王旎， 劉舜杰， 孟洋陽(yáng)， 雷清鋒， 韋睿，2， 李中，3，4△

源于尿道上皮細(xì)胞的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞構(gòu)建阿爾茨海默病研究模型*

王旎1， 劉舜杰1， 孟洋陽(yáng)1， 雷清鋒1， 韋睿1，2， 李中1，3，4△

（1中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院神經(jīng)科，廣東 廣州 510655；2中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究所， 廣東 廣州 510530；3廣東省腦功能與腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510080；4中山大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518057）

阿爾茨海默?。ˋD）是常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病之一，目前仍未有理想的研究模型，這使得其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。因此，本研究將利用非侵襲性方法收集的尿道上皮細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）從而構(gòu)建AD疾病研究模型。本研究選取3名男性AD患者作為實(shí)驗(yàn)組和2名正常男性作為對(duì)照者組，通過(guò)分離實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的尿道上皮細(xì)胞，并將其重編程成為iPSC，利用堿性磷酸酶染色、RT-qPCR及畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)等驗(yàn)證其干細(xì)胞特性。隨后將iPSC定向神經(jīng)分化成為神經(jīng)細(xì)胞，采用ELISA方法驗(yàn)證AD特異性標(biāo)志物的表達(dá)水平。同時(shí)，將基因在iPSC細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)，采用ELISA方法驗(yàn)證AD特異性標(biāo)志物的表達(dá)水平，以上實(shí)驗(yàn)每組研究對(duì)象均進(jìn)行2～3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。尿道上皮細(xì)胞被成功地重編程成iPSC，且具有分化為三種不同胚層來(lái)源組織的多能性。定向分化患者來(lái)源的神經(jīng)細(xì)胞分泌AD標(biāo)志物的水平與正常對(duì)照比較沒(méi)有顯著差異（>0.05）。但是，過(guò)表達(dá)后的iPSC細(xì)胞系和分化的神經(jīng)細(xì)胞，AD相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增高（<0.05），說(shuō)明該細(xì)胞系作為AD模型的可行性。本研究成功地將AD患者的尿道上皮細(xì)胞重編程為iPSC，并將其與正常來(lái)源的iPSC進(jìn)行比較，觀察到患者來(lái)源的iPSC具有相對(duì)正常的蛋白表達(dá)譜，提示該細(xì)胞的臨床應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，過(guò)表達(dá)基因的iPSC能檢測(cè)到高表達(dá)的AD相關(guān)標(biāo)志物，提示該細(xì)胞可以作為研究AD發(fā)病機(jī)制的細(xì)胞模型。

阿爾茨海默病；尿道上皮細(xì)胞；誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；神經(jīng)分化；基因

阿爾茨海默病（Alzheimer disease， AD）是最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一，同時(shí)也是導(dǎo)致老年性癡呆最常見(jiàn)的原因之一。目前，全球罹患AD的病人大約有3.5億，而該數(shù)據(jù)預(yù)計(jì)每20年將會(huì)翻1倍［1］。研究表明衰老是AD發(fā)病的最大危險(xiǎn)因素［1］，同時(shí)有調(diào)查顯示85歲以上的老人中AD的患病率可高達(dá)30%以上［2］。明確AD發(fā)病機(jī)制是尋找新的更有效的治療方案前提之一，而發(fā)病機(jī)制的研究依賴于理想的疾病研究模型。之所以AD發(fā)病機(jī)制的研究和相關(guān)的藥物研發(fā)不盡人意，其重要原因之一在于缺乏理想的疾病模型。早在20世紀(jì)70年代，研究者對(duì)AD患者尸體進(jìn)行解剖檢測(cè)到腦內(nèi)有特殊的淀粉樣斑塊和神經(jīng)纖維纏結(jié)。后續(xù)的研究表明其主要成分為β淀粉樣蛋白（β-amyloid， Aβ）和磷酸化的Tau蛋白［3］。但是，這些病變只提示了疾病終末狀態(tài)，卻無(wú)法解釋淀粉樣斑塊和神經(jīng)纖維纏結(jié)如何形成的。由于活體標(biāo)本無(wú)法獲得的局限性，研究者只能通過(guò)構(gòu)建動(dòng)物模型和細(xì)胞模型來(lái)探索其發(fā)病機(jī)制。

