鄭敦錦，沈銳鋒，何康平，羅佳偉，陳胤熹，黃嘉惠，余潔婷，鄭少鵬，古偉明,4，曹詩林*

（1.佛山科學技術學院食品科學與工程學院,廣東佛山 528225）（2.廣東省食品智能制造重點實驗室，佛山科學技術學院，廣東佛山 528225）（3.華南農業(yè)大學食品學院，廣東廣州 510640）（4.廣東工業(yè)大學輕工化工學院，廣東廣州 510006）

南極假絲酵母脂肪酶B（CaLB）是目前被重點研究的一類酯催化劑[1]。CaLB具有底物特異性、專一性，作用條件溫和的通性，但與其它脂肪酶相比，CaLB具有更寬泛的溫度及 pH值穩(wěn)定性。CaLB可催化酯化、水解、聚合等反應[2]，因此被廣泛應用于食品、生物醫(yī)藥[3]、紡織[4]等領域。但游離酶存在結構不穩(wěn)定、易失活的缺點，限制了其在工業(yè)化上的推廣應用。據報道，糖類物質在環(huán)境脅迫下（低溫、干燥等）可對生物質材料起到保護性作用[5]。因此，可加入某些糖類物質作為保護劑提升游離CaLB的穩(wěn)定性和儲藏性能。目前，可作為酶保護劑的糖類包括海藻糖[6]、殼寡糖[7]、甲殼素[8]、羧甲基纖維素[9]、果糖[10]等，不同糖類對生物質材料的保護作用各有差異。

N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl glucosamine，GlcNAc）是許多重要多糖（幾丁質和殼聚糖）的基本組成單位，主要存在于真菌、細菌以及動植物體內[11]，尤其是在甲殼類生物的外骨骼含量最高[12]。GlcNAc易溶于水，具有消炎[13]、抗腫瘤[14]以及抗氧化[15]等生物活性，且對維持生物體正常生理功能具有顯著作用[16]。然而，目前尚未有報道研究乙酰氨基葡萄糖對游離CaLB的保護機制及相關實驗。

分子動力學模擬能夠從分子水平上[17]模擬蛋白的結構[18]以及與其他物質間的相互作用[19]。本文通過分子動力學模擬[20]與實驗相結合的方法研究了南極假絲酵母脂肪酶 B（CaLB）與乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）裝配體的構象，考察了CaLB與GlcNAc之間的作用機制對脂肪酶熱穩(wěn)定性的影響規(guī)律。CaLB與不同濃度GlcNAc混合生成CaLB-GlcNAc溶液混合物模型，分子動力學模擬后得到較理想的組裝體模型，通過分析CaLB總體構象的變化，然后進行熱穩(wěn)定性實驗，驗證分子模擬的結果。本文所建立的分子模擬方法及實驗驗證方法，可以為研究其它酶與糖類物質的作用機制提供借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 研究材料

可表達南極假絲酵母脂肪酶B的畢赤酵母菌株：由本實驗室自行構建并保藏。

本實驗室保存的南極假絲酵母脂肪酶B（CaLB）表達質粒CaLB-HisTag-pPICZαA，該質粒表達的酶的序列為：EFLVPRGSLPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTC QGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQ LGYTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYA GSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPSIRSKVD RLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTT GSALTTALRNAGGLTQIVPTTNLYSATDEIVQPQVS NSPLDSSYLFNGKNVQAQAVCGPLFVIDHAGSLTS QFSYVVGRSALRSTTGQARSADYGITDCNPLPAN DLTPEQKVAAAALLAPAAAAIVAGPKQNCEPDLM PYARPFAVGKRTCSGIVTPLVPRGSFLEQKLISEEDL HHHHHH。

乙酰氨基葡萄糖，購自湖北興恒業(yè)科技有限公司；棕櫚酸對硝基苯酯，購自上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇、磷酸鹽標準緩沖液（pH 7.5），購自源葉生物科技有限公司。

1.2 數據分析與作圖相關軟件

采用Modeller軟件[21-22]對CaLB進行同源建模和模型優(yōu)化，在線平臺（https://mag.liulianpisa.top/login）與 UCLA-DOE的 SAVES服 務 器（https://servicesn.mbi.ucla.edu/SAVES/）對模型進行質量評估。Packmol軟件[23]生成不同濃度的 CaLBGlcNAc模型，Gromacs 2019.1軟件[24]對模型進行分子動力學模擬，Pymol軟件顯示模型的三維結構。熱穩(wěn)定性實驗的原始數據由酶標儀輸出。

