陶計(jì)委， 南亞強(qiáng)， 周杰， 樂利明， 關(guān)海濱， 蔣谷峰， 范斐陽

Exendin-4通過抑制Toll樣受體4/核因子κB信號(hào)通路對(duì)帕金森病小鼠保護(hù)作用的研究*

陶計(jì)委1，2， 南亞強(qiáng)1，2， 周杰2△， 樂利明2， 關(guān)海濱2， 蔣谷峰2， 范斐陽2

（1蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030；2中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院神經(jīng)外科，甘肅 蘭州 730050）

探討exendin-4對(duì)1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導(dǎo)的帕金森病（PD）小鼠的保護(hù)作用及機(jī)制。將48只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照（control）組、exendin-4組、MPTP組和MPTP+exendin-4組，每組12只。MPTP和MPTP+exendin-4組腹腔注射MPTP（30 mg/kg），每天1次，連續(xù)5 d建立亞急性PD小鼠模型，造模成功后，exendin-4組及MPTP+exendin-4組小鼠給予腹腔注射exendin-4（2.5 μg/kg），每天2次，連續(xù)7 d治療；選擇爬桿實(shí)驗(yàn)和掛線實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠行為學(xué)變化。采用Western blot法檢測各組小鼠中腦酪氨酸羥化酶（TH）、離子鈣結(jié)合接頭分子1（Iba-1）、Toll樣受體4（TLR4）、髓樣分化因子88（MyD88）和核因子κB（NF-κB）p65蛋白表達(dá)水平，免疫組化法測定各組小鼠中腦黑質(zhì)TH及TLR4的表達(dá)水平；酶聯(lián)免疫吸附法測定中腦腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素6（IL-6）水平。與對(duì)照組比較，MPTP組小鼠轉(zhuǎn)頭時(shí)間及爬桿時(shí)間延長（<0.01），懸掛實(shí)驗(yàn)評(píng)分降低（<0.01），中腦黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元數(shù)及中腦TH蛋白表達(dá)減少（<0.01），Iba-1及TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、核NF-κB p65蛋白及炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)水平增加（<0.01）；與MPTP組相比，MPTP+exendin-4組小鼠轉(zhuǎn)頭時(shí)間及爬桿時(shí)間縮短（<0.01），懸掛實(shí)驗(yàn)評(píng)分增加（<0.01），中腦黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元數(shù)及中腦TH蛋白表達(dá)增加（<0.01），Iba-1、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、核NF-κB p65、TNF-α和IL-6表達(dá)水平降低（<0.01）。在MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型中，exendin-4可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞及TLR4/NF-κB炎癥信號(hào)通路激活而發(fā)揮抗神經(jīng)炎癥作用，保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元，改善PD小鼠運(yùn)動(dòng)功能。

