郭 帥，褚小磊，沈 桐，李 季，王浩淼，朱毛妮，朱盼盼，陳一航，呂樵嵐，胡玲莉，田亞蘭，王元元，陳傳好

類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是由免疫、內分泌、感染、遺傳、環(huán)境等多因素參與的全身性自身免疫性疾病，以關節(jié)滑膜炎癥為特征，具有持久、反復發(fā)作的特性，通常引起關節(jié)軟骨及骨質的破壞，最終導致關節(jié)畸形及功能障礙[1-2]。目前對于RA的病因與病理機制尚未確切明了，也無特效治療手段。在研究RA的過程中，需要有效的RA動物模型[3-4]，動物模型是研究該疾病的致病機制且用于藥物新療法測試的研究工具[5-6]。目前，已經建立了關節(jié)炎模型,包括CIA、佐劑性關節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)、降植烷誘導的關節(jié)炎(pristane-induced arthritis，PIA)等[4,7]。但制備RA模型的方法，尚缺乏相對統一的標準。在研究RA時，常選擇不完全弗氏佐劑(incomplete Freund′s adjuvant，IFA)和完全弗氏佐劑(complete Freund′s adjuvant，CFA)分別與牛Ⅱ型膠原蛋白(calf Ⅱ collagen，CⅡ)混合乳化，制備膠原誘導性關節(jié)炎(CIA)模型[8-10]。兩種方案在制備RA模型時，對關節(jié)的滑膜層、關節(jié)軟骨的影響程度是否有差異，目前尚未見報道。本研究采用兩種方案制備CIA模型，比較兩種造模方案對關節(jié)損害的程度。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠30只[8周齡，雌性，SPF級，體質量(200±30)g]購買于蚌埠醫(yī)學院實驗動物中心。所有大鼠于同一環(huán)境(25 ℃)給予自由飲食。

1.2 主要試劑 CⅡ(Chondrex 20022)；CFA(Chondrex 7001)；IFA(Chondrex 7002)；均為10 mg。

1.3 建立RA關節(jié)炎模型 將30只大鼠隨機分為3組：0.9%氯化鈉溶液組(對照組)，IFA+CⅡ模型組，CFA+CⅡ模型組，每組10只。將CFA/IFA與CⅡ型膠原，以等體積在4 ℃(冰浴)無菌條件下混勻乳化；配制成質量濃度為1 mg/mL的乳液。從大鼠尾根部開始，在多個位置，分少量多次皮內注射混懸乳液200 μL；于初次免疫后7 d注射100 μL，以加強免疫。對照組在相同時間點注射等量的0.9%氯化鈉溶液。

1.4 關節(jié)炎評分 在初次免疫后第7、14、21天，參照David D Brand關節(jié)炎指數(AI)評價標準[8]，對3組大鼠AI進行評價并記錄分值(見表1)。對每肢足趾單獨評分，將四肢評分相加作為關節(jié)炎評分，每只大鼠最高為16分。由3名實驗者完成，以平均值作為AI評分。AI總分≥4分判定為造模成功。

表1AI評分標準

1.5 大鼠踝關節(jié)獲取 在造模后第14天，每組取出5只大鼠麻醉處死，獲取踝關節(jié)，并使用10%甲醛固定，用于HE染色。

1.6 HE染色 踝關節(jié)在甲醛中固定14 d→ HNO3(10%)脫鈣48 h→流水沖洗過夜→乙醇逐級脫水→二甲苯透明→石蠟包埋、切片→常規(guī)HE染色。在光鏡下觀測RA模型大鼠踝關節(jié)的病理學變化。

1.7 統計學方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 一般情況觀察 造模后，大鼠雙后肢足爪第9天未見明顯改變，第10天出現急性腫脹，呈對稱性，第14天明顯不能負重，直至實驗結束。與對照組相比，模型組大鼠飲食減少；毛發(fā)光澤度下降，干枯容易脫落；精神狀態(tài)欠佳，活動減少且行動遲緩。另外，對照組尾巴注射部位無點狀感染，毛發(fā)正常。模型組在注射部位有點狀感染，尾部略增粗，質地一般或者有一定硬度且注射部位形成小潰瘍，多數可以結痂自愈；但IFA+CⅡ組注射部位出現感染的數量較CFA+CⅡ組明顯減少。

