王旎， 劉舜杰， 孟洋陽， 雷清鋒， 韋睿，2， 李中，3，4△

源于尿道上皮細(xì)胞的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞構(gòu)建阿爾茨海默病研究模型*

王旎1， 劉舜杰1， 孟洋陽1， 雷清鋒1， 韋睿1，2， 李中1，3，4△

（1中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院神經(jīng)科，廣東 廣州 510655；2中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究所， 廣東 廣州 510530；3廣東省腦功能與腦疾病重點實驗室，廣東 廣州 510080；4中山大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518057）

阿爾茨海默?。ˋD）是常見的神經(jīng)退行性疾病之一，目前仍未有理想的研究模型，這使得其發(fā)病機制尚不完全清楚。因此，本研究將利用非侵襲性方法收集的尿道上皮細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）從而構(gòu)建AD疾病研究模型。本研究選取3名男性AD患者作為實驗組和2名正常男性作為對照者組，通過分離實驗組和對照組的尿道上皮細(xì)胞，并將其重編程成為iPSC，利用堿性磷酸酶染色、RT-qPCR及畸胎瘤形成實驗等驗證其干細(xì)胞特性。隨后將iPSC定向神經(jīng)分化成為神經(jīng)細(xì)胞，采用ELISA方法驗證AD特異性標(biāo)志物的表達(dá)水平。同時，將基因在iPSC細(xì)胞系中過表達(dá)，采用ELISA方法驗證AD特異性標(biāo)志物的表達(dá)水平，以上實驗每組研究對象均進(jìn)行2～3次重復(fù)實驗。尿道上皮細(xì)胞被成功地重編程成iPSC，且具有分化為三種不同胚層來源組織的多能性。定向分化患者來源的神經(jīng)細(xì)胞分泌AD標(biāo)志物的水平與正常對照比較沒有顯著差異（>0.05）。但是，過表達(dá)后的iPSC細(xì)胞系和分化的神經(jīng)細(xì)胞，AD相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)水平較對照組顯著增高（<0.05），說明該細(xì)胞系作為AD模型的可行性。本研究成功地將AD患者的尿道上皮細(xì)胞重編程為iPSC，并將其與正常來源的iPSC進(jìn)行比較，觀察到患者來源的iPSC具有相對正常的蛋白表達(dá)譜，提示該細(xì)胞的臨床應(yīng)用價值。同時，過表達(dá)基因的iPSC能檢測到高表達(dá)的AD相關(guān)標(biāo)志物，提示該細(xì)胞可以作為研究AD發(fā)病機制的細(xì)胞模型。

阿爾茨海默??；尿道上皮細(xì)胞；誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；神經(jīng)分化；基因

阿爾茨海默病（Alzheimer disease， AD）是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一，同時也是導(dǎo)致老年性癡呆最常見的原因之一。目前，全球罹患AD的病人大約有3.5億，而該數(shù)據(jù)預(yù)計每20年將會翻1倍［1］。研究表明衰老是AD發(fā)病的最大危險因素［1］，同時有調(diào)查顯示85歲以上的老人中AD的患病率可高達(dá)30%以上［2］。明確AD發(fā)病機制是尋找新的更有效的治療方案前提之一，而發(fā)病機制的研究依賴于理想的疾病研究模型。之所以AD發(fā)病機制的研究和相關(guān)的藥物研發(fā)不盡人意，其重要原因之一在于缺乏理想的疾病模型。早在20世紀(jì)70年代，研究者對AD患者尸體進(jìn)行解剖檢測到腦內(nèi)有特殊的淀粉樣斑塊和神經(jīng)纖維纏結(jié)。后續(xù)的研究表明其主要成分為β淀粉樣蛋白（β-amyloid， Aβ）和磷酸化的Tau蛋白［3］。但是，這些病變只提示了疾病終末狀態(tài)，卻無法解釋淀粉樣斑塊和神經(jīng)纖維纏結(jié)如何形成的。由于活體標(biāo)本無法獲得的局限性，研究者只能通過構(gòu)建動物模型和細(xì)胞模型來探索其發(fā)病機制。