Exendin-4；帕金森?。籘LR4/NF-κB信號(hào)通路；神經(jīng)炎癥

帕金森?。≒arkinson disease， PD）是一種好發(fā)于中老年人群的常見神經(jīng)退行性疾病，其患病率隨著年齡增加而增加，在65歲以上人群中患病率達(dá)1%，80歲以上人群中患病率達(dá)3%［1］。其病理特點(diǎn)為中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性死亡，紋狀體多巴胺含量下降及路易小體形成［2-3］。神經(jīng)炎癥在PD發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色［4-5］，Toll樣受體4（Toll-like receptor 4， TLR4）作為神經(jīng)炎癥重要組成部分參與了PD的發(fā)?。?-9］。2型糖尿病與帕金森病患病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)，并且它們有許多潛在的共同病理機(jī)制［10］。胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide-1， GLP-1）是一種由腸道L細(xì)胞分泌的多肽激素，其可通過增加胰島素合成、促進(jìn)胰島素分泌和抑制胰高血糖素分泌等調(diào)節(jié)血糖，但其在體內(nèi)易被二肽基肽酶4降解，血漿半衰期較短；exendin-4是從巨蜥唾液中分離出的GLP-1受體激動(dòng)劑，它與哺乳動(dòng)物GLP-1大約有50%的氨基酸序列相同，與GLP-1具有相似的生理功能，可改善胰島細(xì)胞功能，葡萄糖濃度依賴性地促進(jìn)胰島素分泌，且其可抵抗二肽基肽酶4降解，因此具有較長血漿半衰期，臨床上主要用于2型糖尿病治療［11］；近年來研究顯示，exendin-4易通過血腦屏障［12］，在PD動(dòng)物模型中，其可通過抑制腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）及白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）等促炎因子的表達(dá)［13］，促進(jìn)α-突觸核蛋白降解［14］等多種途徑保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元；臨床試驗(yàn)顯示，exendin-4可改善帕金森病患者運(yùn)動(dòng)功能［15］，且可能具有疾病修飾作用。本研究基于TLR4、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88， MyD88）及核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB）炎癥信號(hào)通路，利用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methy1-4-phenyI-1，2，3，6-tetrahydropyridine， MPTP）誘導(dǎo)PD小鼠模型，通過行為學(xué)、病理及分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)探討exendin-4在PD小鼠模型中具體作用機(jī)制，為exendin-4應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1　動(dòng)物

48只SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，10～12周齡，體重20～25 g，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸研所提供，許可證號(hào)為SCXK（甘）2015-0001；每籠飼養(yǎng)6只小鼠，自由進(jìn)食和飲水，相對(duì)濕度40%～60%，室溫20～25 ℃。研究嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》的指導(dǎo)原則，已通過中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（審批編號(hào)：2021KYLL239）。

2　主要試劑

exendin-4購于Sigma-Aldrich；MPTP購于北京索萊寶科技有限公司；離子鈣結(jié)合接頭分子1（ionized calcium-binding adapter moleoule 1， Iba-1）抗體購于Abcam；TLR4和酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase， TH）抗體購于Proteintech；β-actin、histone H3、MyD88和NF-κB p65抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；p-NF-κB p65抗體購于Cell Signaling Technology；HRP標(biāo)記的羊抗兔II抗購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；免疫顯色試劑（UItraSensitive SP鼠/兔）購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；TNF-α和IL-6測定試劑盒購于江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司。BX51正置顯微鏡購自O(shè)lympus； SDS-PAGE裝置及ChemiDoc MP Imaging System購于Bio-Rad；高速冷凍離心機(jī)購于Sigma。

3　主要方法

3.1模型制備及分組給藥小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照（control）組、exendin-4組、MPTP組和MPTP+exendin-4組，每組12只，共48只。給藥前小鼠適應(yīng)環(huán)境一周及行爬桿訓(xùn)練；根據(jù)文獻(xiàn)，MPTP組及MPTP+exendin-4組給予MPTP（30 mg/kg）腹腔注射，每天1次，連續(xù)5 d復(fù)制亞急性PD模型［16-17］。同時(shí)control組、exendin-4組給予等量生理鹽水腹腔注射，每次注射MPTP后小鼠出現(xiàn)震顫及豎毛等急性損傷癥狀，但能逐漸恢復(fù)，隨著給藥天數(shù)的增加，小鼠運(yùn)動(dòng)功能逐漸損害，出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)遲緩及動(dòng)作笨拙等異常表明造模成功。造模成功后，參考文獻(xiàn)用藥劑量［14］，exendin-4組及MPTP+exendin-4組小鼠給予2.5 μg/kg exendin-4連續(xù)腹腔注射，每天2次，連續(xù)7 d治療，control組和MPTP組同時(shí)給予等體積生理鹽水腹腔注射，給藥結(jié)束后行爬桿、懸掛實(shí)驗(yàn)及采集標(biāo)本。