常用的動(dòng)物模型有加速衰老動(dòng)物模型，可以通過(guò)手術(shù)或神經(jīng)毒性藥物損毀紋狀體區(qū)域神經(jīng)元從而構(gòu)建有癡呆狀態(tài)的模型，也可以導(dǎo)入家系A(chǔ)D突變基因（、、等）的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型等。前者僅僅模擬了認(rèn)知障礙的臨床表現(xiàn)，并沒(méi)有引入AD的致病過(guò)程，因此對(duì)于機(jī)制的研究意義不大。由于越來(lái)越多的家系A(chǔ)D和相關(guān)的致病基因（、、）被發(fā)現(xiàn)［4］，研究者們將該致病基因?qū)雱?dòng)物體內(nèi)從而建立AD疾病模型。但是，由于種屬間的差異性，該模型也具有一定的局限性。例如，轉(zhuǎn)基因小鼠高表達(dá)了Aβ，在其腦組織內(nèi)可觀察到淀粉樣斑塊形成，但該模型腦內(nèi)的神經(jīng)纖維纏結(jié)形成卻尚未有相關(guān)報(bào)道［5］，這也限制了該小鼠模型的疾病機(jī)制研究。也有一些細(xì)胞模型被用于研究AD的發(fā)病機(jī)制，主要包括：來(lái)源于神經(jīng)腫瘤的細(xì)胞株（如人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞系）和動(dòng)物胚胎腦組織中分離出的原代神經(jīng)細(xì)胞。不過(guò)這些模型仍有其不足之處。首先，雖然人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞系來(lái)源于人神經(jīng)細(xì)胞，但它屬于腫瘤細(xì)胞與正常神經(jīng)細(xì)胞仍具有區(qū)別。其次，胎腦分離的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較少，很難對(duì)其進(jìn)行基因改造后建立成熟的細(xì)胞系。因此，由于AD疾病模型存在著種種問(wèn)題，這阻礙了疾病研究進(jìn)展和藥物研發(fā)。這樣使得我們需要尋求新的技術(shù)來(lái)建立更準(zhǔn)確的疾病模型。

近年來(lái)，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell， iPSC）技術(shù)的誕生為疾病的研究提供了新的思路。從患者體細(xì)胞重編程獲得的iPSC攜帶了患者來(lái)源的疾病特異性治病基因，這樣的細(xì)胞具有多向分化潛能和克隆性是建立疾病模型的潛在細(xì)胞來(lái)源和良好工具。例如，Yagi等［6］利用帶有和基因突變的家系A(chǔ)D患者的體細(xì)胞（成纖維細(xì)胞）重編程成為iPSC，將其誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞并檢測(cè)到高表達(dá)的Aβ。該研究首次證明了家系A(chǔ)D患者來(lái)源的iPSC誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞可能作為家系A(chǔ)D發(fā)病機(jī)制的研究模型。另外，Kondo等利用1例散發(fā)AD患者的體細(xì)胞重編程成為iPSC和誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞，也觀察到類似的結(jié)果，即Aβ寡聚體形成［7］。這提示利用重編程技術(shù)構(gòu)建的iPSC和定向分化的神經(jīng)細(xì)胞具有模擬疾病發(fā)生發(fā)展的潛能。因此，本項(xiàng)工作旨在利用iPSC技術(shù)構(gòu)建阿爾茨海默病的研究模型。