常用的動物模型有加速衰老動物模型，可以通過手術(shù)或神經(jīng)毒性藥物損毀紋狀體區(qū)域神經(jīng)元從而構(gòu)建有癡呆狀態(tài)的模型，也可以導(dǎo)入家系A(chǔ)D突變基因（、、等）的轉(zhuǎn)基因動物模型等。前者僅僅模擬了認(rèn)知障礙的臨床表現(xiàn)，并沒有引入AD的致病過程，因此對于機制的研究意義不大。由于越來越多的家系A(chǔ)D和相關(guān)的致病基因（、、）被發(fā)現(xiàn)［4］，研究者們將該致病基因?qū)雱游矬w內(nèi)從而建立AD疾病模型。但是，由于種屬間的差異性，該模型也具有一定的局限性。例如，轉(zhuǎn)基因小鼠高表達(dá)了Aβ，在其腦組織內(nèi)可觀察到淀粉樣斑塊形成，但該模型腦內(nèi)的神經(jīng)纖維纏結(jié)形成卻尚未有相關(guān)報道［5］，這也限制了該小鼠模型的疾病機制研究。也有一些細(xì)胞模型被用于研究AD的發(fā)病機制，主要包括：來源于神經(jīng)腫瘤的細(xì)胞株（如人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞系）和動物胚胎腦組織中分離出的原代神經(jīng)細(xì)胞。不過這些模型仍有其不足之處。首先，雖然人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞系來源于人神經(jīng)細(xì)胞，但它屬于腫瘤細(xì)胞與正常神經(jīng)細(xì)胞仍具有區(qū)別。其次，胎腦分離的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較少，很難對其進(jìn)行基因改造后建立成熟的細(xì)胞系。因此，由于AD疾病模型存在著種種問題，這阻礙了疾病研究進(jìn)展和藥物研發(fā)。這樣使得我們需要尋求新的技術(shù)來建立更準(zhǔn)確的疾病模型。

近年來，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell， iPSC）技術(shù)的誕生為疾病的研究提供了新的思路。從患者體細(xì)胞重編程獲得的iPSC攜帶了患者來源的疾病特異性治病基因，這樣的細(xì)胞具有多向分化潛能和克隆性是建立疾病模型的潛在細(xì)胞來源和良好工具。例如，Yagi等［6］利用帶有和基因突變的家系A(chǔ)D患者的體細(xì)胞（成纖維細(xì)胞）重編程成為iPSC，將其誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞并檢測到高表達(dá)的Aβ。該研究首次證明了家系A(chǔ)D患者來源的iPSC誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞可能作為家系A(chǔ)D發(fā)病機制的研究模型。另外，Kondo等利用1例散發(fā)AD患者的體細(xì)胞重編程成為iPSC和誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞，也觀察到類似的結(jié)果，即Aβ寡聚體形成［7］。這提示利用重編程技術(shù)構(gòu)建的iPSC和定向分化的神經(jīng)細(xì)胞具有模擬疾病發(fā)生發(fā)展的潛能。因此，本項工作旨在利用iPSC技術(shù)構(gòu)建阿爾茨海默病的研究模型。

材料和方法

1　材料

本研究的尿道上皮細(xì)胞來自于2名正常者對照和3名AD患者，均獲得本人或家屬同意并簽字知情同意書，具體信息詳見表1。本研究所用的人胚胎干細(xì)胞（H1）、正常iPSC（UMC3）和過表達(dá)的iPSC（UMC3-21）由廣州生物醫(yī)藥與健康研究院惠贈。本研究iPSC及其定向神經(jīng)分化實驗等獲得廣州生物醫(yī)藥與健康研究院動物實驗中心倫理委員會審批。

表1　細(xì)胞捐贈者信息

2　方法

2.1尿道上皮細(xì)胞培養(yǎng)收集中段尿液400×離心10 min，棄上清后用PBS清洗1次后400×離心10 min。將清洗后的尿液細(xì)胞重懸于3 mL的培養(yǎng)液并接種于6孔板（預(yù)先明膠鋪板）中，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