3.2行為學(xué)實(shí)驗(yàn)包括爬桿實(shí)驗(yàn)和懸掛實(shí)驗(yàn)兩部分，exendin-4末次注射后的次日進(jìn)行爬桿實(shí)驗(yàn)。（1）爬桿實(shí)驗(yàn)：根據(jù)我們課題組之前的研究方法，將小鼠頭朝上，上肢放在桿頂端圓球上（高55 cm，直徑1 cm，圓球直徑2 cm）。小鼠從放置到全身朝下的時(shí)間為掉頭時(shí)間，從放置頂端爬到后肢著陸的時(shí)間為爬桿總時(shí)間，每只小鼠測試3次，取平均值［18］；（2）懸掛實(shí)驗(yàn)：將小鼠兩前爪放于細(xì)線中間以懸掛小鼠，記錄小鼠抓住細(xì)線的肢體數(shù)目。四個(gè)爪子抓住細(xì)線記4分，三個(gè)爪子抓住細(xì)線記3分，兩個(gè)爪子抓住細(xì)線記2分，一個(gè)爪子抓住細(xì)線記1分，掉落記0分， 每只小鼠測試3次，取平均值［19］。

3.3取材行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用10%水合氯醛麻醉取材，每組取6只小鼠用4%多聚甲醛行心臟灌注固定取完整腦組織，行免疫組化實(shí)驗(yàn)；每組取6只小鼠麻醉后分離包括黑質(zhì)部分的中腦組織，行Western blot實(shí)驗(yàn)及酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)。

3.4Western blot檢測蛋白表達(dá)水平剝離小鼠包括黑質(zhì)部分的中腦組織，加入含PMSF及磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液勻漿后，4 ℃、13 040.4×離心20 min，取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度；核蛋白提取參照核蛋白提取試劑盒說明書進(jìn)行。SDS-PAGE分離蛋白，分離膠濃度根據(jù)蛋白分子量選擇。將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至0.22 μm的PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉120 min，相應(yīng)I抗（TH、Iba1和histone H3， 1∶1 000； TLR4、MyD88、p-NF-κB p65和NF-κB p65， 1∶500； β-actin， 1∶2 000）4 ℃冰箱搖床孵育過夜。次日，TBST清洗3次后，將目標(biāo)條帶與對(duì)應(yīng)種屬的II抗室溫孵育2 h，TBST清洗3次后曝光，ImageJ軟件分析相應(yīng)條帶灰度值。

3.5免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)將固定好的腦組織進(jìn)行石蠟包埋切片，切片進(jìn)行二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后、抗原修復(fù)10 min，PBS洗3次×3 min，試劑1（內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑）孵育10 min，PBS洗3次×10 min，試劑2（非特異染色阻斷劑）孵育10 min，然后滴加Ⅰ抗（TH， 1∶500； TLR4， 1∶200）4 ℃孵育過夜；第2天，PBS洗3次×3 min，試劑3（生物素標(biāo)記的羊抗小鼠/兔IgG聚合物）孵育10 min，PBS洗3次×3 min，試劑4（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶）孵育10 min，顯微鏡下DAB顯色，蘇木素復(fù)染，返藍(lán)，乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像，利用ImageJ軟件分析統(tǒng)計(jì)TH染色陽性細(xì)胞數(shù)目及TLR4平均光密度。

3.6ELISA檢測取小鼠中腦組織，分別按照TNF-α及IL-6測定試劑盒說明書進(jìn)行操作。

4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0軟件和GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　exendin-4對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠行為學(xué)影響

行為學(xué)結(jié)果顯示，相比control組，MPTP組小鼠的轉(zhuǎn)頭時(shí)間及爬桿時(shí)間顯著延長（<0.01），而MPTP+exendin-4組小鼠較MPTP組轉(zhuǎn)頭時(shí)間及爬桿時(shí)間顯著縮短（<0.01）；懸掛實(shí)驗(yàn)中MPTP組小鼠的評(píng)分比control組顯著減少（<0.01），而MPTP+exendin-4組小鼠的評(píng)分較MPTP組顯著增加（<0.01），見圖1。

Figure 1.Results of behavioral tests of the mice in each group. A： comparison of turning time （T-turn） of the mice in each group； B： comparison of climbing total time （T-tatal） of the mice in each group； C： comparison of traction test score of the mice in each group. Mean±SD. n=12. **P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs MPTP group.