材料和方法

1　材料

本研究的尿道上皮細(xì)胞來(lái)自于2名正常者對(duì)照和3名AD患者，均獲得本人或家屬同意并簽字知情同意書(shū)，具體信息詳見(jiàn)表1。本研究所用的人胚胎干細(xì)胞（H1）、正常iPSC（UMC3）和過(guò)表達(dá)的iPSC（UMC3-21）由廣州生物醫(yī)藥與健康研究院惠贈(zèng)。本研究iPSC及其定向神經(jīng)分化實(shí)驗(yàn)等獲得廣州生物醫(yī)藥與健康研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)審批。

表1　細(xì)胞捐贈(zèng)者信息

2　方法

2.1尿道上皮細(xì)胞培養(yǎng)收集中段尿液400×離心10 min，棄上清后用PBS清洗1次后400×離心10 min。將清洗后的尿液細(xì)胞重懸于3 mL的培養(yǎng)液并接種于6孔板（預(yù)先明膠鋪板）中，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

2.2尿道上皮細(xì)胞重編程與iPSC純化用0.25% Trypsin-EDTA消化尿道上皮細(xì)胞并離心（200×，5 min），重懸于電轉(zhuǎn)反應(yīng)液和相應(yīng)體積的pCEP4-E02S-ET2K和pCEP4-has-miR-302-367 cluster質(zhì)粒的混合液中。用于重編程的質(zhì)粒由廣州生物醫(yī)藥與健康研究院惠贈(zèng)。將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯中，使用LONZA電轉(zhuǎn)儀（Nucleofector? 2b Device，AAB-1001）及其配套的電轉(zhuǎn)試劑盒（LONZA Primary Cell Nucleofector? Kit，VVPI-1005）進(jìn)行電轉(zhuǎn)，將電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入包被好Matrigel膠的6孔板內(nèi)，繼續(xù)置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，需每日換液。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)予以傳代并繼續(xù)放入37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。由于干細(xì)胞具有分化潛能，在增殖過(guò)程中可能出現(xiàn)分化。若出現(xiàn)非iPSC細(xì)胞形態(tài)時(shí)，加入膠原酶Ⅳ消化60 min，將漂起的iPSC收集，離心后種植于新的培養(yǎng)板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， AP）染色移出培養(yǎng)液后用PBS清洗細(xì)胞，加入4% PFA室溫固定2 min后，用TBST緩沖液洗三次后去除液體。加AP緩沖液（BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒）室溫染色5 min后，加入顯色液避光作用15 min。PBS洗3次后加入甘油在顯微鏡下觀察拍照。

2.4核型鑒定選取生長(zhǎng)密度約60%～80%的iPSC，加入秋水仙素（終濃度為0.2 g/L）后繼續(xù)置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育130 min。PSB洗2次后加入0.25% Trpsin-EDTA胰酶消化，使其分離成單個(gè)細(xì)胞后離心去上清。加入預(yù)熱的氯化鉀溶液（0.075 mol/L，37 ℃）重懸細(xì)胞并置37 ℃水浴處理20 min后，加入新鮮配制固定液（甲醇∶冰醋酸比例為3∶1），固定3 min后離心（1 000×，5 min）棄上清，再次加入固定液，置于37 ℃水浴箱中固定40 min。離心后棄上清后重懸細(xì)胞并滴片轉(zhuǎn)移至75℃烘箱，烤片3 h。0.5%胰蛋白酶消化液處理8 s后迅速放入生理鹽水終止消化。Giemsa染液染色處理5 min后自來(lái)水輕輕沖洗并吹干，隨后在電動(dòng)正置顯微鏡下觀察和分析核型。

