李晨陽，衡天瑜，蘇文靈，徐芳，張麗，2

(1.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗室，烏魯木齊 830004；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院&中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所晶型藥物研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗室，北京 100050)

孜然(CuminumcyminumL.)是傘形科植物孜然芹的干燥成熟果實(shí)。孜然呈黃褐色、扁平弧形，有較為強(qiáng)烈的芳香氣味[1]。孜然在新疆的種植歷史悠久，可追溯到一千年前，且全國90%以上的孜然產(chǎn)自新疆[2]。孜然是一種重要的民族藥材，《普濟(jì)方》中記載孜然可用于治療消化不良和胃寒、腹痛等。據(jù)《唐本草》記載，將孜然炒熟后研磨成粉，就著醋服下去，還有治療心絞痛和失眠的作用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究主要以孜然揮發(fā)油的活性為主，如抗炎、殺菌、抗氧化和抗腫瘤作用等[3-4]?？蒈?Cuminaldehyde)是孜然的標(biāo)識性成分和有效成分，占孜然揮發(fā)油總量的45%～63%。

基于傳統(tǒng)中醫(yī)藥分支的維吾爾醫(yī)藥，在臨床中應(yīng)用孜然多是經(jīng)過炮制處理，炮制品有醋制孜然、鹽炒孜然和炒孜然，其中醋制孜然最為常用[5-7]。根據(jù)《新疆維吾爾自治區(qū)中藥維吾爾藥飲片炮制規(guī)范》[8]，醋制孜然的炮制方法為：取凈孜然，加4倍量的葡萄醋浸泡1晝夜，撈出晾干，然后炒干至黃備用。但該炮制方法部分參數(shù)(如炒制溫度、炒制時間等)不明確，可能影響醋制孜然炮制品的質(zhì)量，亟需考察研究。枯茗醛雖是孜然中的主要標(biāo)識性成分，但筆者未見孜然藥材中有關(guān)枯茗醛的含量測定文獻(xiàn)[9-12]。因此，本研究對醋制孜然的炮制工藝參數(shù)進(jìn)行了考察，首次采用高效液相色譜法對孜然中枯茗醛含量進(jìn)行測定。另外，傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法和粉末X射線衍射分析法具有快速、簡便、圖譜穩(wěn)定、指紋性強(qiáng)，已成為成分分析的重要手段[13-15]，X射線熒光光譜分析樣品前處理簡單，具有檢測元素多、分析速度快、精度高、重復(fù)性好、成本低和無損檢測等突出優(yōu)勢[16]，故筆者采用傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法和粉末X射線衍射法對各孜然樣品進(jìn)行整體特征分析，采用X射線熒光分析法對各孜然樣品進(jìn)行整體元素含量比較，以便深入研究醋制工藝對孜然飲片成分含量、整體特征和元素含量的影響。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(配備DAD檢測器，美國安捷倫公司)；AL-204型電子天平(梅特勒-托利多上海有限公司，感量：1 mg)；XS-105 型分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器公司，感量：0.1 mg)；Spectrum400型傅里葉紅外光譜儀(英國PerkinElmer公司)；D/max-2550 型粉末X射線衍射儀(日本Rigaku公司)；ZSX Primus Ⅱ X射線熒光光譜儀(日本Rigaku公司)。

1.2試藥 枯茗醛對照品購自美國ChromaDex公司(批號：00003918-568，化學(xué)純度：98.2%)；木犀草素對照品購自中國食品藥品檢定研究院(批號：111520-200504)；孜然藥材購自新疆仁譽(yù)中藥飲片有限公司(經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所何江研究員鑒定)；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1醋制孜然樣品制備 根據(jù)《新疆維吾爾自治區(qū)中藥維吾爾藥飲片炮制規(guī)范》醋制孜然的炮制方法，制備不同炮制條件的樣品：醋孜然(取凈孜然加4倍量葡萄醋浸泡1晝夜，撈出晾干)，不同炒制溫度樣品(80，100，140 ℃，樣品顏色及狀態(tài)分別為黃色質(zhì)脆、焦黃質(zhì)脆、黃黑質(zhì)脆)，不同炒制時間樣品(80 ℃炒制17，23，29 min，樣品顏色及狀態(tài)分別為黃色質(zhì)地稍軟、黃色質(zhì)脆、焦黃質(zhì)脆，分別標(biāo)記為80-1，80-2，80-3)，生孜然(孜然原藥材凈制)。