1.3 研究方法

1.3.1 CaLB同源建模與模型評估

首先，在 NCBI網站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上獲得南極假絲酵母脂肪酶 B（CaLB）（ID:1TCA）的氨基酸序列作為主要結構模板，然后應用BLAST工具對目標模板進行序列比對，當模板與目的蛋白的序列相似度大于 30%時，利用Modeller[21,22]進行同源建模和模型優(yōu)化。

將優(yōu)化后的模型放置于在線平臺上獲得拉氏圖，再使用UCLA-DOE的SAVES服務器的Verify_3D模塊進行評分，二者同時對同源建模的模型質量進行評價。

1.3.2 分子動力學模擬研究方法

分子動力學模擬使用Gromacs 2019.1軟件[24]進行分析。分子動力學模擬分析的具體過程如下：首先，通過Packmol軟件[23]將CaLB分別置于大小為11、10、9 nm的長方體模擬盒中心，然后將數量不同的GlcNAc及水分子填充到相應的模擬盒中，得到不同濃度（250、500、750、1000 mmol/L）的CaLB-GlcNAc模型。為保持盒子的總電荷數為 0，對各個模型進行電中性處理。采用Amber 03力場，先將體系進行能量最小化（EM）處理，然后進行100 ps的約束溶質分子平衡模擬（NVT、NPT）處理，游離 CaLB在303.15～323.15 K具有良好的熱穩(wěn)定性，故最后將各個模型在323.15 K下進行100 ns的無約束恒溫分子MD模擬。待模型平衡后，輸出模擬數據并進行分析。

1.3.3 熱穩(wěn)定性實驗設計

將CaLB酶樣品分別加入0、250、500、750、1000 mmol/L的乙酰氨基葡萄糖溶液，獲得CaLB-GlcNAc混合溶液；然后，將游離CALB酶液及混合溶液分別置于60、70、80 ℃水浴鍋中熱處理0、0.5、1.0、1.5、2.0 h，隨后測試酶活性。

酶活性測試方法[25]如下：200 μL緩沖液與25 μL酶液混合，加入25 μL底物溶液后，立即讀取410 nm波長下0～5 min的吸光值，并以該過程變化曲線的斜率來表征相對酶活，重復實驗三次，取平均值。

1.4 數據處理

1.4.1 南極假絲酵母脂肪酶B與乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）組裝分析

勢能分析：分析了 0～100 ns模擬中 CaLB與GlcNAc之間的靜電和Lennard-Jones相互作用。氫鍵、溶劑可達面積（SASA）分析：對0～100 ns范圍內的CaLB-溶劑和CaLB-GlcNAc進行氫鍵數和SASA分析，并計算了GlcNAc濃度從0增加至1000 mmol/L，酶與GlcNAc之間的氫鍵數變化情況和蛋白可及面積的變化情況。

1.4.2 南極假絲酵母脂肪酶B總體構象變化

均方根波動（RMSF）分析：為研究 GlcNAc對CaLB柔韌性的影響，對CaLB和CaLB-GlcNAc的每個殘基對計算平均RMSF。均方根（Root-mean-square deviation，RMSD）分析：計算游離酶模型及CaLB-GlcNAc模型的RMSD，研究GlcNAc對脂肪酶的結構穩(wěn)定性的影響。

1.4.3 不同溫度下CALB與乙酰氨基葡萄糖的熱穩(wěn)定性

相對酶活力分析：將游離CaLB酶液（Free-CaLB）及GlcNAc-CaLB混合液置于60、70、80 ℃溫度下，分別熱處理0、0.5、1.0、1.5、2.0 h，之后以棕櫚酸對硝基苯酯以底物測定二者的相對酶活力。

2 結果與討論

2.1 模型評估結果

2.1.1 Ramanchandran Plot（拉氏圖）評價

拉氏圖是通過蛋白中非鍵合原子間最小接觸距離來評價兩個相鄰肽單位骨架構象是否合理，并以此得出蛋白的允許和不允許區(qū)域，位于允許區(qū)域的氨基酸數應占總氨基酸數的95%以上[26]。圖1中的藍色區(qū)域為“最適區(qū)”，位于該區(qū)域的氨基酸數量越多，則模型的可信度越大；紫色區(qū)域為“允許區(qū)”；白色區(qū)域為“不允許區(qū)”，該區(qū)域的氨基酸是為構象不合理的氨基酸，需要進行優(yōu)化，且該區(qū)域的氨基酸數應小于 5%，否則模型的可信度低。對圖1進行數據輸出可知：該模型的氨基酸總數為349個，其中位于不允許區(qū)域的氨基酸數為10個，占比約為2.87%＜5%，證明該模型的可信度較高。