2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)抽提總RNA，每孔加入1 mL的Trizol室溫裂解5分鐘，加入200 μL氯仿冰上孵育15 min后離心（10 000×，10 min）取上清轉(zhuǎn)移至新EP管。加入1 mL的無(wú)水乙醇離心（10 000×，10m in）后用1 mL的75%乙醇洗沉淀。離心（7 500×，10 min）后去上清，加入DEPC水溶解RNA并測(cè)定濃度。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)檢測(cè)三個(gè)內(nèi)源性多能性標(biāo)志物［八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（octamer-binding transcription factor 4， OCT4）、SRY盒轉(zhuǎn)錄因子2（SRY-box transcription factor 2， SOX2）和同源框蛋白NANOG］的表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參照。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。所用引物序列如下：OCT4的上游引物序列為5'-GACGCCATCAACACCGAGTT-3'，下游引物序列為5'-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3'；SOX2的上游引物序列為5'-CCCAGCAGACTTCACATGT-3'，下游引物序列為5'-CCTCCCATTTCCCTCGTTTT-3'；NANOG的上游引物序列為5'-TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT-3'，下游引物序列為5'-AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG-3'；GAPDH的上游引物序列為5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引物序列為5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。

2.6畸胎瘤形成試驗(yàn)本研究用于畸胎瘤試驗(yàn)的8～12周齡的NOD-SCID免疫缺陷小鼠（品系代碼406，Elite/SPF級(jí)）購(gòu)買(mǎi)于廣州生物醫(yī)藥與健康研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，共20只。將凍存的細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)約3×106以上）復(fù)蘇后，用Matrigel溶液重懸并注射入小鼠體內(nèi)，注射每只小鼠雙后肢，大約1個(gè)月后可見(jiàn)畸胎瘤長(zhǎng)出。待畸胎瘤直徑約為1 cm時(shí)處死小鼠進(jìn)行HE染色觀察三個(gè)胚層典型的組織。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過(guò)廣州生物醫(yī)藥與健康研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)審批。

2.7iPSC定向分化為神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell， NSC）與鑒定將未分化的iPSC接種于Matrigel包被的6孔板中，當(dāng)密度達(dá)到60%～70%時(shí)更換為神經(jīng)分化培養(yǎng)基，開(kāi)始誘導(dǎo)其向NSC分化。在分化的第8 天停止加入兩個(gè)抑制劑SB431542（Sigma）和dorsomorpin（Sigma）。分化后第16天可見(jiàn)神經(jīng)花環(huán)結(jié)構(gòu)形成或隆起的小丘狀。用免疫熒光鑒定NSC特異性標(biāo)志物［配對(duì)盒蛋白6（paired box 6， PAX6）、SRY盒轉(zhuǎn)錄因子1（SRY-box transcription factor 1， SOX1）、SOX2和巢蛋白（nestin）］的表達(dá)情況?？贵w信息如下：PAX6（1∶1 000，Millipore-AB2237），nestin（1∶1 000，Millipore-MAB5326），SOX1（1∶1 000，Abcam-ab87775），SOX2（1∶1 000，Abcam-ab97959）。

2.8誘導(dǎo)NSC向神經(jīng)細(xì)胞分化及鑒定為了明確尿道上皮細(xì)胞來(lái)源的iPSC是否能定向分化為神經(jīng)細(xì)胞，本研究參考文獻(xiàn)報(bào)道將尿道上皮來(lái)源的iPSC誘導(dǎo)分化為NSC［8］。NSC正常傳代1～2次后用accutase消化成為單個(gè)細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)的密度接種于Matrigel包被的12孔板內(nèi)，隔天換液。利用免疫熒光方法鑒定分化60 d后神經(jīng)細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志物［TUJ1、微管相關(guān)蛋白2（microtubule-associated protein 2， MAP2）和膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein， GFAP）］的表達(dá)情況。抗體信息如下：TUJ1（1∶1 000，Sigma-MAB1637），MAP2（1∶500，Sigma-M4403），GFAP（1∶1 000，Millipore-AB5804）。