2.2尿道上皮細(xì)胞重編程與iPSC純化用0.25% Trypsin-EDTA消化尿道上皮細(xì)胞并離心（200×，5 min），重懸于電轉(zhuǎn)反應(yīng)液和相應(yīng)體積的pCEP4-E02S-ET2K和pCEP4-has-miR-302-367 cluster質(zhì)粒的混合液中。用于重編程的質(zhì)粒由廣州生物醫(yī)藥與健康研究院惠贈。將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯中，使用LONZA電轉(zhuǎn)儀（Nucleofector? 2b Device，AAB-1001）及其配套的電轉(zhuǎn)試劑盒（LONZA Primary Cell Nucleofector? Kit，VVPI-1005）進(jìn)行電轉(zhuǎn)，將電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入包被好Matrigel膠的6孔板內(nèi)，繼續(xù)置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，需每日換液。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時予以傳代并繼續(xù)放入37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。由于干細(xì)胞具有分化潛能，在增殖過程中可能出現(xiàn)分化。若出現(xiàn)非iPSC細(xì)胞形態(tài)時，加入膠原酶Ⅳ消化60 min，將漂起的iPSC收集，離心后種植于新的培養(yǎng)板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， AP）染色移出培養(yǎng)液后用PBS清洗細(xì)胞，加入4% PFA室溫固定2 min后，用TBST緩沖液洗三次后去除液體。加AP緩沖液（BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒）室溫染色5 min后，加入顯色液避光作用15 min。PBS洗3次后加入甘油在顯微鏡下觀察拍照。

2.4核型鑒定選取生長密度約60%～80%的iPSC，加入秋水仙素（終濃度為0.2 g/L）后繼續(xù)置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育130 min。PSB洗2次后加入0.25% Trpsin-EDTA胰酶消化，使其分離成單個細(xì)胞后離心去上清。加入預(yù)熱的氯化鉀溶液（0.075 mol/L，37 ℃）重懸細(xì)胞并置37 ℃水浴處理20 min后，加入新鮮配制固定液（甲醇∶冰醋酸比例為3∶1），固定3 min后離心（1 000×，5 min）棄上清，再次加入固定液，置于37 ℃水浴箱中固定40 min。離心后棄上清后重懸細(xì)胞并滴片轉(zhuǎn)移至75℃烘箱，烤片3 h。0.5%胰蛋白酶消化液處理8 s后迅速放入生理鹽水終止消化。Giemsa染液染色處理5 min后自來水輕輕沖洗并吹干，隨后在電動正置顯微鏡下觀察和分析核型。

2.5實時熒光定量PCR根據(jù)產(chǎn)品說明書抽提總RNA，每孔加入1 mL的Trizol室溫裂解5分鐘，加入200 μL氯仿冰上孵育15 min后離心（10 000×，10 min）取上清轉(zhuǎn)移至新EP管。加入1 mL的無水乙醇離心（10 000×，10m in）后用1 mL的75%乙醇洗沉淀。離心（7 500×，10 min）后去上清，加入DEPC水溶解RNA并測定濃度。根據(jù)產(chǎn)品說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)產(chǎn)品說明書檢測三個內(nèi)源性多能性標(biāo)志物［八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（octamer-binding transcription factor 4， OCT4）、SRY盒轉(zhuǎn)錄因子2（SRY-box transcription factor 2， SOX2）和同源框蛋白NANOG］的表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參照。該實驗重復(fù)3次。所用引物序列如下：OCT4的上游引物序列為5'-GACGCCATCAACACCGAGTT-3'，下游引物序列為5'-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3'；SOX2的上游引物序列為5'-CCCAGCAGACTTCACATGT-3'，下游引物序列為5'-CCTCCCATTTCCCTCGTTTT-3'；NANOG的上游引物序列為5'-TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT-3'，下游引物序列為5'-AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG-3'；GAPDH的上游引物序列為5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引物序列為5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。

