王鳳嬌,具紫勇,范神棟,陳灝,施舍,王功命,梁嘉儀,王珂,夏勇

（1.上海中醫(yī)藥大學,上海 201203;2.復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院,上海 200032;3.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院,上海 200437）

癌癥的發(fā)病率正在逐年上升[1],骨組織是乳腺癌和其他癌癥（包括前列腺癌、肺癌、腎癌、甲狀腺癌和肉瘤等）患者最常見的遠處轉移之一[2]。高達75%的患者忍受嚴重癌癥引起的骨痛（cancer-induced bone pain, CIBP）[3]。癌性骨痛是導致患者活動受限、情緒低落、呼吸系統(tǒng)感染、栓塞、壓瘡等風險增加的主要原因,嚴重影響患者的生活質量。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的三階梯止痛方案進行姑息放療和藥物治療是降低CIBP的首選治療方法,但這些方法并不總是有效且伴有嚴重的副作用[4]。中重度癌痛患者需使用阿片類藥物,存在明顯的不良反應[5]。近年來,針灸治療癌癥疼痛日益受到關注和重視,多篇系統(tǒng)綜述和meta分析顯示針灸可能是一種癌癥疼痛有效的鎮(zhèn)痛輔助方法[6-8]。且針灸控制癌痛應用方便,不良反應很少,無成癮性;但針灸治療癌癥相關疼痛的機理研究尚處于初步階段,其鎮(zhèn)痛機制仍不明確。研究發(fā)現(xiàn),癌癥疼痛不僅與脊髓痛覺傳遞神經元的興奮性有關,而且與脊髓中激活的星形膠質細胞有密切聯(lián)系?；诖?本研究通過動物實驗,建立大鼠骨癌痛模型,觀察并闡明針灸對骨癌痛的鎮(zhèn)痛效應及機制,以期為臨床治療提供借鑒和思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

雌性 SD大鼠 48只,清潔級,體質量（190±10）g,由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供[SCXK（滬）2013-0016],飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心。動物飼養(yǎng)在溫度21℃左右,相對濕度40%～60%的環(huán)境中,每天光照12 h,自由攝食飲水,按需更換墊料。動物實驗倫理委員會批轉編號為PZSHUTCM190315002。所有大鼠適應性飼養(yǎng)1周后按隨機數(shù)字表法分為空白組、假手術組、模型組、電針組,每組12只。

1.2 主要試劑與儀器

異氟烷（MGB-15533,深圳市瑞沃德生命科技有限公司）;GFAP抗體（ab7260,艾博抗-上海貿易有限公司）;大鼠 TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA 試劑盒（ZC-37624,ZC-36391,ZC-36404,上海博鼎生物科技有限公司）;腫瘤細胞LLC-WRC 256（Walker256,日本RCB細胞庫）;電子Von-Frey（ITTC-1443,ITTC生命科學有限公司）;透射電子顯微鏡（JEM-1230,日本電子株式會社廣州事務所）;韓氏穴位神經刺激儀（HANS-200E,南京濟生醫(yī)療科技有限公司）;微量注射泵（1600528,深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。

1.3 細胞制備

取成年雌性 SD大鼠腹腔注射 Walker 256細胞 0.5 mL （2.5×107/mL）,6～7 d 后抽取 5 mL 大鼠腹水,加入等量磷酸鹽緩沖液（PBS）充分混勻后 1 300 rpm離心3 min, PBS溶液重懸,計數(shù)并離心收集細胞,調整細胞濃度為5×107/mL,置于冰盒上待用。

1.4 模型制備

大鼠用麻醉機（內含異氟烷）麻醉后,將右膝關節(jié)用7%的碘酒和75%的乙醇溶液消毒。從右側膝關節(jié)處切開皮膚,左手指固定膝關節(jié),然后用5 mL針筒針頭在膝關節(jié)髕韌帶外側緣,沿脛骨縱軸走向往脛骨遠端鉆孔,深約 1 cm,用微量注射器向脛骨骨髓腔內注射Walker 256 腫瘤細胞（5×107/mL）10 μL,假手術組大鼠注射 10 μL磷酸鹽緩沖液。注射后留針片刻,出針后針孔處放置明膠海綿,皮膚縫合[9]。

1.5 干預方法

大鼠在造模后第 11天開始電針干預,隔日 1次,共 3次。選取雙側L3～L5夾脊穴（EX-B2）,電針時大鼠以俯臥位安置于固定器內,用乙醇棉球消毒背部皮膚,將針灸針在L5棘突下旁開后正中線3 mm處直刺進針,針尖抵到椎板時,轉換方向朝向頭部,沿棘突旁透刺至L3水平位置,毫針連接韓式穴位神經刺激儀,電針參數(shù)選擇頻率 2/100 Hz,疏密波,電流強度 2 mA,時間30 min。電針干預前3 d,所有大鼠均于固定器內進行適應。