2.9ELISA分化60 d后的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)于12孔板中，加入1 mL培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后取上清。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)Aβ1-40、Aβ1-42、總Tau和p-Tau水平。將100 μL抗體標(biāo)記液加入孔中室溫孵育60 min后，清洗三次移除上清。加入顯色溶液避光室溫孵育30 min。加入終止液停止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的吸光度。同時(shí)收集細(xì)胞并提取總蛋白并檢測(cè)其濃度，對(duì)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。Shapiro-Wilk方法判斷數(shù)據(jù)是否為正態(tài)分布，Levene方法判斷各組數(shù)據(jù)間是否方差齊性。對(duì)于正態(tài)分布且方差齊性的數(shù)據(jù)，使用單因素方差分析來(lái)比較組間差異，若單因素方差分析結(jié)果提示<0.05，則進(jìn)一步使用LSD-檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或非方差齊性，則使用Kruskal-Wallis方法分析比較組間差異，若結(jié)果提示<0.05，則進(jìn)一步使用Bonferroni法進(jìn)行組間兩兩比較，以<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　尿道上皮細(xì)胞重編程的iPSC

從3名臨床表型典型的AD患者和2名同年齡段的正常對(duì)照者的中段尿液中分離和培養(yǎng)了尿道上皮細(xì)胞（圖1A）。利用電轉(zhuǎn)技術(shù)轉(zhuǎn)染了編碼4種轉(zhuǎn)錄因子（OCT4、KLF4、NANOG和SV40LT）的外源質(zhì)粒，對(duì)尿道上皮細(xì)胞進(jìn)行重新編程。重編程的尿道上皮細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后第7天逐漸聚集，形態(tài)從紡錘狀變?yōu)閳A形（圖1B）。在轉(zhuǎn)染后18～21 d細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)出典型的iPSC，并采用堿性磷酸酶染色檢查方法判斷出該細(xì)胞具有多克隆性（圖1C）。通過(guò)對(duì)體外的4種重編程因子（OCT4、SOX2、KLF4和SV40LT）進(jìn)行PCR擴(kuò)增和凝膠電泳證實(shí)外源質(zhì)粒的DNA并未整合入iPSC中（圖1D）。此外，通過(guò)對(duì)不同個(gè)體來(lái)源的iPSC進(jìn)行核型分析，并將具有正常核型的iPSC用于后續(xù)研究（圖1E）。

隨后，通過(guò)檢測(cè)OCT4、SOX2和NANOG（三個(gè)常用的干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物）的mRNA表達(dá)水平，進(jìn)一步驗(yàn)證了正常核型的iPSC細(xì)胞系的干細(xì)胞特性，該實(shí)驗(yàn)將人類胚胎干細(xì)胞（H1細(xì)胞）作為陽(yáng)性對(duì)照（圖1F）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不論正常對(duì)照來(lái)源的iPSC，還是AD患者來(lái)源的iPSC細(xì)胞系表達(dá)OCT4、SOX2和NANOG的水平與H1細(xì)胞沒(méi)有顯著差異（圖1F）。這說(shuō)明了重編程iPSC細(xì)胞系具備干細(xì)胞的特性。此外，將iPSC注射到8～12周齡的NOD-SCID小鼠雙側(cè)后肢?；チ鲂纬珊筇幩佬∈?，HE染色分析畸胎瘤的組織成分證實(shí)了重編程的iPSC細(xì)胞系具有體內(nèi)分化為三個(gè)原始層的能力，包括來(lái)源于外胚層的神經(jīng)組織、來(lái)源于中胚層的肌肉組織、和來(lái)源于內(nèi)胚層的消化腺（圖1G）。

Figure 1.iPSC derived from urethral epithelial cells of the AD patients. A： morphological changes of urethral epithelial cells； B： morphological changes of iPSC； C： alkaline phophatase staining； D： PCR identification of non-integration of episomal DNA （the episomal plasmid pCEP4-EO2SET2K is used as a positive control）； E： normal karyotype of AD patient-derived cell lines； F： endogenous hESC-specific gene expression in iPSCs from patients （ADM01， ADM02 and ADM03） and controls （UE019 and UE009P2） by real-time qPCR （mean±SD； n=3）； G： HE staining of iPSCs-formed teratomas in the NOD-SCID mice.