2.6畸胎瘤形成試驗本研究用于畸胎瘤試驗的8～12周齡的NOD-SCID免疫缺陷小鼠（品系代碼406，Elite/SPF級）購買于廣州生物醫(yī)藥與健康研究院動物實驗中心，共20只。將凍存的細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)約3×106以上）復(fù)蘇后，用Matrigel溶液重懸并注射入小鼠體內(nèi)，注射每只小鼠雙后肢，大約1個月后可見畸胎瘤長出。待畸胎瘤直徑約為1 cm時處死小鼠進(jìn)行HE染色觀察三個胚層典型的組織。本研究動物實驗已通過廣州生物醫(yī)藥與健康研究院動物實驗中心倫理委員會審批。

2.7iPSC定向分化為神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell， NSC）與鑒定將未分化的iPSC接種于Matrigel包被的6孔板中，當(dāng)密度達(dá)到60%～70%時更換為神經(jīng)分化培養(yǎng)基，開始誘導(dǎo)其向NSC分化。在分化的第8 天停止加入兩個抑制劑SB431542（Sigma）和dorsomorpin（Sigma）。分化后第16天可見神經(jīng)花環(huán)結(jié)構(gòu)形成或隆起的小丘狀。用免疫熒光鑒定NSC特異性標(biāo)志物［配對盒蛋白6（paired box 6， PAX6）、SRY盒轉(zhuǎn)錄因子1（SRY-box transcription factor 1， SOX1）、SOX2和巢蛋白（nestin）］的表達(dá)情況?？贵w信息如下：PAX6（1∶1 000，Millipore-AB2237），nestin（1∶1 000，Millipore-MAB5326），SOX1（1∶1 000，Abcam-ab87775），SOX2（1∶1 000，Abcam-ab97959）。

2.8誘導(dǎo)NSC向神經(jīng)細(xì)胞分化及鑒定為了明確尿道上皮細(xì)胞來源的iPSC是否能定向分化為神經(jīng)細(xì)胞，本研究參考文獻(xiàn)報道將尿道上皮來源的iPSC誘導(dǎo)分化為NSC［8］。NSC正常傳代1～2次后用accutase消化成為單個細(xì)胞，以每孔1×105個的密度接種于Matrigel包被的12孔板內(nèi)，隔天換液。利用免疫熒光方法鑒定分化60 d后神經(jīng)細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志物［TUJ1、微管相關(guān)蛋白2（microtubule-associated protein 2， MAP2）和膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein， GFAP）］的表達(dá)情況。抗體信息如下：TUJ1（1∶1 000，Sigma-MAB1637），MAP2（1∶500，Sigma-M4403），GFAP（1∶1 000，Millipore-AB5804）。

2.9ELISA分化60 d后的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)于12孔板中，加入1 mL培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后取上清。根據(jù)ELISA試劑盒說明書，檢測Aβ1-40、Aβ1-42、總Tau和p-Tau水平。將100 μL抗體標(biāo)記液加入孔中室溫孵育60 min后，清洗三次移除上清。加入顯色溶液避光室溫孵育30 min。加入終止液停止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀測定450 nm波長的吸光度。同時收集細(xì)胞并提取總蛋白并檢測其濃度，對結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，該實驗重復(fù)3次。

3　統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。Shapiro-Wilk方法判斷數(shù)據(jù)是否為正態(tài)分布，Levene方法判斷各組數(shù)據(jù)間是否方差齊性。對于正態(tài)分布且方差齊性的數(shù)據(jù)，使用單因素方差分析來比較組間差異，若單因素方差分析結(jié)果提示<0.05，則進(jìn)一步使用LSD-檢驗進(jìn)行組間兩兩比較。若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或非方差齊性，則使用Kruskal-Wallis方法分析比較組間差異，若結(jié)果提示<0.05，則進(jìn)一步使用Bonferroni法進(jìn)行組間兩兩比較，以<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1　尿道上皮細(xì)胞重編程的iPSC