2.2 AI評分 在造模后第7天，3組AI值均為0。在14 d時，兩模型組AI值升高，IFA+CⅡ組和CFA+CⅡ組AI值比較差異有統計學意義(P<0.01)；在21 d時，AI值繼續(xù)升高，IFA+CⅡ組和CFA+CⅡ組AI值比較差異有統計學意義(P<0.01)。在14 d和21 d，兩模型組之間AI值差異無統計學意義(P>0.05)。對照組在造模后14 d和21 d 的AI值均為0(見表2)。

表23組大鼠在不同時間點AI值的變化趨勢

2.3 3組大鼠在造模后第14天踝關節(jié)病理學變化 對照組踝關節(jié)腔內，關節(jié)軟骨表面光滑且完整，關節(jié)軟骨及軟骨下骨質無破壞，關節(jié)間隙正常；且未見滑膜增生和血管翳形成(見圖2)。IFA+CⅡ組踝關節(jié)滑膜軟骨連續(xù)但關節(jié)軟骨表面粗糙不平(見圖3A)；踝關節(jié)腔內可見少量血管翳、炎性細胞浸潤，關節(jié)軟骨輕微破壞(見圖3B)。CFA+CⅡ組關節(jié)軟骨明顯破壞、不連續(xù)不完整且呈鋸齒狀(見圖3C)；形成明顯的血管翳，滑膜細胞增生明顯，排列紊亂，見大量的炎性細胞浸潤(見圖3D)。

3 討論

CIA模型在臨床癥狀和病理學特點及免疫學方面與RA相似[11]，一直是研究RA的經典模型[4,8]。CIA 是一種用同源或異源性Ⅱ型膠原免疫動物而引發(fā)的一種慢性、多發(fā)性關節(jié)炎。通常在尾根部皮內注射佐劑乳化的CⅡ誘導動物，注射后可發(fā)生關節(jié)炎。許多研究者使用RA模型進行轉基因及免疫治療等研究[10]，佐劑的種類可能影響CIA模型的病變情況，導致實驗誤差加大，從而影響結果的可靠性。

本研究使用IFA和CFA分別與等體積CⅡ乳化制備RA大鼠模型。比較大鼠一般情況、發(fā)病情況和病理學改變。從一般情況上看IFA+CⅡ組發(fā)病時感染較少，在造模后14 d，2組大鼠AI評分均超過4分，說明RA大鼠模型制備成功。隨著時間的延長，在造模后21 d，2組的AI值變化不大。在模型成功率上兩模型組均為80%，這與大多數研究者的結果相似[12-13]。在造模后14 d，2組踝關節(jié)HE染色結果發(fā)現，模型組均可見炎性細胞、血管翳增生等。這一現象的可能機制為CⅡ可以誘導B細胞產生特異性抗體；抗體沉積于關節(jié)部位，協同CⅡ激活補體系統，誘發(fā)炎癥。這一炎癥反應不斷刺激滑膜組織，形成血管翳[11]。這些血管翳引起關節(jié)軟骨破壞，最終導致RA的發(fā)生[14]。IFA+CⅡ組比CFA+CⅡ組炎癥反應稍輕，提示免疫反應較弱。而且IFA+CⅡ組在對關節(jié)軟骨的破壞程度、炎癥細胞的增多程度、血管翳的增生程度和浸潤程度明顯比CFA+CⅡ組輕。使用IFA+CⅡ制備RA模型有利于減小實驗誤差，真實反映RA的病變情況，保證RA相關研究結果的可靠性。由于在造模后21 d，模型組的AI值變化不大，為此本課題組僅觀察了造模后14 d的病理學變化。為了深入了解IFA+CⅡ造模的優(yōu)越性，本課題組下一步實驗將檢測炎性因子腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β和白細胞介素17在RA中的表達變化，這將為RA研究提供更為可靠的實驗基礎。

綜上所述，在制備大鼠RA模型過程中，使用IFA+CⅡ和CFA+CⅡ有相似的病理學特點，并且IFA+CⅡ對動物的不良反應明顯低于CFA+CⅡ。因此，IFA+CⅡ可作為制備CIA模型的首選方案，以保障實驗結果的可靠性。