2　iPSC誘導(dǎo)分化的NSC和神經(jīng)細(xì)胞

正常對(duì)照與AD患者來(lái)源分化形成的iPSC在形態(tài)學(xué)方面沒(méi)有明顯差異。在此過(guò)程中，iPSC逐漸失去了干細(xì)胞的典型形態(tài)，在誘導(dǎo)分化后第8天形成了難以辨認(rèn)細(xì)胞核的小細(xì)胞（圖2A）。分化后第16天，這些細(xì)胞聚集形成玫瑰花結(jié)或山丘狀突起，最終懸浮于培養(yǎng)液中形成NSC球（圖2A）。隨后，本研究檢測(cè)了該球形細(xì)胞團(tuán)是否是NSC，分離了細(xì)胞團(tuán)并采用免疫熒光染色方法檢查了NSC特異性標(biāo)志物的表達(dá)，包括PAX6、nestin、SOX1和SOX2。結(jié)果表明iPSC在誘導(dǎo)分化16 d后可能形成NSC（圖2B）。在培養(yǎng)液中加入0.1 ng/L BDNF、0.1 ng/L GDNF和0.1 ng/L cAMP，進(jìn)一步將這些NSC誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)細(xì)胞，包括神經(jīng)元（TUJ1標(biāo)記未成熟的神經(jīng)元、MAP-2是成熟神經(jīng)元的標(biāo)志物）和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP是一種星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物），見(jiàn)圖2C。

3　定向分化神經(jīng)細(xì)胞的阿爾茲海默病相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)情況

本研究成功地將正常對(duì)照者和AD患者的尿道上皮細(xì)胞重編程成為iPSC，并定向分化為神經(jīng)細(xì)胞。為了驗(yàn)證AD患者來(lái)源的iPSC細(xì)胞系誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞是否能夠作為AD的疾病模型，檢測(cè)了這些神經(jīng)細(xì)胞是否高表達(dá)AD相關(guān)的標(biāo)志物。利用ELISA檢測(cè)AD患者來(lái)源誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞分泌Aβ和磷酸化Tau蛋白的情況。與正常對(duì)照相比，AD患者來(lái)源的神經(jīng)細(xì)胞分泌的Aβ1-40和Aβ1-42水平?jīng)]有顯著差異（>0.05）。通過(guò)檢測(cè)兩組間的Aβ1-42與Aβ1-40的比率表明AD組和對(duì)照組之間沒(méi)有顯著的差異（>0.05）。此外，ELISA方法進(jìn)一步檢測(cè)到AD患者和對(duì)照的神經(jīng)細(xì)胞分泌的t-Tau和p-Tau水平并沒(méi)有顯著差異。同時(shí)，與正常對(duì)照的細(xì)胞相比，t-Tau與p-Tau的比率也沒(méi)有顯著差異（>0.05），見(jiàn)圖3。

Figure 3.Examination of AD-associated markers secreted by iPSC-induced neural cells. Mean±SD. n=3.

4　尿上皮細(xì)胞來(lái)源的iPSC對(duì)阿爾茨海默病進(jìn)行細(xì)胞建模

本研究后續(xù)將基因（與家系A(chǔ)D的致病機(jī)理有關(guān)）過(guò)表達(dá)于尿道上皮細(xì)胞來(lái)源的iPSC中。結(jié)果表明過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系中表達(dá)量高于正常對(duì)照細(xì)胞（UMC3）。隨后，進(jìn)一步驗(yàn)證了編碼的蛋白β-secretase 1在iPSC誘導(dǎo)分化的NSC和神經(jīng)細(xì)胞中高表達(dá)。此外，本研究檢測(cè)到iPSC過(guò)表達(dá)細(xì)胞系中的AD相關(guān)標(biāo)志物Aβ1-42有較高的表達(dá)水平（<0.05），見(jiàn)圖4。

Figure 4.Establishment of AD model using urethral epithelial cells-derived iPSC. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs UMC3.