1.6 指標檢測

1.6.1 機械痛閾測定

4組大鼠均于造模前和造模后9 d、11 d、13 d、15 d進行機械痛閾測定。將大鼠放置在測試架上的透明有機玻璃罩內,底部是金屬網(wǎng),適應周圍環(huán)境 15～30 min。在電子Von-Frey手持式測力傳感器上安裝聚丙烯尖端,尖端垂直于后爪的中心區(qū)域,并逐漸增加壓力,以大鼠爪子出現(xiàn)退縮動作為準,收爪后記錄壓力的強度,以3次測量的平均值為最終結果[10]。

1.6.2 脛骨組織學觀察

大鼠安樂死后,剪斷并分離大鼠脛骨與股骨、跖骨連接的韌帶、皮膚與肌肉,生理鹽水沖洗后放入 4%多聚甲醛溶液內固定24 h,按1:10的比例浸泡在脫鈣液36 h,取出上端（近股骨側）三分之一,蒸餾水沖洗,用50%的乙醇溶液沖洗 2次,分別使用 70%、80%、95%、100%的乙醇溶液進行梯度脫水,再用二甲苯透明處理,依次使用石蠟進行包埋,用切片機切成4 μm的石蠟帶,將組織石蠟塊在 50 ℃水中展開,將切好的組織片放入63 ℃恒溫箱中烤片2 h,然后二甲苯、乙醇梯度脫水后蘇木精染色5 min,流水沖洗10 min,1%鹽酸乙醇溶液分化5 s,流水沖洗2 min,伊紅染色 2 min,流水沖洗后,70%、80%、95%、100%梯度乙醇脫水各 10 s,二甲苯透明,中性樹膠封片,光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.6.3 脊髓背角組織GFAP蛋白檢測

大鼠安樂死后,縱向剪斷腰椎與骶椎及胸椎的組織連接,分離脊柱與肋骨及周圍組織以充分暴露各節(jié)段脊神經;臺盼藍標記 L3～L5脊神經,根據(jù)標記的脊神經定位并分離相應的脊髓節(jié)段,于光學顯微鏡下分離脊髓背角組織。脊髓背角組織放入蛋白裂解液中,按BCA法測定蛋白濃度。用10%的分離膠和5%的濃縮膠提取等量的蛋白液,隨后轉PVDF膜,取膜后放入5%脫脂奶粉封閉液過夜。將封閉后的膜剪成小塊后滴加一抗（1:2 000）。PBST沖洗后滴加 HRP偶聯(lián)的二抗（1:3 000）輕搖孵育。Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值。

1.6.4 脊髓背角TNF-α、IL-1β、IL-6炎性因子含量檢測

脊髓背角組織用預冷的PBS溶液沖洗、稱重后將其剪碎,與對應體積的PBS加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。對勻漿液進行超聲破碎或反復凍融以進一步裂解組織細胞。最后將勻漿液以5 000 r/min離心5～10 min,取上清液。按照ELISA試劑盒說明書操作,并在波長為450 nm處,用酶標儀測定光密度,根據(jù)標準曲線算出TNF-α、IL-1β、1L-6濃度。

1.7 統(tǒng)計學方法

應用SPSS26.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差表示,重復測量資料采用重復測量法比較同一組不同時間點測量數(shù)據(jù),組間差異比較采用單因素方差分析;方差齊時,采用LSD法;方差不齊時,采用Games-Howell法進行兩兩比較。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4組大鼠機械痛閾比較

4組大鼠造模前（0 d）的機械痛閾差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）,空白組及假手術組造模前、后各時間點的機械痛閾差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與空白組和假手術組比較,模型組各時間點的機械痛閾明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較,電針組第 11天、13天和 15天的機械痛閾均顯著上升（P＜0.05）。詳見表 1。

表1 4組大鼠右后爪機械痛閾比較 (±s, g)

表1 4組大鼠右后爪機械痛閾比較 (±s, g)

注:與空白組比較 1）P＜0.05;與假手術組比較 2）P＜0.05;與模型組比較 3）P＜0.05

組別 n 0 d 9 d 11 d 13 d 15 d空白組 12 48.6±9.1 51.7±10.6 47.1±8.9 56.1±8.0 51.9±8.6模型組 12 49.1±12.1 24.9±6.11）2） 24.9±7.01）2） 24.7±8.81）2） 22.5±8.41）2）假手術組 12 52.8±11.2 49.5±9.7 57.3±10.3 51.9±11.7 53.1±10.7電針組 12 50.7±11.0 27.2±5.4 35.3±4.43） 40.1±6.63） 35.0±4.43）

2.2 4組大鼠脛骨組織學觀察

空白組新生骨組織內結構清晰,軟骨細胞柱排列有序,脛骨髓腔內未見癌細胞;假手術組過渡性骨小梁間未見癌細胞浸潤;模型組新生骨組織紋理模糊不清,軟骨細胞柱遭到破壞,髓腔內癌細胞大量侵入;電針組過渡性骨小梁間可見大量癌細胞浸潤。詳見圖1。

圖1 各組大鼠脛骨組織病理學觀察(HE染色,×100倍)