2　exendin-4對(duì)MPTP誘導(dǎo)的小鼠黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元及中腦TH蛋白水平的影響

免疫組化顯示，TH主要表達(dá)于神經(jīng)元胞質(zhì)中，MPTP注射后小鼠中腦黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元較control組細(xì)胞數(shù)目顯著減少（<0.01），胞質(zhì)染色減少；MPTP+exendin-4組小鼠TH陽性神經(jīng)元較MPTP組數(shù)量顯著增多（<0.01），胞質(zhì)染色增多，見圖2A。Western blot結(jié)果顯示，MPTP注射后小鼠中腦組織TH蛋白表達(dá)水平較control組顯著減少（<0.01），MPTP+exendin-4組小鼠中腦TH蛋白表達(dá)水平較MPTP組顯著增多（<0.01），見圖2B。

Figure 2.Comparison of TH expression of the mice in each group. A： immunohistochemical staining of TH+ neurons in the midbrain substantia nigra of the mice in each group （scale bar=50 μm）； B： Western blot images of TH protein in midbrain tissues of mice in each group and the statistical results. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs MPTP group.

3　exendin-4對(duì)MPTP誘導(dǎo)的小鼠中腦TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路及Iba-1表達(dá)水平的影響

免疫組化染色顯示，TLR4蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞膜上，MPTP模型組小鼠中腦黑質(zhì)TLR4表達(dá)較control組顯著增加（<0.01），MPTP+exendin-4組小鼠中腦黑質(zhì)TLR4表達(dá)較MPTP組顯著減少（<0.01）；TLR4的Western blot結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致，MPTP組小鼠中腦組織TLR4蛋白表達(dá)較control組顯著增加（<0.01），MPTP+exendin-4組小鼠中腦組織TLR4蛋白表達(dá)較MPTP組顯著減少（<0.01）；相比control組，MPTP組小鼠中腦TLR4下游MyD88蛋白表達(dá)顯著增加（<0.01），NF-κB p65磷酸化水平顯著升高（<0.01），胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著增加（<0.01）；相比MPTP組，MPTP+exendin-4組TLR4下游MyD88蛋白表達(dá)顯著減少（<0.01），NF-κB磷酸化顯著減少（<0.01），胞核NF-κB蛋白表達(dá)顯著減少（<0.01）；Iba-1是小膠質(zhì)細(xì)胞激活標(biāo)志物，相比control組，MPTP組小鼠中腦Iba-1蛋白表達(dá)顯著增加（<0.01），MPTP+exendin-4組小鼠中腦Iba-1蛋白表達(dá)水平較MPTP組顯著降低（<0.01），見圖3。

Figure 3.Comparison of TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway and expression level of Iba-1 in midbrain of the mice in each group. A： immunohistochemical staining of TLR4 in the midbrain substantia nigra of mice in each group （scale bar=50 μm）； B： TLR4， MyD88 and p-NF-κB p65 detected by Western blot； C： nuclear NF-κB p65 detected by Western blot； D： Iba-1 detected by Western blot. Mean±SD. n=6. *P<0.05， **P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs MPTP group.

4　exendin-4對(duì)MPTP誘導(dǎo)的小鼠中腦炎癥因子表達(dá)的影響

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)顯示，MPTP組小鼠中腦TNF-α及IL-6表達(dá)水平較control組顯著增加（<0.01），而MPTP+exendin-4組小鼠中腦TNF-α及IL-6表達(dá)水平較MPTP組顯著降低（<0.01），見圖4。

Figure 4.Comparison of the expression levels of inflammatory factors TNF-α and IL-6 in midbrain of the mice in each group. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs MPTP group.