2.2枯茗醛含量測定[17-19]

2.2.1色譜條件及系統(tǒng)適用性實(shí)驗 色譜柱為Agilent Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.08%磷酸溶液(58：42，V/V)，流速為1 mLmin-1，檢測波長為257 nm，進(jìn)樣量為10 μL?？蒈├碚摪鍞?shù)18 330，說明在選定的條件下，色譜柱的某些條件如柱長、載體性能及色譜柱填充均符合要求，測定效果良好。枯茗醛分離度R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)=3.19，根據(jù)《中華人民共和國藥典》(2020版)規(guī)定“分離度應(yīng)大于1.5”，分離度符合要求。在上述色譜條件下，孜然中枯茗醛的色譜峰與其他成分分離度良好。見圖1所示。

1.枯茗醛。圖1 陰性品(A)、對照品(B)與孜然樣品(C)HPLC色譜圖1.Cuminaldehyde.Fig.1 HPLC chromatograms of negative sample(A), reference substance of cuminaldehyde(B)and sample of Cuminum cyminum L.(C)

2.2.2溶液的制備 ①枯茗醛對照品溶液制備：取枯茗醛適量，精密稱定，加無水乙醇制成每毫升含0.884 mg的溶液。②供試品溶液制備：取孜然樣品粉末[過四號篩，篩孔內(nèi)徑(250±9.9) μm]0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入無水乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取10 min，放冷至室溫后用無水乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3線性關(guān)系考察 精密量取枯茗醛對照品溶液0.1，0.2，0.5，1，2 mL，置不同10 mL量瓶中，另取0.1 mL置于25 mL量瓶，分別加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取各對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果枯茗醛標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=63 823X+21.85，r=0.999 9，表明枯茗醛在0.0035～0.173 6 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4精密度實(shí)驗 取同一份供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次測定。枯茗醛峰面積的RSD為0.48%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.5重復(fù)性實(shí)驗 準(zhǔn)確稱取同一樣品，按“2.2.2”項制備6份供試品溶液，并按上述色譜條件測定?？蒈┖繛?.75%，RSD為1.58%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.6穩(wěn)定性實(shí)驗 取同一供試品溶液，分別在0，1，3，5，7和20 h進(jìn)樣測定?？蒈┖康腞SD為0.86%，結(jié)果表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7加樣回收率測定 取已知含量的樣品粉末6份，每份約0.05 g，精密稱定，分別加入0.868 1 mg·mL-1的枯茗醛對照品溶液0.41 mL，再加入無水乙醇至刻度，按“2.2.2”項下供試品溶液制備項下進(jìn)行操作?？蒈┢骄厥章蕿?7.61%，RSD為1.11%，結(jié)果見表1。

表1 枯茗醛加樣回收率測定結(jié)果 Tab.1 Recovery test results for cuminaldehyde n=6

2.2.8各樣品含量測定 取孜然各樣品粉末約0.1 g，精密稱定，按“2.2.2”項下供試品溶液制備進(jìn)行操作。

2.3木犀草素含量測定 按照《新疆維吾爾自治區(qū)藥品監(jiān)督管理局藥材標(biāo)準(zhǔn)—孜然(2020YC-0010)》項下方法進(jìn)行各樣品中木犀草素含量測定。

2.3.1色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液(50：50，V/V)，流速為1 mL·min-1，檢測波長為350 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

2.3.2對照品溶液制備 取木犀草素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含5.472 μg的溶液。

2.3.3供試品溶液制備 取孜然樣品粉末[過四號篩，篩孔內(nèi)徑(250±9.9) μm]約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取0.5 h，放冷至室溫后用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4各樣品含量測定 取孜然各樣品粉末約1 g，精密稱定，按“2.3.3”項下供試品溶液制備進(jìn)行操作。各樣品含量測定結(jié)果見表2。

2.4揮發(fā)油含量測定 照揮發(fā)油測定法(《中華人民共和國藥典》2020年版第四部通則2204)測定。各樣品含量測定結(jié)果見表2。

表2 孜然樣品枯茗醛、木犀草素、揮發(fā)油測定結(jié)果 Tab.2 Content determination results of cuminaldehyde, luteolin and volatile oil in Cuminum cyminum L.sample

