戚少云，黃 杰，王 璐，黃新明

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種臨床上常見(jiàn)的引起嚴(yán)重甚至致死性感染的病原菌。隨著抗菌藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的醫(yī)院感染越來(lái)越嚴(yán)重。碳青霉烯類抗菌藥物是治療鮑曼不動(dòng)桿菌的主要藥物[1]，但是隨著該類抗菌藥物在臨床上的大量應(yīng)用，耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌(CRAB)的產(chǎn)生不可避免。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)是通過(guò)分析細(xì)菌蛋白質(zhì)表達(dá)譜中的特征譜峰來(lái)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定及分型，與脈沖場(chǎng)凝膠電泳結(jié)果之間具有很好的相關(guān)性[2-3]。其優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、通量高、能耐受一定的雜質(zhì)等[4]，隨著質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)及操作規(guī)程不斷完善和規(guī)范化，MALDI-TOF MS將成為臨床微生物鑒定的重要工具，可以及時(shí)將疑似的醫(yī)院感染暴發(fā)預(yù)警信息反饋至臨床科室及相關(guān)部門(mén)[5]，指導(dǎo)感控措施的有效改進(jìn)。本研究對(duì)CRAB耐藥性進(jìn)行研究，同時(shí)用MALDI-TOF MS對(duì)分離的CRAB進(jìn)行同源性分析?，F(xiàn)作報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 菌株 收集我院ICU病房2017年4-10月住院病人送檢標(biāo)本中分離得到的CRAB，共30株。30株菌株分離自28例病人送檢標(biāo)本中，其中男22例，女6例；≥60歲25例，<60歲3例，年齡(68.86±13.32)歲；標(biāo)本來(lái)源：痰液26株，血液3株，膽汁1株。所有菌株均為連續(xù)分離的非重復(fù)菌株，同一病人同一部位只取第一次分離株。質(zhì)控菌株為鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC 19606，大腸埃希菌ATCC 8739，系安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科惠贈(zèng)。

1.2 主要儀器 VITEK-2 COMPACT全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析儀、VITEK MS質(zhì)譜儀(法國(guó)生物梅里埃公司)。

1.3 藥敏試驗(yàn) 采用瓊脂稀釋法測(cè)定常用抗菌藥物對(duì)菌株的最低抑菌濃度(MIC)。試驗(yàn)操作及折點(diǎn)判斷依據(jù)2017年美國(guó)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，分析藥敏試驗(yàn)結(jié)果。所用抗菌藥物包括頭孢替坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、妥布霉素、慶大霉素、氨芐西林/舒巴坦、復(fù)方新諾明、左氧氟沙星等。

1.4 同源性分析 用1 μL一次性定量接種環(huán)挑取生長(zhǎng)24 h的新鮮單個(gè)純菌落，均勻涂抹在靶板上，待菌膜干燥時(shí)加1 μL α-腈基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)液，干燥后使用VITEK MS科研庫(kù)進(jìn)行鑒定及聚類分析。每個(gè)菌株靶板在不同位置被激光點(diǎn)擊160次，獲得其蛋白質(zhì)峰圖。將細(xì)菌相對(duì)分子質(zhì)量2 000～20 000的蛋白質(zhì)峰圖與數(shù)據(jù)庫(kù)里參考圖譜比較并進(jìn)行多種算法計(jì)算，給出鑒定結(jié)果?？尚潘皆?0.0%～99.9%的為可接受結(jié)果。通過(guò)對(duì)細(xì)菌核糖體蛋白峰譜圖進(jìn)行數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)，在MALDI Biotyper 3軟件中繪制發(fā)育樹(shù)進(jìn)行聚類分析，分析菌株之間的同源性。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 30株CRAB對(duì)頭孢替坦、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星耐藥率為100.0%，對(duì)左氧氟沙星耐藥率為73.3%(見(jiàn)表1)。

表1 30株CRAB的藥敏試驗(yàn)結(jié)果[n；百分率(%)]

2.2 MALDI-TOF MS同源性分析結(jié)果 依據(jù)相似度80%～100%為同一型別的分類方法，將30株CRAB分為三大簇：Ⅰ型(28株)、Ⅱ型(1株)、Ⅲ型(1株)，其中Ⅰ型分為Ⅰa型(26株)、Ⅰb型(1株)、Ⅰc型(1株)(見(jiàn)圖1)。