從3名臨床表型典型的AD患者和2名同年齡段的正常對照者的中段尿液中分離和培養(yǎng)了尿道上皮細(xì)胞（圖1A）。利用電轉(zhuǎn)技術(shù)轉(zhuǎn)染了編碼4種轉(zhuǎn)錄因子（OCT4、KLF4、NANOG和SV40LT）的外源質(zhì)粒，對尿道上皮細(xì)胞進(jìn)行重新編程。重編程的尿道上皮細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后第7天逐漸聚集，形態(tài)從紡錘狀變?yōu)閳A形（圖1B）。在轉(zhuǎn)染后18～21 d細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)出典型的iPSC，并采用堿性磷酸酶染色檢查方法判斷出該細(xì)胞具有多克隆性（圖1C）。通過對體外的4種重編程因子（OCT4、SOX2、KLF4和SV40LT）進(jìn)行PCR擴增和凝膠電泳證實外源質(zhì)粒的DNA并未整合入iPSC中（圖1D）。此外，通過對不同個體來源的iPSC進(jìn)行核型分析，并將具有正常核型的iPSC用于后續(xù)研究（圖1E）。

隨后，通過檢測OCT4、SOX2和NANOG（三個常用的干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物）的mRNA表達(dá)水平，進(jìn)一步驗證了正常核型的iPSC細(xì)胞系的干細(xì)胞特性，該實驗將人類胚胎干細(xì)胞（H1細(xì)胞）作為陽性對照（圖1F）。實驗結(jié)果表明不論正常對照來源的iPSC，還是AD患者來源的iPSC細(xì)胞系表達(dá)OCT4、SOX2和NANOG的水平與H1細(xì)胞沒有顯著差異（圖1F）。這說明了重編程iPSC細(xì)胞系具備干細(xì)胞的特性。此外，將iPSC注射到8～12周齡的NOD-SCID小鼠雙側(cè)后肢?；チ鲂纬珊筇幩佬∈?，HE染色分析畸胎瘤的組織成分證實了重編程的iPSC細(xì)胞系具有體內(nèi)分化為三個原始層的能力，包括來源于外胚層的神經(jīng)組織、來源于中胚層的肌肉組織、和來源于內(nèi)胚層的消化腺（圖1G）。

Figure 1.iPSC derived from urethral epithelial cells of the AD patients. A： morphological changes of urethral epithelial cells； B： morphological changes of iPSC； C： alkaline phophatase staining； D： PCR identification of non-integration of episomal DNA （the episomal plasmid pCEP4-EO2SET2K is used as a positive control）； E： normal karyotype of AD patient-derived cell lines； F： endogenous hESC-specific gene expression in iPSCs from patients （ADM01， ADM02 and ADM03） and controls （UE019 and UE009P2） by real-time qPCR （mean±SD； n=3）； G： HE staining of iPSCs-formed teratomas in the NOD-SCID mice.

2　iPSC誘導(dǎo)分化的NSC和神經(jīng)細(xì)胞

正常對照與AD患者來源分化形成的iPSC在形態(tài)學(xué)方面沒有明顯差異。在此過程中，iPSC逐漸失去了干細(xì)胞的典型形態(tài)，在誘導(dǎo)分化后第8天形成了難以辨認(rèn)細(xì)胞核的小細(xì)胞（圖2A）。分化后第16天，這些細(xì)胞聚集形成玫瑰花結(jié)或山丘狀突起，最終懸浮于培養(yǎng)液中形成NSC球（圖2A）。隨后，本研究檢測了該球形細(xì)胞團是否是NSC，分離了細(xì)胞團并采用免疫熒光染色方法檢查了NSC特異性標(biāo)志物的表達(dá)，包括PAX6、nestin、SOX1和SOX2。結(jié)果表明iPSC在誘導(dǎo)分化16 d后可能形成NSC（圖2B）。在培養(yǎng)液中加入0.1 ng/L BDNF、0.1 ng/L GDNF和0.1 ng/L cAMP，進(jìn)一步將這些NSC誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)細(xì)胞，包括神經(jīng)元（TUJ1標(biāo)記未成熟的神經(jīng)元、MAP-2是成熟神經(jīng)元的標(biāo)志物）和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP是一種星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物），見圖2C。

3　定向分化神經(jīng)細(xì)胞的阿爾茲海默病相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)情況

