曾凡珂，潘蕾蔓，張祎，賴富饒，吳暉，張猛猛

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）

荸薺（Eleocharis dulcis）也稱作馬蹄、鳧茈和水栗等，屬于莎草科（Cyperaceae）水生植物[1]，生長于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是中國南方地區(qū)的重要作物，在廣東和廣西一帶廣泛分布，通常指該植物的可食用部位，也就是它的地下球莖。據統(tǒng)計，在中國荸薺的年均產量超過1.0×106t，荸薺可用來生食、做菜肴或是生產淀粉。荸薺加工的副產物荸薺皮占到整個荸薺球莖質量的20%左右，但在食品加工后通常被廢棄或者充當飼料，經濟附加值低。

多糖可發(fā)揮抗氧化、抑菌、抗炎和提高免疫力等多種生物活性，并且具有親水性強、熱穩(wěn)定和粘度較大等特性，因此在化妝品、食品和醫(yī)藥等領域有較好的應用前景[2]。水溶性多糖也是荸薺皮的重要組成成分，但目前對荸薺皮多糖的研究較少，尤其是對其結構和理化性質的研究還很缺乏，活性方面也只有關于荸薺皮粗多糖的抗氧化活性研究。本實驗室前期已從荸薺皮中分離純化出兩種純化的多糖組分 WVP-1和WVP-2，并對二者的結構和直接清除自由基的能力進行了初步分析。結果表明，WVP-1中可能同時含有線型和分支型多糖分子，且具有類似支鏈淀粉的葡聚糖分子，WVP-2為一種含有同型半乳糖醛酸聚糖（HG）結構的低糖醛酸、果膠類似物。二者均具有氧自由基吸收能力（ORAC）[3]。在此基礎上，本研究繼續(xù)探究WVP-1和WVP-2的晶體特性、熱穩(wěn)定性、Zeta電位和粘度這些理化性質，測定出 WVP-2的酯化度，并基于細胞抗氧化和紅細胞溶血模型進一步探究荸薺皮純化多糖的抗氧化能力。該研究結果可為充分開發(fā)利用荸薺皮資源，開發(fā)新型多糖類產品提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荸薺皮收集自五山市場，荸薺的產地為廣東省韶關市樂昌市北鄉(xiāng)鎮(zhèn)；荸薺皮純化多糖組分WVP-1（中性多糖，純度95.03%，Mw=3.16 ku）和WVP-2（酸性多糖，純度91.61%，糖醛酸含量6.25%，Mw=56.97 ku），實驗室自制；肝癌細胞 HepG2，實驗室保存；2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（AAPH），上海源葉生物科技有限公司；2’,7’-二氯熒光二乙酸（DCFH-DA），美國Sigma-Aldrich公司；抗凝羊血，廣州蕊特生物科技有限公司。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

X’pert Power X射線衍射儀，荷蘭帕納科公司；STA449F3同步熱分析儀，德國耐馳公司；Horibasz-100Z納米顆粒分析儀，日本HORIBA公司；Vertex傅里葉變換紅外光譜儀，德國 Bruker公司；SuPerMax3100多功能酶標儀，上海閃譜生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 X射線衍射光譜（XRD）分析

參考易曉敏[4]的測定方法，WVP-1和WVP-2的晶體結構由X射線衍射儀測得，測定條件為：BB聚焦光路，掃描速度為12 °/min，步長為0.013 °，掃描范圍 2θ為 5 °～70 °。

1.3.2 熱特性分析

同步熱分析儀對WVP-1和WVP-2進行熱重和差式掃描量熱分析。精確稱取一定量的 WVP-1和WVP-2樣品，置于坩堝中，充入 N2，從 30 ℃以10 ℃/min的速率升到500 ℃。

1.3.3 Zeta電位測定

配制濃度為0.5 mg/mL的WVP-1和WVP-2溶液，目測可通過光，用納米顆粒分析儀測定 25 ℃下WVP-1和WVP-2的Zeta電位。

1.3.4 特性粘度測定

將楊蕙[5]的方法稍作修改，選擇毛細管內徑為0.3～0.4 mm的烏氏粘度計測定WVP-1和WVP-2的特性粘度。WVP-1的測試濃度分別為4.00、7.69、11.11和14.29 mg/mL，WVP-2的測試濃度分別為0.60、1.15、1.67、2.14 mg/mL，按照下列公式計算相關粘度：