討論

PD病理特點(diǎn)為中腦黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元變性死亡，紋狀體多巴胺含量下降及路易小體形成，其運(yùn)動(dòng)癥狀主要表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢步態(tài)異常等［20-21］。利用MPTP腹腔注射能夠模擬帕金森病的病理及行為學(xué)改變，是目前建立PD模型較常用的方法［22］；TH是多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)志物［23］，在本實(shí)驗(yàn)中，給予MPTP腹腔注射后小鼠出現(xiàn)黑質(zhì)區(qū)域TH陽性神經(jīng)元受損及中腦TH蛋白表達(dá)水平降低，并出現(xiàn)轉(zhuǎn)頭時(shí)間及爬桿時(shí)間延長、懸掛實(shí)驗(yàn)評(píng)分降低等運(yùn)動(dòng)功能障礙，較好地模擬了PD的病理學(xué)及行為學(xué)改變；給予exendin-4治療后可減少M(fèi)PTP對(duì)小鼠黑質(zhì)區(qū)域TH陽性神經(jīng)元損害，增加PD小鼠中腦TH蛋白表達(dá)水平，改善了MPTP引起的運(yùn)動(dòng)功能障礙，發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)作用。

既往研究顯示，exendin-4可通過促進(jìn)α-突觸核蛋白降解在PD動(dòng)物模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［14］；臨床試驗(yàn)顯示，exendin-4可改善帕金森病患者運(yùn)動(dòng)功能［15］，且可能具有疾病修飾作用。神經(jīng)炎癥在PD發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色［4-5］，然而，exendin-4在帕金森病中抗神經(jīng)炎癥具體機(jī)制仍不明確；小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要炎癥細(xì)胞，TLR4/NF-κB信號(hào)通路是機(jī)體重要的炎癥通路，TLR4激活后可通過MyD88依賴性通路或MyD88非依賴性通路激活下游NF-κB，促進(jìn)NF-κB核轉(zhuǎn)移，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子TNF-α及IL-6等的釋放［24-25］。在PD發(fā)病過程中，TLR4/NF-κB信號(hào)通路作為神經(jīng)炎癥重要組成部分參與了PD的發(fā)?。?-9］。我們的研究顯示，給予MPTP腹腔注射后小鼠中腦小膠質(zhì)細(xì)胞激活增加，TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路表達(dá)增加，炎癥因子TNF-α及IL-6釋放增加；給予exendin-4治療后可抑制PD小鼠中腦小膠質(zhì)細(xì)胞激活及TLR4/NF-κB信號(hào)通路表達(dá)，減少NF-κB磷酸化和核轉(zhuǎn)移，減少炎癥因子TNF-α及IL-6的釋放，在MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型中起到抗神經(jīng)炎癥作用。

綜上，我們的研究表明，在MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型中，exendin-4可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞及TLR4 /NF-κB炎癥信號(hào)通路激活發(fā)揮抗神經(jīng)炎癥作用，保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元，改善PD小鼠運(yùn)動(dòng)功能。

［1］ Homayoun H. Parkinson disease［J］. Ann Intern Med， 2018， 169（5）：C33-C48.

［2］ Kordower JH， Olanow CW， Dodiya HB， et al. Disease duration and the integrity of the nigrostriatal system in Parkinson's disease［J］. Brain， 2013， 136（Pt 8）：2419-2431.

［3］ Kalia LV， Lang AE. Parkinson's disease［J］. Lancet， 2015， 386（9996）：896-912.

［4］ Poewe W， SeppiK， Tanner CM， et al. Parkinson disease［J］. Nat Rev Dis Primers， 2017， 3：17013.

［5］ Gelders G， Baekelandt V， Van der Perren A. Linking neuroinflammation and neurodegeneration in Parkinson's disease［J］. J Immunol Res， 2018， 2018：4784268.

［6］ Kouli A， Camacho M， Allinson K， et al. Neuroinflammation and protein pathology in Parkinson's disease dementia［J］. Acta Neuropathol Commun， 2020， 8（1）：211.

［7］ Shao QH， Chen Y， Li FF， et al. TLR4 deficiency has a protective effect in the MPTP/probenecid mouse model of Parkinson's disease［J］. Acta Pharmacol Sin， 2019， 40（12）：1503-1512.