討論

人口老齡化是近年來(lái)嚴(yán)峻的問(wèn)題，也是導(dǎo)致老年人癡呆重要的危險(xiǎn)因素。阿爾茲海默病是老年癡呆的常見(jiàn)的原因，因此，針對(duì)AD的發(fā)病機(jī)制研究和藥物研發(fā)顯得極其緊迫。但是，目前臨床上治療AD的藥物僅能緩解患者的癥狀，并不能延緩疾病的進(jìn)展。之所以治療AD藥物的研發(fā)進(jìn)展緩慢，是因?yàn)槠浯_切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。目前對(duì)于AD的病理變化的認(rèn)識(shí)，僅來(lái)源于患者尸體的解剖分析，而這些檢測(cè)結(jié)果只能說(shuō)明疾病的終末狀態(tài)病理改變，卻不能闡述真正的病理生理變化。隨著iPSC技術(shù)的日漸成熟，基于該技術(shù)構(gòu)建疾病模型等研究具有應(yīng)用前景。本研究成功地將三名AD患者和兩名正常對(duì)照者的尿道上皮細(xì)胞重新編程為iPSC，并定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干性細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞。此前，也有研究者將AD患者皮膚成纖維細(xì)胞重編程成iPSC［9］，但是該方法體細(xì)胞的獲得具有侵入性。然而，本研究通過(guò)采集AD患者的尿道上皮細(xì)胞是無(wú)創(chuàng)的，這種方式對(duì)于AD患者及其家屬來(lái)說(shuō)更容易被接受。由此可見(jiàn)，AD患者尿道上皮細(xì)胞很可能是重編程的細(xì)胞來(lái)源。外源質(zhì)粒的表達(dá)水平會(huì)在傳代超過(guò)10代后最終被稀釋掉［10］。本研究也驗(yàn)證體外的四種重編程因子（OCT4、SOX2、KLF4和SV40LT）并未整合到AD患者和正常對(duì)照的尿道上皮來(lái)源細(xì)胞系（超過(guò)10次傳代）的內(nèi)源基因組中。雖然本研究結(jié)果顯示AD患者來(lái)源的iPSC細(xì)胞系中干細(xì)胞特異性標(biāo)志物表達(dá)水平與人胚胎干細(xì)胞H1細(xì)胞系存在差異，但是對(duì)照組（UE019和UE009P2）中干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平也與H1細(xì)胞系不同。類似的結(jié)果也被 Israel等［11］報(bào)道過(guò)。這些差異可能是由于不同iPSC細(xì)胞系本身的變異引起的，而不是由AD發(fā)病機(jī)制引起的。