式中：

T1——蒸餾水流經兩刻度線時間的平均值；

T2——各濃度多糖溶液流經兩刻度線時間的平均值。

求出四個濃度下多糖溶液的各類粘度，并以縱坐標和橫坐標分別為比濃粘度和多糖溶液濃度作圖，擬合出回歸直線與縱坐標的截距即為WVP-1和WVP-2的特性粘度。

1.3.5 酯化度測定

WVP-2酯化度的確定借助紅外光譜法，紅外光譜儀中進行波數(shù) 400～4000 cm-1范圍內的掃描。采用Origin 2017對波數(shù)1730和1640 cm-1附近的特征吸收峰進行分峰擬合，得到對應的峰面積，就可計算出酯化度DE[6]：

式中：

A1640——1640 cm-1處的吸收峰面積；

A1730——1730 cm-1處的吸收峰面積。

1.3.6 細胞抗氧化實驗（CAA，Cellular Antioxidant Activity）

參考張猛猛[7]的方法。測定終濃度為 62.5～1000 μg/mL的WVP-1和WVP-2抑制AAPH誘發(fā)HepG2細胞內ROS水平升高的能力。

96孔板每孔加入100 μL 6×105cells/mL HepG2懸液，并在37 ℃，5% CO2環(huán)境中孵育1 d。1 d過后，去除上清液，用磷酸鹽緩沖溶液PBS清洗細胞數(shù)次。WVP-1或WVP-2培養(yǎng)液和DCFH-DA（50 μmol/L）混合，加入96孔板，孵育2 h。使用普通培養(yǎng)基作為陰性對照組。時間到后，取出細胞培養(yǎng)板，PBS清洗，隨后每孔加入100 μL AAPH工作液（600 μmol/L），發(fā)射和激發(fā)波長分別為485 nm和535 nm，4 min記錄一次熒光強度，連續(xù)記錄1 h。每種樣品設置3個重復孔。

1.3.7 抑制AAPH誘發(fā)的紅細胞氧化溶血

參考孫崇臻[8]的方法。測定WVP-1和WVP-2對AAPH誘導紅細胞氧化溶血的抑制能力，WVP-1和WVP-2 的作用濃度均為 62.5～1000 μg/mL。

測定AAPH誘導的氧化溶血率的過程中，分為陰性對照組、AAPH組、樣品保護組、毒性對照組和全溶血組，各組均取200 μL的紅細胞懸液，分別與200 μL的PBS、不同濃度的多糖溶液和蒸餾水混合，37 ℃，180 r/min振蕩30 min后，分別加入400 μL的PBS、AAPH溶液和蒸餾水，37 ℃，180 r/min振蕩2 h，每管加入5 mL PBS，1200 r/min離心10 min。各組的試劑配方如表1所示。

表1 測定氧化溶血率的試劑配方Table 1 Reagent formula of the determination of hemolysis rate of oxidation

取上述各組的上清液200 μL于96孔板中，測定波長540 nm下的吸光值，各組溶血率的計算公式如下：

式中：

Aa——陰性對照組的吸光值；

Ab——AAPH組的吸光值；

Ac——樣品保護組的吸光值；

Ad——毒性對照組的吸光值；

Ae——全溶血組的吸光值。

1.3.8 數(shù)據處理

采用SPSS 14.0進行顯著性差異分析，若p＜0.05，則視為差異顯著。采用Origin 2017和Excel進行數(shù)據制圖。

2 結果與分析

2.1 荸薺皮純化多糖的理化性質

2.1.1 X射線衍射光譜（XRD）分析

多糖分子可以通過其上豐富的羥基形成氫鍵，在分子內和分子間產生連接，導致其呈現(xiàn)出不同程度的結晶排列以及無定型態(tài)和晶態(tài)之間的轉變[9]。不同的結晶程度會導致多糖分子的拉伸強度、溶解性、形變程度和溶脹特性有差異，多糖多以非結晶的無定型或半結晶形態(tài)存在[10]。結晶程度較高的多糖拉伸強度較大，易于成膜，因此可用于制備可食性薄膜，而無定型態(tài)多糖作為藥品或食品使用時，通常具有較好的溶解性和生物利用度，因此可用于開發(fā)食品微膠囊[11]。本研究采用XRD分析了WVP-1和WVP-2的結晶形態(tài)，結果如圖1所示，在衍射角2θ范圍為5 °～70 °時，WVP-1和WVP-2衍射強度最高峰均出現(xiàn)在20.63 °左右，其峰形圓鈍，峰強度較低，因此WVP-1和WVP-2中結晶區(qū)域的比例較少，主要以無定型態(tài)存在[4]。竇勇博[12]報道白蘆筍下腳料多糖的XRD圖譜衍射峰主要集中在2θ為20 °～30 °范圍內，峰形與荸薺皮多糖接近，結晶程度低，溶解性較好，因此用其開發(fā)的速溶固體飲料品質較好，這暗示著荸薺皮多糖可能也具有這方面的應用價值。