2.5傅里葉變換衰減全反射紅外光譜特征分析

2.5.1樣品制備與實(shí)驗條件 ①樣品制備：將7個不同孜然樣品研磨粉碎并過篩孔內(nèi)徑0.150 mm(100目)篩，備用。②傅里葉變換衰減全反射紅外分析實(shí)驗條件：采用衰減全反射方式(ATR)，光譜掃描范圍650～4000 cm-1，分辨率4000 cm-1，掃描次數(shù)16次，測力計值80。③粉末X射線衍射分析實(shí)驗條件：銅靶Kα輻射，石墨單色器，管壓40 kV，管流150 mA，掃描速度8°·min-1，步長0.02°，發(fā)散狹縫DS=1°，接收狹縫RS=0.15 mm，散射狹縫SS=1°，2θ在3°～80°范圍內(nèi)記錄樣品的PXRD圖譜。

2.5.2供試品制備方法 精密稱取孜然樣品各100 mg，分別采用紅外光譜法進(jìn)行傅里葉變換衰減全反射紅外光譜分析。

傅里葉變換衰減全反射紅外光譜結(jié)果見圖2所示。研究結(jié)果表明，7個樣品的紅外光譜中不存在明顯差異，原因主要是紅外光譜是基于有機(jī)分子中振動能級和轉(zhuǎn)動能級的躍遷，反映了有機(jī)化合物分子中化學(xué)鍵或官能團(tuán)的信息。證明了孜然樣品在炮制前后有機(jī)化合物成分在紅外光譜中變化并不明顯。

圖2 7個孜然樣品的傅里葉變換衰減全反射紅外光譜Fig.2 Fourier transform attenuated total reflection infrared spectrometry of seven Cuminum cyminum L.samples

2.6粉末X射線衍射圖譜特征分析 供試品制備方法：采用粉末X射線衍射法對7個孜然樣品進(jìn)行分析。實(shí)驗結(jié)果見圖3所示。結(jié)果表明，7個樣品的粉末X射線衍射峰位置和強(qiáng)度存在以下差異：①生孜然和其他6個樣品比，在2θ值為28.12°、30.94°、40.44°處有三個強(qiáng)度較高的衍射峰，而缺少32°、35°、38°位置的衍射峰；②生孜然和醋孜然在20°最強(qiáng)衍射峰處沒有肩峰出現(xiàn)，炒制后的孜然樣品在最強(qiáng)衍射峰處都有肩峰出現(xiàn)；③炒制后的孜然樣品衍射峰比生孜然趨于平緩，表明炒制后的孜然樣品中無機(jī)鹽等晶態(tài)成分趨于減少；④孜然80 -3和孜然140 均為炒焦樣品，二者在45°后衍射峰強(qiáng)度進(jìn)一步降低，且衍射峰數(shù)目較少。

圖3 7個孜然樣品的粉末X射線衍射圖譜Fig.3 Powder X-ray diffraction patterns of seven Cuminum cyminum L.samples

2.7X射線熒光光譜特征分析 ①樣品制備與實(shí)驗條件：同“2.5.1”項；②供試品的制備方法：精密稱取孜然樣品各約400 mg，分別采用X射線熒光光譜儀進(jìn)行分析，每個樣品平行測定3次。③X射線熒光光譜分析實(shí)驗條件X射線熒光光譜儀分析條件：分析線Kα，衰減器1/1，探測器PC，含量前210位的特征元素分析實(shí)驗條件見表3所列。結(jié)果見圖4所示。研究結(jié)果表明，7種樣品含量最高的元素是C、O、N、K、Ca、Cl，其次是Mg、P、S、Na。7種樣品都含有Fe、Zn、Br。生孜然中不含Ni，其余炮制樣品中雖然顯示出微量Ni成分，但是含量均低于0.01%，并不會對孜然功效產(chǎn)生明顯影響，微量Ni元素主要是由于炮制過程引入的，有待進(jìn)一步考察。孜然經(jīng)醋制后，K、Ca、Cl、Mg、S、Na含量均下降。

圖4 7個孜然樣品的X射線熒光元素分析圖Fig.4 X-ray fluorescence elemental analysis diagrams of seven Cuminum cyminum L.samples

表3 X射線熒光光譜分析實(shí)驗條件值 Tab.3 Experimental condition value of X-ray fluorescence spectrometry