本項(xiàng)目進(jìn)一步將iPSC定向分化成為NSC和神經(jīng)細(xì)胞，試圖構(gòu)建AD疾病模型。Aβ1-40、Aβ1-42及Aβ1-42與Aβ1-40的比率增加是提示AD相關(guān)的重要生物標(biāo)志物［12］。此外，Tau蛋白的過(guò)度磷酸化和神經(jīng)纖維纏結(jié)形成是AD患者腦組織中的標(biāo)志性的病理改變［13］。但是，通過(guò)檢測(cè)AD患者來(lái)源誘導(dǎo)分化60天后的神經(jīng)細(xì)胞分泌AD表型相關(guān)標(biāo)志物水平（Aβ和磷酸化的Tau蛋白）觀察到來(lái)源于AD患者和正常對(duì)照者的神經(jīng)細(xì)胞分泌這些蛋白的水平?jīng)]有顯著差別，這些結(jié)果提示AD患者來(lái)源的iPSC誘導(dǎo)分化60天后的神經(jīng)細(xì)胞具有相對(duì)正常的AD相關(guān)蛋白譜表達(dá)水平。這同時(shí)也可能提示AD患者來(lái)源的iPSC作為細(xì)胞治療的潛能。此外，這一結(jié)果并不能完全否認(rèn)AD患者來(lái)源的iPSC作為AD研究模型的可能性。據(jù)報(bào)道神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化時(shí)間大約需要21～90天［7， 11］，而本研究誘導(dǎo)分化了60天，這有可能提示該細(xì)胞系尚未完全分化成為神經(jīng)細(xì)胞；AD患者的發(fā)病需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，這使得神經(jīng)細(xì)胞的定向分化可能需要更長(zhǎng)的時(shí)間（或許大于90天）才能達(dá)到模擬AD起病的作用。2012年，Israel等［11］重編程了2例家系A(chǔ)D患者和2例散發(fā)AD患者來(lái)源的iPSC，也成功地誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)細(xì)胞，兩例家系患者和一例散發(fā)患者來(lái)源的iPSC誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞表現(xiàn)出與AD表型相關(guān)的標(biāo)志物水平上調(diào)。然而，這項(xiàng)研究結(jié)果有1例散發(fā)AD患者來(lái)源神經(jīng)細(xì)胞分泌的AD相關(guān)標(biāo)志物（Aβ1-40和磷酸化Tau蛋白）的水平并沒(méi)有增高。散發(fā)AD患者來(lái)源的神經(jīng)細(xì)胞分泌的AD相關(guān)標(biāo)志物與正常對(duì)照沒(méi)有明顯差異［11， 14］，這可能由于散發(fā)AD患者的異質(zhì)性導(dǎo)致其iPSC誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)不同的表型。其實(shí)，家系A(chǔ)D患者相對(duì)罕見(jiàn)（大約占AD患者的1%～2%），而由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用的散發(fā)性AD占絕大多數(shù)［15-16］。但是，目前的研究?jī)H包含了很小樣本的散發(fā)AD患者，這在很大程度上限制了散發(fā)AD表型的探索。因此，建立散發(fā)AD患者特異性iPSC細(xì)胞庫(kù)對(duì)于全面了解AD發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

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Potential Alzheimer disease model of induced pluripotent stem cells derived from urethral epithelial cells

WANG Ni1， LIU Shun-jie1， MENG Yang-yang1， LEI Qing-feng1， WEI Rui1，2， LI Zhong1，3，4△

（1，，，501655，；2，，510530，；3，，，510080，；4，，518057，）

Alzheimer disease （AD） is the most common neurodegenerative disorder. There is currently no effective treatment for AD， which may be attributed in part to lack of effective AD models. A non-invasive method to generate induced pluripotent stem cells （iPSC） from urethral epithelial was used in current study.Urethral epithelial cells from three male AD patients and two male normal subjects were reprogrammed into iPSC. iPSC are tested by alkaline phosphatase （AP） staining， RT-qPCR， and teratoma. Then the iPSC was induced into neural cells. ELISA was used to test AD-associated markers secreted by neural cells. Meanwhile，gene was over-expressed in iPSC and AD-associated marker was examined by ELISA.The urethral epithelial cells were successfully reprogrammed into iPSC， which can differentiate into tissues derived from three different germ layers. There is no significance in secreted AD-associated markers between neural cells and iPSC （>0.05）. However， over-expression ofin iPSC and its neural differentiation cells expressed higher level of AD-associated marker than controls （0.05）.Urethral epithelial cells from AD patient urine samples are reprogrammed into iPSCs. Over-expression ofgene in iPSC stimulate the expression of AD-related markers， suggesting it is an ideal disease model for AD .

Alzheimer disease； Urethral epithelial cells； Induced pluripotent stem cells； Neural differentiation；gene

R363.2； R741.02

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.03.013

1000-4718（2022）03-0487-08

2021-09-14

2022-02-10

［基金項(xiàng)目］廣東省自然科學(xué)基金（No. 2020A1515010111）

Tel： 020-38254072； E-mail： lzhong@mail.sysu.edu.cn

（責(zé)任編輯：盧萍，余小慧）