2.1.2 熱特性分析

溫度的變化會對多糖的形態(tài)和結構產生影響，進而影響多糖在貯藏過程中的穩(wěn)定性以及加工性能。因此，本研究利用TG-DSC分析WVP-1和WVP-2的熱穩(wěn)定性。玻璃化溫度Tg為玻璃態(tài)和高彈態(tài)相互轉變時的溫度，是物質發(fā)生軟化前的最高溫度，而熱分解溫度對應分子中氫鍵、C-O鍵和C-C鍵斷裂速度最快時的溫度[13]。如圖2所示，在30～500 ℃的溫度范圍內，荸薺皮多糖WVP-1和WVP-2的質量和熱量變化主要經歷兩個階段。WVP-1的第一階段為28.08～ 160.38 ℃，溫度拐點即Tg為61.30 ℃，WVP-2的第一階段為28.38～121.08 ℃，Tg為69.50 ℃，對應DSC曲線中的一個吸熱峰。WVP-1和WVP-2的Tg高于常溫，可見WVP-1和WVP-2在常溫下均能維持在玻璃態(tài)，在貯藏過程中可保持穩(wěn)定。由TG曲線可知，WVP-1在第一階段的質量損失為9.67%，而WVP-2在第一階段的質量損失為10.61%，這一部分的質量損失主要來自于結合水的散失[14]，這說明凍干后的WVP-2可能比WVP-1具有更好的吸水和保水性。WVP-1和WVP-2的第二階段溫度范圍分別為160.38～346.78 ℃和121.08～342.88 ℃，其中WVP-1的熱分解溫度為290.50 ℃，WVP-2的熱分解溫度為308.50 ℃，對應DTG曲線中的最小值且高于一般的熱殺菌溫度121 ℃，可見WVP-2在高溫下比WVP-1具有更好的熱加工穩(wěn)定性。以上結果說明WVP-1和WVP-2具有良好的熱穩(wěn)定性。

2.1.3 Zeta電位

用于開發(fā)保健飲料的活性多糖通常需要其在水溶液中具有一定的穩(wěn)定性，避免分子絮凝而降低產品的品質。Zeta電位是反映溶液體系穩(wěn)定性的重要指標，一般而言，Zeta電位的絕對值增加，分子間的靜電斥力增大，分子在體系中保持穩(wěn)定分散。如圖3所示，WVP-1的Zeta電位為9.60 mV，而WVP-2的Zeta電位為-18.50 mV，含有糖醛酸的酸性多糖的Zeta電位通常為負值[15]，這與WVP-2糖醛酸含量6.25%的結構特征相一致。WVP-2的 Zeta電位的絕對值高于WVP-1，說明WVP-2在水溶液中發(fā)生絮凝的趨勢弱于WVP-1，更加穩(wěn)定。此外，溶液中多糖分子的帶電情況會影響其形成多層納米薄膜的性能，帶電荷的多糖分子如皂莢種子中的半乳甘露聚糖易通過靜電過程形成薄膜，其 Zeta電位范圍為-13.70～-2.10 mV，WVP-2的Zeta電位絕對值更大，所帶電荷量更多，暗示其在一定程度上也可用于制備納米薄膜，進而運用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領域。

2.1.4 特性粘度

高粘度的多糖可作為增稠劑或膠凝劑，用于調整食品的流動性、可塑性和口感。圖4為多糖溶液濃度與比濃粘度的擬合曲線，由其與縱坐標的截距可計算出WVP-1和WVP-2的特性粘度分別為5.33×10-3和3.80×10-2mL/mg。當聚合物的溶劑、溫度一定時，特性粘度主要與聚合物的相對分子量有關[16]。WVP-2的特性粘度要遠大于WVP-1，這可能與WVP-2的相對分子量Mw（56.97 ku）遠大于WVP-1（3.16 ku）有關[3]。藍高爽[17]報道蒸玉竹和曬玉竹多糖的特性粘度分別為1.66×10-2和5.70×10-3mL/mg，并研制了玉竹山楂蘋果復合飲料和復合多糖類保濕護膚劑，玉竹多糖與WVP-1和WVP-2的特性粘度較為接近，這說明荸薺皮多糖可能也具有作為飲料和化妝品添加劑的前景。