本研究成功地將正常對照者和AD患者的尿道上皮細(xì)胞重編程成為iPSC，并定向分化為神經(jīng)細(xì)胞。為了驗證AD患者來源的iPSC細(xì)胞系誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞是否能夠作為AD的疾病模型，檢測了這些神經(jīng)細(xì)胞是否高表達(dá)AD相關(guān)的標(biāo)志物。利用ELISA檢測AD患者來源誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞分泌Aβ和磷酸化Tau蛋白的情況。與正常對照相比，AD患者來源的神經(jīng)細(xì)胞分泌的Aβ1-40和Aβ1-42水平?jīng)]有顯著差異（>0.05）。通過檢測兩組間的Aβ1-42與Aβ1-40的比率表明AD組和對照組之間沒有顯著的差異（>0.05）。此外，ELISA方法進(jìn)一步檢測到AD患者和對照的神經(jīng)細(xì)胞分泌的t-Tau和p-Tau水平并沒有顯著差異。同時，與正常對照的細(xì)胞相比，t-Tau與p-Tau的比率也沒有顯著差異（>0.05），見圖3。

Figure 3.Examination of AD-associated markers secreted by iPSC-induced neural cells. Mean±SD. n=3.

4　尿上皮細(xì)胞來源的iPSC對阿爾茨海默病進(jìn)行細(xì)胞建模

本研究后續(xù)將基因（與家系A(chǔ)D的致病機理有關(guān)）過表達(dá)于尿道上皮細(xì)胞來源的iPSC中。結(jié)果表明過表達(dá)的細(xì)胞系中表達(dá)量高于正常對照細(xì)胞（UMC3）。隨后，進(jìn)一步驗證了編碼的蛋白β-secretase 1在iPSC誘導(dǎo)分化的NSC和神經(jīng)細(xì)胞中高表達(dá)。此外，本研究檢測到iPSC過表達(dá)細(xì)胞系中的AD相關(guān)標(biāo)志物Aβ1-42有較高的表達(dá)水平（<0.05），見圖4。

Figure 4.Establishment of AD model using urethral epithelial cells-derived iPSC. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs UMC3.

討論

人口老齡化是近年來嚴(yán)峻的問題，也是導(dǎo)致老年人癡呆重要的危險因素。阿爾茲海默病是老年癡呆的常見的原因，因此，針對AD的發(fā)病機制研究和藥物研發(fā)顯得極其緊迫。但是，目前臨床上治療AD的藥物僅能緩解患者的癥狀，并不能延緩疾病的進(jìn)展。之所以治療AD藥物的研發(fā)進(jìn)展緩慢，是因為其確切的發(fā)病機制尚不清楚。目前對于AD的病理變化的認(rèn)識，僅來源于患者尸體的解剖分析，而這些檢測結(jié)果只能說明疾病的終末狀態(tài)病理改變，卻不能闡述真正的病理生理變化。隨著iPSC技術(shù)的日漸成熟，基于該技術(shù)構(gòu)建疾病模型等研究具有應(yīng)用前景。本研究成功地將三名AD患者和兩名正常對照者的尿道上皮細(xì)胞重新編程為iPSC，并定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干性細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞。此前，也有研究者將AD患者皮膚成纖維細(xì)胞重編程成iPSC［9］，但是該方法體細(xì)胞的獲得具有侵入性。然而，本研究通過采集AD患者的尿道上皮細(xì)胞是無創(chuàng)的，這種方式對于AD患者及其家屬來說更容易被接受。由此可見，AD患者尿道上皮細(xì)胞很可能是重編程的細(xì)胞來源。外源質(zhì)粒的表達(dá)水平會在傳代超過10代后最終被稀釋掉［10］。本研究也驗證體外的四種重編程因子（OCT4、SOX2、KLF4和SV40LT）并未整合到AD患者和正常對照的尿道上皮來源細(xì)胞系（超過10次傳代）的內(nèi)源基因組中。雖然本研究結(jié)果顯示AD患者來源的iPSC細(xì)胞系中干細(xì)胞特異性標(biāo)志物表達(dá)水平與人胚胎干細(xì)胞H1細(xì)胞系存在差異，但是對照組（UE019和UE009P2）中干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平也與H1細(xì)胞系不同。類似的結(jié)果也被 Israel等［11］報道過。這些差異可能是由于不同iPSC細(xì)胞系本身的變異引起的，而不是由AD發(fā)病機制引起的。