2.3 4組大鼠脊髓背角TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較

與空白組和假手術組比較,模型組大鼠脊髓背角IL-1β、IL-6的含量均明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）,電針組 IL-1β、IL-6的含量低于模型組,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各組大鼠脊髓背角TNF-α的含量比較,差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表2。

表2 4組大鼠脊髓背角TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較 (±s, pg/mL)

表2 4組大鼠脊髓背角TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較 (±s, pg/mL)

注:與空白組比較 1）P＜0.05;與假手術組比較 2）P＜0.05;與模型組比較 3）P＜0.05

組別 n TNF-α IL-1β IL-6空白組 6 199.65±46.27 14.18±3.76 91.81±9.68模型組 6 176.21±32.39 28.50±1.581）2） 134.78±10.411）2）假手術組 6 196.21±50.51 13.53±4.01 91.33±21.40電針組 6 189.18±54.55 20.81±5.443） 97.79±17.203）

2.4 4組大鼠脊髓背角GFAP蛋白表達水平比較

與空白組和假手術組比較,模型組大鼠脊髓背角星形膠質細胞標記蛋白GFAP的表達明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組相比,電針組 GFAP的蛋白表達則顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖2。

圖2 4組大鼠脊髓背角GFAP蛋白表達水平比較

3 討論

骨癌痛屬中醫(yī)學“骨瘤”范疇[11],可從軀體、心理、社會和精神等方面影響患者的生活質量[12-13]。田建輝等[12]認為骨癌痛的發(fā)生,責之于正虛邪實,正虛為根本,邪實是表象,正虛主要表現(xiàn)于腎虛,邪實主要表現(xiàn)為伏毒,提出“伏毒蝕骨擾神”為骨癌痛核心病機。此外,有醫(yī)家認為癌痛是瘤毒侵犯經絡或瘤塊阻滯經絡氣血所致[14-15]。《千金翼方》:“凡病皆由氣血壅滯,不得宣通,針以開導之?！盵16]本實驗選取的穴位為雙側 L3～L5夾脊穴,夾脊穴可通過督脈和膀胱經發(fā)揮效應,疏通經絡、調節(jié)氣血以治痛;又與心、腦、髓關系密切,來影響神氣而治痛。另一方面,下肢與 L3～L5夾脊穴屬于同神經節(jié)段。

現(xiàn)代醫(yī)學認為骨癌痛是一種區(qū)別于炎性痛和神經病理性痛的持續(xù)性、突破性疼痛[17-18],不僅與脊髓痛覺傳遞神經元的興奮性有關,而且與脊髓中激活的星形膠質細胞有密切聯(lián)系。骨癌痛模型中最具特征的改變是脊髓背角星形膠質細胞肥大及增生,星形膠質細胞特異性標記物膠質原纖維酸性蛋白（GFAP）大量表達[19-20]。GFAP表達的增加,引起轉錄后修飾,導致脊髓促炎物質增加神經的興奮性,加重疼痛反應[21]。抑制CIBP大鼠脊髓星形膠質細胞的激活,可有效逆轉促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達的上調,減輕大鼠的機械痛敏[22-23]。提示星形膠質細胞激活依賴的脊髓神經炎在CIBP中發(fā)揮關鍵作用[20]。研究證實針灸可緩解骨癌痛[24-25]。ZHANG R X等[26]發(fā)現(xiàn),與無電刺激對照組比較,10 Hz/2 mA電針環(huán)跳能緩解骨癌痛大鼠熱痛覺超敏,抑制脊髓 IL-1β mRNA的表達;杜俊英等[27]報道電針雙側后三里和跟端穴對骨癌痛具有良好的鎮(zhèn)痛作用,且治療效果與頻率、頻次無關?；谏鲜鍪聦?本文觀察了電針對骨癌痛大鼠脊髓背角星形膠質細胞活化及炎性因子表達的影響。

本實驗通過大鼠脛骨注射 Walker 256細胞建立CIBP模型,造模后第9天脛骨切片顯示,模型組新生骨組織紋理模糊不清,軟骨細胞柱遭到破壞,髓腔內癌細胞大量侵入,空白組、假手術組均未見異常,說明CIBP造模成功;電針組過渡性骨小梁間可見大量癌細胞浸潤,表明電針干預并未改變脛骨局部組織的病理狀態(tài)。行為學檢測結果表明電針可明顯緩解 CIBP誘發(fā)的機械痛敏。進一步研究顯示,骨癌顯著增加了脊髓背角星形膠質細胞標志物GFAP的水平,表明星形膠質細胞處于激活狀態(tài),這與之前的報告一致[20];而后的實驗結果顯示,電針干預可顯著下調脊髓背角 GFAP的表達,減少促炎細胞因子IL-1β、IL-6的釋放;4組大鼠脊髓背角TNF-α的表達比較,差異無統(tǒng)計學意義。以上結果表明,電針對骨癌痛大鼠有較好的鎮(zhèn)痛效應,其可能通過抑制脊髓背角星形膠質細胞活化誘導的炎癥反應發(fā)揮作用。