2.3 流行情況 我院 ICU 病房共設(shè)床位30張，分設(shè)于同一樓層的東、西兩個(gè)區(qū)域。其中西區(qū)21張、東區(qū)9張。2017年4-10月，我院 ICU 病房分離的CRAB主要流行株為Ia型(26株)，其中西區(qū)分離出19株，東區(qū)分離出7株。有2例病人的痰液和血液標(biāo)本均檢出Ⅰ a型菌株。2017年8月2-30日分離的Ⅰa型高達(dá)12株，提示當(dāng)月ICU病房存在Ⅰa 型CRAB感染的聚集趨向。菌株分布詳細(xì)信息見(jiàn)表2。

表2 30株CRAB菌株的基本信息

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種常見(jiàn)的條件致病菌，廣泛存在于自然界、醫(yī)院環(huán)境中，常在人體的皮膚、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中定植[6]。在病人免疫功能下降、使用廣譜抗生素和保留侵入性操作時(shí)顯示其致病性，感染的高?？剖液统Ｒ?jiàn)部位通常以ICU病房及下呼吸道為主。近年來(lái)國(guó)內(nèi)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明，鮑曼不動(dòng)桿菌的檢出率已超越銅綠假單胞菌，在醫(yī)院感染致病菌中排名前三位[7]。鮑曼不動(dòng)桿菌可對(duì)多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥基因且感染后病死率達(dá)7.8%～75.0%[8-9]，病人一旦感染鮑曼不動(dòng)桿菌，不僅會(huì)延長(zhǎng)住院時(shí)間，增加住院費(fèi)用，嚴(yán)重可危及生命安全。碳青霉烯類藥物是治療鮑曼不動(dòng)桿菌的常用抗生素，然而由于臨床抗生素的濫用，導(dǎo)致CRAB數(shù)量逐年增高。根據(jù)調(diào)查顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥率全國(guó)平均水平為56.1%[10]，耐藥形勢(shì)十分嚴(yán)峻。因此，及時(shí)對(duì)感染病人分離的菌株進(jìn)行同源性分析，對(duì)控制鮑曼不動(dòng)桿菌的院內(nèi)傳播有很大的幫助。

本研究分離的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)頭孢替坦、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟等頭孢菌素類抗菌藥物以及喹諾酮類藥物如環(huán)丙沙星的耐藥率最為明顯，達(dá)到100%，提示這些藥物在臨床使用中應(yīng)加以限制。對(duì)氨基糖苷類抗菌藥物如妥布霉素和慶大霉素以及一些其他種類的抗生素耐藥率均在70%以上，治療效果也很有限。

本研究使用MALD-TOF MS將2017年4-10月ICU 病人分離出的30株CRAB鑒定為3個(gè)型別，Ⅱ型和Ⅲ型各1株，其余28株均為Ⅰ型，其中Ia型高達(dá)26株。追蹤臨床資料發(fā)現(xiàn)首次分離出Ⅰ a型菌株為2017年4月3號(hào)，該病人因肺部感染、呼吸衰竭于2017年3月28日入院，病人痰培養(yǎng)中檢出Ⅰa 型CRAB。在首次分離后，又陸續(xù)檢出同樣型別的菌株。感染病人多為免疫功能低下的高齡病人(60歲以上病人占比89.3%)，并且所有的病人均存在氣管插管、泌尿道插管等侵襲性操作。菌株分離的病人床位多集中于該院ICU病房的西區(qū)(占比70%)，分析可能原因?yàn)闁|區(qū)病房屬后期增設(shè)，相比西區(qū)，床位數(shù)少，床間距大，發(fā)生交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低。

CRAB的臨床治療預(yù)后不良，迫切需要有效的措施以減少細(xì)菌在病人之間的傳播。物體表面污染與CRAB流行和暴發(fā)有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性[11]，今后將加強(qiáng)對(duì)隔簾、床欄、床旁桌、呼吸機(jī)面板、監(jiān)護(hù)儀面板、輸液泵等高頻接觸的病人周圍環(huán)境的清潔消毒[12]，借助熒光標(biāo)記或ATP等工具審核清潔衛(wèi)生質(zhì)量，以保障清潔消毒措施的有效落實(shí)。醫(yī)務(wù)人員的手也可能成為CRAB的傳播媒介[13]，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)手衛(wèi)生行為監(jiān)管力度，提高依從率，有效切斷病原菌的院內(nèi)傳播途徑。今后還應(yīng)增加感染病人的周圍環(huán)境采樣監(jiān)測(cè)范圍和頻次，一旦檢出CRAB，及時(shí)與病人感染部位檢出的CRAB進(jìn)行同源性檢測(cè)分析，進(jìn)一步完善全院CRAB流行病學(xué)資料，闡明CRAB傳播擴(kuò)散的具體途徑，為臨床改進(jìn)CRAB防控措施提供更多的參考依據(jù)。