本項目進(jìn)一步將iPSC定向分化成為NSC和神經(jīng)細(xì)胞，試圖構(gòu)建AD疾病模型。Aβ1-40、Aβ1-42及Aβ1-42與Aβ1-40的比率增加是提示AD相關(guān)的重要生物標(biāo)志物［12］。此外，Tau蛋白的過度磷酸化和神經(jīng)纖維纏結(jié)形成是AD患者腦組織中的標(biāo)志性的病理改變［13］。但是，通過檢測AD患者來源誘導(dǎo)分化60天后的神經(jīng)細(xì)胞分泌AD表型相關(guān)標(biāo)志物水平（Aβ和磷酸化的Tau蛋白）觀察到來源于AD患者和正常對照者的神經(jīng)細(xì)胞分泌這些蛋白的水平?jīng)]有顯著差別，這些結(jié)果提示AD患者來源的iPSC誘導(dǎo)分化60天后的神經(jīng)細(xì)胞具有相對正常的AD相關(guān)蛋白譜表達(dá)水平。這同時也可能提示AD患者來源的iPSC作為細(xì)胞治療的潛能。此外，這一結(jié)果并不能完全否認(rèn)AD患者來源的iPSC作為AD研究模型的可能性。據(jù)報道神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化時間大約需要21～90天［7， 11］，而本研究誘導(dǎo)分化了60天，這有可能提示該細(xì)胞系尚未完全分化成為神經(jīng)細(xì)胞；AD患者的發(fā)病需要相當(dāng)長的時間，這使得神經(jīng)細(xì)胞的定向分化可能需要更長的時間（或許大于90天）才能達(dá)到模擬AD起病的作用。2012年，Israel等［11］重編程了2例家系A(chǔ)D患者和2例散發(fā)AD患者來源的iPSC，也成功地誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)細(xì)胞，兩例家系患者和一例散發(fā)患者來源的iPSC誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞表現(xiàn)出與AD表型相關(guān)的標(biāo)志物水平上調(diào)。然而，這項研究結(jié)果有1例散發(fā)AD患者來源神經(jīng)細(xì)胞分泌的AD相關(guān)標(biāo)志物（Aβ1-40和磷酸化Tau蛋白）的水平并沒有增高。散發(fā)AD患者來源的神經(jīng)細(xì)胞分泌的AD相關(guān)標(biāo)志物與正常對照沒有明顯差異［11， 14］，這可能由于散發(fā)AD患者的異質(zhì)性導(dǎo)致其iPSC誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)不同的表型。其實，家系A(chǔ)D患者相對罕見（大約占AD患者的1%～2%），而由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用的散發(fā)性AD占絕大多數(shù)［15-16］。但是，目前的研究僅包含了很小樣本的散發(fā)AD患者，這在很大程度上限制了散發(fā)AD表型的探索。因此，建立散發(fā)AD患者特異性iPSC細(xì)胞庫對于全面了解AD發(fā)病機制具有重要意義。

［1］ GBDD Collaborators. Global， regional， and national burden of Alzheimer's disease and other dementias， 1990-2016： a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016［J］. Lancet Neurol， 2019， 18（1）：88-106.

［2］ Hirtz D， Thurman DJ， Gwinn-Hardy K， et al. How common are the "common" neurologic disorders？［J］. Neurology， 2007， 68（5）：326-337.

［3］ Hart MNJSN. Degenerative diseases of the central nervous system［M］ // Nelson JS， Parisi JE， Schochet SS Jr. Principles and practice of neuropathology. St.Louis： Mosby， 1993：345-349.

［4］ Seshadri S， Fitzpatrick AL， Ikram MA， et al. Genome-wide analysis of genetic loci associated with Alzheimer disease［J］. JAMA， 2010， 303（18）：1832-1840.

［5］ Choi SH， Tanzi RE. iPSCs to the rescue in Alzheimer's research［J］. Cell Stem Cell， 2012， 10（3）：235-236.

［6］ Yagi T， Ito D， Okada Y， et al. Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells ［J］. Hum Mol Genet， 2011， 20（23）：4530-4539.