［8］ Campolo M， Paterniti I， Siracusa R， et al. TLR4 absence reduces neuroinflammation and inflammasome activation in Parkinson's diseasesmodel［J］. Brain Behav Immun， 2019， 76：236-247.

［9］李海霞， 李映霞， 程蕓， 等. Toll樣受體4在帕金森病中的研究進(jìn)展［J］. 中國病理生理雜志， 2021， 37（4）：744-751.

Li HX， Li YX， Cheng Y， et al. Progress in role of Toll-like receptor 4 in Parkinson disease［J］. Chin J Pathophysiol， 2021， 37（4）：744-751.

［10］ Athauda D， Foltynie T. Insulin resistance and Parkinson's disease： a new target for disease modification？［J］. Prog Neurobiol， 2016， 145/146：98-120.

［11］ Meier JJ. GLP-1 receptor agonists for individualized treatment of type 2 diabetes mellitus［J］. Nat Rev Endocrinol， 2012， 8（12）：728-742.

［12］ Zhang L， Zhang L， Li Y， et al. The novel dual GLP-1/GIP receptor agonist DA-CH5 is superior to single GLP-1 receptor agonists in the MPTP model of Parkinson's disease［J］. J Parkinsons Dis， 2020， 10（2）：523-542.

［13］ Kim S， Moon M， Park S. Exendin-4 protects dopaminergic neurons by inhibition of microglial activation and matrix metalloproteinase-3 expression in an animal model of Parkinson's disease［J］. J Endocrinol， 2009， 202（3）：431-439.

［14］ Bu LL， Liu YQ， Shen Y， et al. Neuroprotection of exendin-4 by enhanced autophagy in a parkinsonian rat model of α-synucleinopathy［J］. Neurotherapeutics， 2021， 18（2）：962-978.

［15］ Athauda D， Maclagan K， Skene SS， et al. Exenatide once weekly versus placebo in Parkinson's disease： a randomised， double-blind， placebo-controlled trial［J］. Lancet， 2017， 390（10103）：1664-1675.

［16］ Tatton NA，Kish SJ.In situ detection of apoptotic nuclei in the substantia nigra compacta of 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine-treated mice using terminal deoxynucleotidyl transferase labelling and acridine orange staining［J］. Neuroscience， 1997， 77（4）：1037-1048.

［17］ 任傳忠， 肖猛， 李瑋， 等. 硫辛酸對(duì)MPTP誘導(dǎo)的小鼠帕金森病模型的神經(jīng)保護(hù)作用［J］. 中國病理生理雜志， 2020， 36（1）：127-133.

Ren CZ， Xiao M， Li W， et al. Effects of alpha-lipoic acid on MPTP-induced Parkinson disease in mice［J］. Chin J Pathophysiol， 2020， 36（1）：127-133.

［18］ Zhou J， Qu XD， Li ZY， et al. Salvianolic acid B attenuates toxin-induced neuronal damage via Nrf2-dependent glial cells-mediated protective activity in Parkinson's disease models［J］. PLoS One， 2014， 9（7）：e101668.

［19］ Sun MF， Zhu YL， Zhou ZL， et al. Neuroprotective effects of fecal microbiota transplantation on MPTP-induced Parkinson's disease mice： gut microbiota，glial reaction and TLR4/TNF-α signaling pathway［J］. Brain Behav Immun， 2018， 70：48-60.

［20］ Erro R， Stamelou M. The motor syndrome of Parkinson's disease［J］. Int Rev Neurobiol， 2017， 132：25-32.

［21］ Jankovic J， Tan EK. Parkinson's disease：etiopathogenesis and treatment［J］. J Neurol Neurosurg Psychiatry， 2020， 91（8）：795-808.

［22］ Vingill S， Connor-Robson N， Wade-Martins R. Are rodent models of Parkinson's disease behaving as they should？［J］. Behav Brain Res， 2018， 352：133-141.

［23］ 劉麗， 羅廣軒， 林健琳， 等. 蟲草素對(duì)MPTP誘導(dǎo)的帕金森病小鼠運(yùn)動(dòng)與認(rèn)知能力的影響［J］. 中國病理生理雜志， 2019， 35（2）：326-331.