3 討論

對藥材進(jìn)行加工炮制使毒性降低或消失、緩和藥性、增強(qiáng)療效，同時有利于藥材有效成分的充分溶出。炮制工藝包含著深厚的中醫(yī)藥理論的獨(dú)到之處與豐富的臨床經(jīng)驗，是中醫(yī)藥的特色，也是具有民族特色的獨(dú)特制藥技術(shù)。由于歷史條件和科學(xué)技術(shù)的限制，炮制工藝的具體參數(shù)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、輔料的制備等都缺乏統(tǒng)一的加工炮制標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)在繼承傳統(tǒng)炮制技術(shù)和理論的基礎(chǔ)上，利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)使其應(yīng)用科學(xué)化、規(guī)范化，以期生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的中藥飲片，為實(shí)現(xiàn)全民大健康提供安全有效的中藥飲片?；诖?，本研究對維吾爾藥醋制孜然的炮制工藝參數(shù)和質(zhì)量特性進(jìn)行了考察，以期為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

在《新疆維吾爾自治區(qū)藥品監(jiān)督管理局藥材標(biāo)準(zhǔn)-孜然(2020YC-0010)》中，孜然藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)除常規(guī)的性狀，粉末鑒別，薄層色譜鑒別，檢查(雜質(zhì)、水分、總灰分、酸不溶性灰分)，浸出物外，在含量測定項下測定了揮發(fā)油含量和木犀草素含量，其中揮發(fā)油含量限度為不得少于3.0%(mL/100 g)，木犀草素含量限度為不得少于0.015%。由于木犀草素是一種天然黃酮類化合物，在自然界中分布廣泛，可從多種天然藥材、蔬菜果實(shí)中分離得到，將其用于孜然藥材的質(zhì)量控制，專屬性稍差，而且其在孜然中的含量也不高，藥材標(biāo)準(zhǔn)中其含量限度僅為1.5/105。文獻(xiàn)報道，枯茗醛是孜然的標(biāo)識性成分和有效成分，占孜然揮發(fā)油總量的45%～63%，然而孜然藥材標(biāo)準(zhǔn)中并未將枯茗醛的含量測定納入其中，可能與國內(nèi)暫無枯茗醛對照品有關(guān)。本研究在孜然藥材標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，于醋制孜然炮制工藝研究中新增了枯茗醛含量作為考察指標(biāo)(采用美國ChromaDex公司的枯茗醛對照品，化學(xué)純度98.2%)，以期為進(jìn)一步提升孜然質(zhì)量控制手段提供依據(jù)。同時，由于粉末X射線衍射分析和X射線熒光分析等方法具有一定專屬性和新穎性，而且是藥材全成分分析，將它們用于醋制孜然的炮制工藝研究也是一種嘗試和探索，以期為中藥材炮制提供有益參考。

孜然具醒腦通脈、降火平肝等功效，能祛寒除濕、理氣開胃，對消化不良、開胃下氣、消食化積均有療效[1-2]；葡萄醋以近成熟的生葡萄釀制而成，具有散瘀消積、解毒等作用，經(jīng)葡萄醋浸泡過的孜然炒制后會調(diào)整其過度干熱之性，降低其含油量，消除對消化系統(tǒng)的刺激作用，增強(qiáng)其驅(qū)風(fēng)散寒、通經(jīng)、消腫、利尿等療效[20]。本研究中孜然經(jīng)葡萄醋浸泡24 h撈出晾干后，孜然顏色變淺，氣味中帶著酸味，而浸泡過孜然的葡萄醋則由清亮的淡黃色變成棕褐色。在孜然的炒制過程中，孜然的辛辣味不斷溢出，并伴有爆鳴聲，此現(xiàn)象與枯茗醛和揮發(fā)油含量測定結(jié)果相一致，說明隨著炒制時間延長和炒制溫度升高，會造成枯茗醛含量和揮發(fā)油含量逐漸降低。但炒制時間和炒制溫度對非揮發(fā)性成分木犀草素含量無明顯影響。粉末X射線衍射法結(jié)果表明，醋浸泡和炒制工藝使孜然的整體化學(xué)成分發(fā)生了改變，為其后續(xù)研究提供了新的譜學(xué)分析依據(jù)。X射線熒光分析法結(jié)果表明，醋制后孜然中的金屬元素含量明顯降低。以上實(shí)驗結(jié)果表明醋制后各成分的變化可能是導(dǎo)致其功能主治發(fā)生改變的原因。在維吾爾醫(yī)臨床應(yīng)用中，孜然的炮制品除了醋制孜然，還有鹽炒孜然和炒孜然，本文只對醋制孜然工藝進(jìn)行了研究，后續(xù)筆者將對鹽炒孜然和炒孜然的炮制工藝進(jìn)行進(jìn)一步研究。