2.1.5 酯化度

根據本實驗室前期對 WVP-2的結構鑒定，發(fā)現(xiàn)其為一種類似果膠的多糖[3]。酯化度是果膠最基本的性質，高酯果膠形成凝膠需要添加大量的蔗糖，而低酯果膠形成凝膠主要依賴于游離羧基和 Ca2+形成“蛋盒”模型。因此，低酯果膠的使用利于制作低糖分、低能量和低甜味的食品，更加符合現(xiàn)代人對健康的追求。由WVP-2紅外光譜（圖5）中1737.81 cm-1和1643.30 cm-1處的吸收峰面積，計算出 WVP-2的DE值為15.00%。DE＜50%的果膠屬于低酯果膠。因此，WVP-2可能具有類似低酯果膠的性質。目前我國具有豐富的高酯果膠資源，而低酯果膠的來源和含量較少。市面上低酯果膠的生產主要依賴于脫酯技術將來自于柑橘皮和蘋果皮中的高酯果膠轉化為低酯果膠[18]。已報道的低酯果膠的天然來源有薜荔籽（DE14.20%，糖醛酸含量 85.47%）、豆腐柴葉（DE14.90%，糖醛酸含量65.48%），其果膠均有較強的膠凝度[19]。因此，荸薺皮有可能作為一種新型的低酯果膠類似物來源。

2.2 荸薺皮多糖抗氧化能力

2.2.1 細胞抗氧化能力

CAA法比直接清除化學類自由基的模型更接近生物機體水平。熒光探針DCFH-DA進入細胞后被細胞酯酶分解為DCFH，AAPH誘發(fā)的過氧自由基攻擊細胞，使細胞質內的ROS水平升高，DCFH被氧化為熒光物 DCH。因此，細胞的熒光強度越大，其中的ROS水平越高。從圖6可知，添加WVP-1和WVP-2后，AAPH誘發(fā)ROS水平隨時間推移而增加的速度有所減緩。濃度在500～1000 μg/mL時，WVP-1抑制細胞內產生 ROS的效果較好。在較低濃度條件下（125～250 μg/mL），WVP-2抑制細胞內產生ROS 的能力要強于WVP-1，說明WVP-2可能比WVP-1具有更好的抗氧化活性。低分子量，高半乳糖、糖醛酸和β-構型比例的多糖通常具有較好的抗氧化活性[20]，WVP-1的分子量較低但糖醛酸、半乳糖和β-構型的比例低于WVP-2，這可能是導致二者抗氧化能力不同的原因。針對CAA模型中多糖的抗氧化機理，實驗過程中WVP-1或WVP-2并未與AAPH直接發(fā)生相互作用，此外多糖樣品作為生物大分子，進入細胞內的效率低，因此抗氧化機理不太可能是多糖直接清除細胞內外的自由基。多糖可能是通過與細胞膜上的特定受體結合后形成保護膜或是誘發(fā)細胞內一系列的抗氧化通路從而發(fā)揮抗氧化功能的。

2.2.2 抑制AAPH誘發(fā)的紅細胞氧化溶血

紅細胞細胞膜受到自由基的攻擊后發(fā)生脂質氧化破裂，造成溶血現(xiàn)象。如圖7所示，在沒有抗氧化劑保護時，紅細胞遭受AAPH攻擊而破裂溶血的比率達到49.02%。無AAPH存在時，62.5～1000 μg/mL各濃度下WVP-1和WVP-2導致的溶血率與陰性對照組之間均無顯著差異（p＞0.05），說明該濃度范圍內的WVP-1和WVP-2不會導致紅細胞膜破裂。與AAPH組相比，除1000 μg/mL的WVP-1外，62.5～1000 μg/mL濃度范圍內的WVP-1和WVP-2均能顯著抑制AAPH誘發(fā)紅細胞氧化溶血，紅細胞破裂溶血的比率顯著降低（p＜0.05），并且二者均在500 μg/mL時抑制氧化溶血的效果最好，溶血率分別下降了4.39%和6.51%，WVP-2在62.5、250、500和1000 μg/mL時抑制氧化溶血的能力顯著強于WVP-1（p＜0.05）。與CAA模型不同的是，紅細胞內沒有DNA，不涉及抗氧化通路，在一定程度上說明多糖在細胞水平中發(fā)揮抗氧化能力可能并不需要通過細胞內的相關信號表達，而可能通過形成保護膜從而阻止存在于細胞外部的自由基通過氧化分解細胞膜導致的氧化損傷。

3 結論

荸薺皮純化多糖組分WVP-1和WVP-2具有較好的熱穩(wěn)定性和粘度特性等理化性質，在食品、醫(yī)藥和化妝品等領域可能具有一定的應用潛力。此外，WVP-1和WVP-2在細胞水平上表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，并且WVP-2的抗氧化能力強于WVP-1，在營養(yǎng)與健康領域有一定的應用前景。