Liu L， Luo GX， Lin JL， et al. Effects of cordycepin on motor and cognition in Parkinson disease mice induced by MPTP［J］. Chin J Pathophysiol， 2019， 35（2）：326-331.

［24］ Kuzmich NN， Sivak KV， Chubarev VN， et al. TLR4 signaling pathway modulators as potential therapeutics in inflammation and sepsis［J］. Vaccines （Basel）， 2017， 5（4）：34.

［25］ Rahimifard M， Maqbool F， Moeini-Nodeh S， et al. Targeting the TLR4 signaling pathway by polyphenols： a novel therapeutic strategy for neuroinflammation［J］. Ageing Res Rev， 2017， 36：11-19.

Protective effect of exendin-4 on Parkinson disease mice by inhibiting Toll-like receptor 4/nuclear factor-κB signaling pathway

TAO Ji-wei1，2， NAN Ya-qiang1，2， ZHOU Jie2△， LE Li-ming2， GUAN Hai-bin2， JIANG Gu-feng2， FAN Fei-yang2

（1，730030，；2，940，730050，）

To investigate the protective effect and mechanism of exendin-4 on Parkinson's disease （PD） mice induced by 1-methy1-4-phenyI-1， 2，3，6-tetrahydropyridine （MPTP）.Forty-eight male C57BL/6 mice were randomly divided into control group， exendin-4 group， MPTP group and MPTP+exendin-4 group， with 12 mice in each group. The mice in MPTP and MPTP+exendin-4 groups were intraperitoneally injected with MPTP （30 mg/kg） once a day for 5 d to establish subacute PD model. Exendin-4 （2.5 μg/kg） was injected twice a day for 7 d in exendin-4 and MPTP+exendin-4 group. The pole test and traction test were used to evaluate the behavioral changes of the mice. Western blot was used to detect the protein levels of tyrosine hydroxylase （TH）， ionized calcium-binding adapter molecule 1 （Iba-1）， Toll-like receptor 4 （TLR4）， myeloid differentiation factor 88 （MyD88） and nuclear factor-κB （NF-κB） in the midbrain of the mice. Immunohistochemistry was used to detect the expression levels of TH and TLR4 in the midbrain substantia nigra of the mice. The levels of interleukin-6 （IL-6） and tumor necrosis factor-α （TNF-a） in midbrain were detected by ELISA.Compared with control group， the head turning time and pole climbing time of the mice in MPTP group were prolonged （<0.01）， the traction test score decreased （<0.01）， the number of TH-positive neurons in the substantia nigra and the expression of TH protein in midbrain decreased （<0.01）， and the expression levels of Iba-1， TLR4， MyD88， p-NF-κB p65， nuclear NF-κB p65， TNF-α and IL-6 increased （<0.01）. Compared with MPTP group， the head turning time and pole climbing time of the mice were reduced in MPTP+exendin-4 group （<0.01）， the traction test score increased （<0.01）， the number of TH-positive neurons in the substantia nigra and the expression of TH protein in midbrain increased （<0.01）， the expression levels of Iba-1， TLR4， MyD88， p-NF-κB P65， nuclear NF-κB p65， TNF-α and IL-6 decreased （<0.01）.In MPTP-induced PD mouse model， exendin-4 protects dopaminergic neurons and improves the motor function of PD mice by inhibiting the activation of microglia and TLR4/NF-κB inflammatory signaling pathway.

Exendin-4； Parkinson disease； TLR4/NFκB signaling pathway； Neuroinflammation

R742.5； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.03.015

1000-4718（2022）03-0502-07

2021-12-04

2022-01-12

［基金項(xiàng)目］甘肅省衛(wèi)生行業(yè)科研計(jì)劃項(xiàng)目（No. GSWSKY2018-43）

Tel： 13309313131； E-mail： zhoujie7089@163.com

（責(zé)任編輯：林白霜，羅森）