［7］ Kondo T， Asai M， Tsukita K，et al.Modeling Alzheimer's disease with iPSCs reveals stress phenotypes associated with intracellular Aβ and differential drug responsiveness［J］. Cell Stem Cell， 2013， 12（4）：487-496.

［8］ Chambers SM， Fasano CA， Papapetrou EP， et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling［J］. Nat Biotechnol， 2009， 27（3）：275-280.

［9］ Hossini AM， Megges M， Prigione A， et al. Induced pluripotent stem cell-derived neuronal cells from a sporadic Alzheimer's disease donor as a model for investigating AD-associated gene regulatory networks［J］. BMC Genomics， 2015， 16：84-103.

［10］ Gu H， Huang X， Xu J， Song L， et al. Optimizing the method for generation of integration-free induced pluripotent stem cells from human peripheral blood［J］. Stem Cell Res Ther， 2018， 9（1）：163-172.

［11］ Israel MA， Yuan SH， Bardy C， et al. Probing sporadic and familial Alzheimer's disease using induced pluripotent stem cells［J］. Nature， 2012， 482（7384）：216-220.

［12］ Molinuevo JL， Ayton S， Batrla R， et al. Current state of Alzheimer's fluid biomarkers［J］. Acta Neuropathol， 2018， 136（6）：821-853.

［13］ Iqbal K， Liu F， Gong CX， et al. Mechanisms of tau-induced neurodegeneration［J］. Acta Neuropathol， 2009， 118（1）：53-69.

［14］ Birnbaum JH， Wanner D， Gietl AF， et al. Oxidative stress and altered mitochondrial protein expression in the absence of amyloid-beta and tau pathology in iPSC-derived neurons from sporadic Alzheimer's disease patients［J］. Stem Cell Res， 2018， 27：121-130.

［15］ Chiasseu M， Fesharaki-Zadeh A， Saito T， et al. Gene-environment interaction promotes Alzheimer's risk as revealed by synergy of repeated mild traumatic brain injury and mouse App knock-in ［J］. Neurobiol Dis， 2020， 145：105059.

［16］ Long JM， Holtzman DM. Alzheimer disease： an update on pathobiology and treatment strategies［J］. Cell， 2019， 179（2）： 312-339.

Potential Alzheimer disease model of induced pluripotent stem cells derived from urethral epithelial cells

WANG Ni1， LIU Shun-jie1， MENG Yang-yang1， LEI Qing-feng1， WEI Rui1，2， LI Zhong1，3，4△

（1，，，501655，；2，，510530，；3，，，510080，；4，，518057，）

Alzheimer disease （AD） is the most common neurodegenerative disorder. There is currently no effective treatment for AD， which may be attributed in part to lack of effective AD models. A non-invasive method to generate induced pluripotent stem cells （iPSC） from urethral epithelial was used in current study.Urethral epithelial cells from three male AD patients and two male normal subjects were reprogrammed into iPSC. iPSC are tested by alkaline phosphatase （AP） staining， RT-qPCR， and teratoma. Then the iPSC was induced into neural cells. ELISA was used to test AD-associated markers secreted by neural cells. Meanwhile，gene was over-expressed in iPSC and AD-associated marker was examined by ELISA.The urethral epithelial cells were successfully reprogrammed into iPSC， which can differentiate into tissues derived from three different germ layers. There is no significance in secreted AD-associated markers between neural cells and iPSC （>0.05）. However， over-expression ofin iPSC and its neural differentiation cells expressed higher level of AD-associated marker than controls （0.05）.Urethral epithelial cells from AD patient urine samples are reprogrammed into iPSCs. Over-expression ofgene in iPSC stimulate the expression of AD-related markers， suggesting it is an ideal disease model for AD .

Alzheimer disease； Urethral epithelial cells； Induced pluripotent stem cells； Neural differentiation；gene

R363.2； R741.02

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.03.013

1000-4718（2022）03-0487-08

2021-09-14

2022-02-10

［基金項目］廣東省自然科學(xué)基金（No. 2020A1515010111）

Tel： 020-38254072； E-mail： lzhong@mail.sysu.edu.cn

（責(zé)任編輯：盧萍，余小慧）