2.1.2 Verify_3D評價

模型的三維結構（3D）與氨基酸一級序列（1D）的相容性可以通過Verify_3D可分析，進而分析模型側鏈構象的合理性[27]。一般而言，超過80%氨基酸殘基的平均3D-1D分數≥0.2的模型是可行的，圖2表示CaLB蛋白模型中有80.22%氨基酸殘基的3D-1D分數≥0.2，且大部分的殘基 Verify_3D 評分＞0，表明該模型的側鏈構象良好，可信度較高。

2.2 CaLB和GlcNAc自組裝過程分析

2.2.1 L-J勢能和靜電勢能分析

為了研究CaLB與GlcNAc在溶液中的相互作用，分析了323.15 K下CaLB與不同濃度GlcNAc（250、500、750、1000 mmol/L）的靜電和Lennard-Jones勢能（圖 3）。結果顯示，CaLB-GlcNAc的靜電勢能與L-J勢能在前20 ns模擬時間中顯著降低。此外，隨著GlcNAc濃度的升高，靜電勢能與 L-J勢能下降值增大。CaLB-250 mmol/L-GlcNAc（圖3a）模型在0～100 ns模擬過程中，靜電勢能下降了3350 kJ/mol，L-J勢能下降了2791 kJ/mol。1000 mmol/L（圖3d）的模擬盒在 0～100 ns模擬過程中，靜電勢能下降了 4992 kJ/mol，L-J勢能下降了4340 kJ/mol。結果表明，CaLB與GlcNAc存在靜電作用和L-J作用，且?guī)靵鲎饔寐愿哂贚-J作用。

2.2.2 氫鍵分析

各模型的模擬時間為0 ns時，蛋白與溶劑的氫鍵數（HBN）約為500，蛋白與GlcNAc的HBN約為0。比較各模型平衡后的氫鍵數據可知：當GlcNAc濃度增加500 mmol/L時，蛋白與GlcNAc之間的氫鍵數逐步增加到115，GlcNAc濃度從500 mmol/L增加至1000 mmol/L時，二者之間的 HBN變化不顯著。表明250～500 mmol/L濃度的GlcNAc足以覆蓋蛋白的表面并與其形成氫鍵作用。此外，觀察圖 4可知，隨著GlcNAc濃度的增加，蛋白與溶劑間的HBN從500下降至300左右，而GlcNAc與CaLB之間的HBN則從0上升至150左右，表明GlcNAc與CaLB之間形成的氫鍵能取代部分CaLB與溶劑間的氫鍵。

2.2.3 CaLB和GlcNAc溶劑可及面積（SASA）分析

分析蛋白溶劑可及面積（SASA）的數據，如圖5。比較各模型的平衡之后的蛋白SASA數據可知：模擬時間為20 ns時，GlcNAc濃度從0增至500 mmol/L，蛋白的SASA從160下降至50 nm2，當GlcNAc濃度增至750 mmol/L與1000 mmol/L，蛋白的SASA在30～40 nm2。因此，蛋白SASA的數據表明，在GlcNAc濃度在500 mmol/L時，GlcNAc已經充分占據了酶分子的表面,與氫鍵數量分析的結果相一致。

2.3 CaLB與GlcNAc組裝體的整體構象

2.3.1 均方根偏差（RMSD）分析

分析模型的均方根偏差（RMSD）可以揭示GlcNAc對脂肪酶結構穩(wěn)定性的影響。如圖6所示，在323.15 K下，游離酶模型（Free-CaLB）平衡后的RMSD約為 0.2617 nm，其余四個不同濃度的CaLB-GlcNAc模型的RMSD數值均小于Free-CaLB模型的RMSD數值。

表1 Free-CaLB-SOL與不同濃度GlcNAc最后10 ns的RMSD平均值數據分析表（353.15 K）Table 1 The last 10 ns RMSD average data analysis table of Free-CaLB-SOL and different concentrations of GlcNAc(353.15 K)

在323.15 K的基礎上，對Free-CaLB與250、500、750、1000 mmol/L的CaLB-GlcNAc模型進行了升溫至353.15 K的處理，分析模型最后10 ns的RMSD來表征升溫后GlcNAc對脂肪酶的結構穩(wěn)定性的影響及探究CaLB的熱穩(wěn)定性。結果如表1所示，在353.15 K溫度下，CaLB-GlcNAc模型的 RMSD數值均小于Free-CaLB的RMSD數值（0.3473 nm），揭示GlcNAc在353.15 K的條件下，仍可有效維持酶的原始結構，并提高其結構穩(wěn)定性。

