)胞內(nèi)可見少許點狀綠色熒光顆粒，KD1、KD2、KD3、KD4、KD5、KD6和KD7 組中成骨細(xì)胞胞質(zhì)和細(xì)胞突起內(nèi)均可見大量點狀綠色熒光顆粒。但在KD8、KD9、KD10和KD11組中成骨細(xì)胞內(nèi)點狀綠色熒光顆粒明顯減少(圖1)。

圖1 MDC法檢測自噬小體形成，綠色熒光顆粒為陽性表達(dá)(×400)

2.MDC染色結(jié)果:400倍高倍鏡下計數(shù)1000個細(xì)胞，計算各組中點狀綠色熒光顆粒細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果提示KD1、KD2、KD3、KD4、KD5、KD6和KD7 組綠色熒光顆粒細(xì)胞數(shù)所占總細(xì)胞數(shù)比例多于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。KD8、KD9、KD10和KD11組中綠色熒光顆粒細(xì)胞數(shù)所占總細(xì)胞數(shù)比例少于NC 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖2 MDC染色結(jié)果統(tǒng)計學(xué)分析與NC組比較，*P<0.05

3.Simple Western assays結(jié)果：LC3a蛋白檢測實驗結(jié)果顯示KD1、KD2、KD3、KD4、KD5、KD6和KD7 組中 LC3a蛋白表達(dá)明顯高于NC組。但是KD8、KD9、KD10和KD11組中LC3a蛋白表達(dá)明顯低于NC組(圖3)。

圖3 Simple Western assays法檢測LC3a蛋白表達(dá)

4.Simple Western assays結(jié)果：使用Compass軟件對各組LC3a蛋白檢測結(jié)果進(jìn)行灰度分析,分析數(shù)據(jù)顯示，KD1、KD2、KD3、KD4、KD5、KD6和KD7 組中MAP1 LC3a/β-actin密度比數(shù)值大于NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。KD8、KD9、KD10和KD11組中MAP1 LC3a/β-actin密度比數(shù)值小于NC組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

圖4 Simple Western assays法檢測LC3a蛋白表達(dá)與NC組比較，*P<0.05

討 論

牙齒萌出通道的正常形成需要成骨-破骨細(xì)胞間維持動態(tài)平衡，這種平衡受到局部骨微環(huán)境中各種細(xì)胞生長因子的調(diào)節(jié)[7，8]。TGF-β1是迄今為止已知的最為復(fù)雜和最為多樣的生長因子，它可以通過作用于成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)骨代謝，在牙齒萌出通道形成的骨動態(tài)平衡過程中發(fā)揮重要作用[9]。自噬是細(xì)胞自我保護(hù)的重要機(jī)制，在維持細(xì)胞存活和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面具有重要意義[10，11]。有研究表明，自噬基因在牙齒發(fā)育不同階段均有表達(dá)，提示自噬與牙齒發(fā)生發(fā)育和萌出密切相關(guān)[12]。TGF-β1與自噬間關(guān)系在不同細(xì)胞中呈現(xiàn)不同形式，但在成骨中存在怎樣的關(guān)系尚不明確[13]。

本研究分別通過檢測自噬小體形成和自噬蛋白的表達(dá)觀察TGF-β1和自噬間可能存在的相關(guān)性。MDC法檢測自噬小體的形成，結(jié)果顯示，NC組成骨細(xì)胞中可見點狀綠色熒光顆粒，KD1、KD2、KD3、KD4、KD5、KD6和KD7組中可見大量綠色熒光顆粒，與NC組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Simple Western assays法檢測LC3a蛋白表達(dá)，結(jié)果表明KD1、KD2、KD3、KD4、KD5、KD6和KD7組 LC3a蛋白表達(dá)明顯高于NC組。以上結(jié)果提示: ①成骨細(xì)胞本身具有較強(qiáng)的自噬能力；②TGF-β1能顯著增強(qiáng)成骨細(xì)胞的自噬功能；③TGF-β1對成骨細(xì)胞自噬功能的影響可能與其濃度無關(guān)。有研究表明，TGF-β1對成骨細(xì)胞既有激活作用又有抑制作用，這種差異可能與TGF-β1的局部濃度、作用時間和靶細(xì)胞的分化階段有關(guān)[14, 15]。本研究結(jié)果顯示，與NC組比較，TGF-β1可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的自噬功能，但是濃度的進(jìn)一步增加并不會提高成骨細(xì)胞的自噬水平，這為轉(zhuǎn)化生長因子生物學(xué)功能研究提供新的實驗依據(jù)。

TGF-β1作為骨組織局部微環(huán)境的重要調(diào)節(jié)因子，如何調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能來維持骨骼的動態(tài)平衡一直是研究的熱點[16，17]。通過對小鼠成骨細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可以通過增加OPG和降低RANKL表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞的形成和減少骨吸收[18]。NF-κB信號通路是維持成骨和破骨細(xì)胞動態(tài)平衡的重要通路，其通過調(diào)節(jié) RANK/RANKL 表達(dá)，控制成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化相關(guān)信號的表達(dá)，影響牙齒萌出通道的形成，在牙齒萌出過程中起著關(guān)鍵作用[19，20]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NF-κB信號通路被阻斷時，成骨細(xì)胞自噬功能下降，提示成骨細(xì)胞可能通過NF-κB信號通路調(diào)節(jié)其自噬功能[6]。

根據(jù)前期成熟的實驗條件，分別使用濃度為6.25、12.5和25μg/ml的SN50阻斷NF-κB信號通路，而后進(jìn)行功能檢測。結(jié)果表明，濃度為25μg/ml的SN50(KD9組)與NC組比較，成骨細(xì)胞中綠色熒光顆粒細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。Simple Western assays分析結(jié)果顯示，KD9組LC3a蛋白的表達(dá)較NC組明顯降低，提示濃度為25μg/ml的 SN50可以成功阻斷成骨細(xì)胞 NF-κB信號通路，并且當(dāng)NF-κB通路被阻斷后成骨細(xì)胞自噬功能受到抑制。為了進(jìn)一步探討TGF-β1、NF-κB信號通路和自噬三者之間關(guān)系，筆者在阻斷NF-κB信號通路的成骨細(xì)胞中再次加入不同濃度的TGF-β1 (KD10、KD11組)，再次觀察自噬小體的形成和自噬相關(guān)因子LC3a蛋白的表達(dá)。KD10和 KD11組綠色熒光顆粒細(xì)胞數(shù)明顯少于NC 組。Simple Western assays分析結(jié)果顯示，KD10組和 KD11組LC3a蛋白的表達(dá)明顯低于NC組，提示當(dāng)NF-κB通路被阻斷時，再次加入的TGF-β1不能上調(diào)成骨細(xì)胞的自噬水平，即TGF-β1可能介導(dǎo)NF-κB 信號通路影響成骨細(xì)胞的自噬功能。

牙齒萌出通道骨動態(tài)平衡機(jī)制的深入探討將為牙齒萌出障礙的診治提供有效理論基礎(chǔ)。TGF-β1、NF-κB信號通路和自噬均與成骨細(xì)胞生物學(xué)性能密切相關(guān)，本研究初步探討了三者在成骨細(xì)胞分化中的可能調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步了解牙齒萌出通道形成中骨動態(tài)平衡調(diào)節(jié)提供一定的理論和實驗依據(jù)。由于實驗條件的限制，本研究并沒有完全闡明 TGF-β1、NF-κB信號通路和自噬之間的關(guān)系，通過增加實驗指標(biāo)和動物模型來進(jìn)一步探討三者之間的相關(guān)性，是今后研究的重點。