2.3.2 均方根波動（RMSF）分析

為了研究GlcNAc對CaLB結構柔性的影響，圖7對比分析了Free-CaLB與不同濃度的CaLB-GlcNAc均方根波動（RMSF）數據。結果表明，各殘基的RMSF在Free-CaLB和CaLB-GlcNAc組裝體中表現出相同的趨勢。進一步分析323.15 K時模擬盒的RMSF數據，結果發(fā)現在Free-CaLB模型中（Val 147-Leu 155）區(qū)域的波動較大，而CaLB-GlcNAc組裝體模型在該區(qū)域的波動卻有所減弱，表明（Val 147-Leu 155）區(qū)域在CaLB-GlcNAc組裝體中的結構柔性較Free-CaLB弱。

2.3.3 不同溫度下CALB與GlcNAc的熱穩(wěn)定性分析

為了驗證 CaLB-GlcNAc模型的模擬效果，進行了CaLB與不同濃度GlcNAc的熱穩(wěn)定性實驗。實驗結果如圖8所示，CaLB-GlcNAc熱穩(wěn)定性要優(yōu)于游離酶，并且隨著GlcNAc濃度增加，CaLB在不同溫度熱處理時的酶活保留率相對增加。此外，由圖8a所示，游離CaLB在60 ℃熱處理0.5 h后，其相對酶活力僅剩37.21%，而與濃度為750～1000 mmol/L的GlcNAc共同作用的CaLB，其相對酶活力保留＞90%；在該溫度下熱處理2.0 h后，游離CaLB的相對酶活力僅剩22.26%，而750～1000 mmol/L GlcNAc溶液中的CaLB活性依舊保持有 52.11%?？梢?，在溶液中，加入GlcNAc可有效提高CaLB的熱穩(wěn)定性，這與分子模擬的結果具有一定的吻合之處。

2.3.4 討論

乙酰氨基葡萄糖是一種功能性糖，但目前關于乙酰氨基葡萄糖與脂肪酶相互作用的分子動力學模擬及熱穩(wěn)定性實驗研究鮮有報道。N-乙酰氨基葡萄糖經β-1,4-糖苷鍵連接形成甲殼素，甲殼素脫去乙酰基及降解后形成殼寡糖（OCTS），因此，乙酰氨基葡萄糖與殼寡糖都屬于甲殼素衍生物的范疇。楊寶燕[28]使用分子動力學模擬方法研究了殼寡糖與南極假絲酵母脂肪酶B的相互作用機制，模擬結果顯示：CaLB與OCTS之間存在靜電相互作用和氫鍵相互作用，并且 CaLB與OCTS之間的氫鍵數量增加，CaLB與OCTS之間的SASA明顯降低，使得脂肪酶被殼寡糖包裹住，從而使脂肪酶的蛋白結構變穩(wěn)定，但殼寡糖在實驗中是否能夠提高脂肪酶的熱穩(wěn)定性仍需進一步研究。

相比之下，本文不但從分子動力學模擬的角度分析了GlcNAc與CaLB之間的氫鍵數、SASA的變化情況等來研究脂肪酶與乙酰氨基葡萄糖之間的相互作用機制，進一步通過熱穩(wěn)定性實驗進行論證，結果顯示：乙酰氨基葡萄糖可以提高南極假絲酵母脂肪酶B的熱穩(wěn)定性，這與分子動力學模擬結論具有一定的吻合性。

3 結論

本實驗利用分子動力學模擬及實驗論證方法研究了南極假絲酵母脂肪酶B與乙酰氨基葡萄糖的相互作用及酶的熱穩(wěn)定性實驗。分子動力學模擬勢能與氫鍵分析表明：CaLB與GlcNAc之間的組裝過程存在靜電作用和L-J作用，并且隨著GlcNAc濃度的增加，蛋白與GlcNAc之間的HBN增加（由0增至115），取代了CaLB與溶劑間的部分氫鍵。此外，當 GlcNAc的濃度為250～500 mmol/L時，GlcNAc足以覆蓋蛋白的表面與其形成氫鍵作用。RMSD、RMSF和 SASA數據表明：不同濃度的 CaLB-GlcNAc模型波動程度明顯小于Free-CaLB模型，且當GlcNAc濃度為500 mmol/L時，酶分子的表面已被GlcNAc充分覆蓋（此時的SASA由160下降到40 nm2），這表明GlcNAc可有效維持脂肪酶的原始結構。CaLB與GlcNAc的熱穩(wěn)定性實驗也表明了GlcNAc可以有效維持CaLB的天然結構并提高其結構的穩(wěn)定性。