董琳琳，蘆永良，鄂維建，張 翔，趙玲莉

1 青海大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，西寧 810000；2 青海大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，西寧 810000

肝棘球蚴病是棘球蚴絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)寄生于人體和某些動(dòng)物體內(nèi)，侵犯其肝臟所致的一種嚴(yán)重肝臟疾病[1]。由細(xì)粒棘球蚴絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)引起的肝細(xì)粒棘球蚴病，又稱肝囊型包蟲(chóng)??；由多房棘球蚴絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)引起的肝多房棘球蚴病，又稱肝泡性型包蟲(chóng)病。肝棘球蚴病廣泛分布于地中海地區(qū)、美國(guó)西南部、亞洲和非洲等農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)常見(jiàn)地區(qū)，在我國(guó)主要分布于西北地區(qū)，如內(nèi)蒙古、新疆、西藏和青海等[2]。當(dāng)宿主感染棘球蚴時(shí)，棘球蚴可通過(guò)某些信號(hào)通路進(jìn)行自身與宿主間的信息傳遞，調(diào)控自身生長(zhǎng)發(fā)育與宿主的免疫系統(tǒng)。在棘球蚴感染過(guò)程中，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路發(fā)揮著重要作用?，F(xiàn)就MAPK信號(hào)通路在肝棘球蚴病中涉及的相關(guān)免疫調(diào)節(jié)情況作一綜述。

1 MAPK信號(hào)通路與相關(guān)肝臟疾病的研究概述

MAPK信號(hào)通路是介導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激、增殖與凋亡等生命活動(dòng)的重要信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，其可將細(xì)胞外的相關(guān)生物信號(hào)進(jìn)行逐級(jí)放大，傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)部，從而刺激細(xì)胞中的效應(yīng)分子來(lái)完成細(xì)胞的各項(xiàng)生命活動(dòng)。

目前至少存在3種不同的MAPK信號(hào)通路，并且3種途徑之間具有相互交叉、影響的關(guān)系，包括ERK激酶家族通路、JNK激酶家族通路和p38激酶家族通路[3]。ERK激酶家族由ERK1、2組成，JNK激酶家族由JNK1～3組成，p38激酶家族分為p38α、β、γ和δ。ERK信號(hào)的激活主要與生長(zhǎng)因子的啟動(dòng)密切相關(guān)，JNK和p38信號(hào)由多種因素激活，如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、環(huán)境應(yīng)激和其他刺激[4]。激活的信號(hào)通路以三級(jí)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)方式進(jìn)行，其關(guān)鍵酶為MAPKKK、MAPKK、MAPK 3個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，進(jìn)行方向?yàn)镸APKKK-MAPKK-MAPK[5](圖1)。ERK激酶家族通路是MAPK信號(hào)通路的經(jīng)典通路，其MAPKKK-MAPKK-MAPK三級(jí)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)為Ras-Raf-MEK-ERK通路。細(xì)胞外的相關(guān)信號(hào)通過(guò)逐級(jí)活化激活ERK信號(hào)通路，磷酸化的ERK進(jìn)入細(xì)胞核，激活多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、ATF、NF-κB、Ap-1、c-fos和c-Jun等,這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)一步調(diào)節(jié)各蛋白的表達(dá)，參與細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞形態(tài)維持等多種生物學(xué)反應(yīng)。而活化的JNK調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、凋亡和癌基因轉(zhuǎn)化等多種生命過(guò)程[6]，P38可調(diào)控氧化應(yīng)激條件下炎癥相關(guān)因子的表達(dá)、細(xì)胞骨架重構(gòu)、能量代謝和增殖凋亡等[7]。

圖1 MAPK信號(hào)通路示意圖

作為一種廣泛存在真核生物中且高度保守的經(jīng)典信號(hào)通路，MAPK通路在肝臟疾病中的作用逐漸被人們認(rèn)識(shí)。其可在轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄后及翻譯等過(guò)程中調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，與肝臟相關(guān)炎癥反應(yīng)、肝纖維化、肝癌等病理活動(dòng)密切相關(guān)[8]。如馬佳敏等[9]研究證實(shí)MAPK途徑在非酒精性脂肪性肝炎進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。次旦旺久等[10]研究證實(shí)MAPK信號(hào)通路在肝癌的發(fā)生發(fā)展及治療中發(fā)揮重要作用，是肝癌治療及預(yù)后評(píng)價(jià)的潛在分子靶點(diǎn)。

而在肝棘球蚴病中，通過(guò)對(duì)感染細(xì)粒棘球蚴與多房棘球蚴的小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其miRNA與正常小鼠的miRNA存在差異性表達(dá)，且差異性表達(dá)的miRNA主要集中在Wnt、MAPK、IL-17和TNF等信號(hào)通路中[11-12]。目前已在棘球絳蟲(chóng)體內(nèi)成功鑒定出MAPK的幾個(gè)組成部分[13]，表明MAPK信號(hào)通路是一種棘球蚴和人體共有的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，可作為連接棘球蚴與宿主的橋梁，影響棘球蚴的發(fā)育存活以及人體肝臟病變的病理過(guò)程，是打開(kāi)肝棘球蚴病疾病密碼的重要研究方向。研究棘球蚴病中與MAPK信號(hào)通路相關(guān)的基因、蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能鑒定等，有助于從細(xì)胞分子水平上了解疾病的進(jìn)展過(guò)程，揭示棘球蚴和人體在各類病理性過(guò)程中的關(guān)系，為肝棘球蚴病的防治、預(yù)后等方面提供相關(guān)科學(xué)依據(jù)[14-16]。以下將重點(diǎn)介紹MAPK通路在肝棘球蚴病相關(guān)研究中的進(jìn)展。

2 棘球蚴感染宿主肝臟中的MAPK信號(hào)通路

在棘球蚴感染宿主的過(guò)程中，肝臟是最易受到其侵襲和累及的器官。而MAPK信號(hào)通路可接收多種細(xì)胞外刺激，參與多種信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)著幾乎所有肝細(xì)胞的生理過(guò)程，包括基因表達(dá)、周期調(diào)控、細(xì)胞存活與死亡等[17]。研究MAPK信號(hào)通路的各個(gè)途徑在肝細(xì)胞代謝過(guò)程中起到的作用，對(duì)肝棘球蚴病的進(jìn)展過(guò)程尤為重要。

當(dāng)受氧化應(yīng)激、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等刺激時(shí)，MAPK信號(hào)通路被激活，引起相應(yīng)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成相應(yīng)的生物學(xué)改變[18]。在MAPK信號(hào)通路中，ERK通路可調(diào)控細(xì)胞的發(fā)育、活化、凋亡等，是細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)交匯點(diǎn)，ERK的激活更是導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂的早期關(guān)鍵因素。研究[19]顯示，肝星狀細(xì)胞分泌膠原以及肝細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和降解等均受到了ERK途徑的調(diào)控，而JNK可在一定程度上參與上述活動(dòng)，并與ERK通路共同促進(jìn)了肝纖維化。有證據(jù)[20]表明，ERK抑制劑PD98059和JNK抑制劑SP600125能夠逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞的自噬和纖維化。與正常生理狀態(tài)相比，P38通路在肝臟疾病中存在差異表達(dá)，可參與到多種肝臟病理生理過(guò)程中，P38阻斷劑SB203580可使肝星形細(xì)胞活化程度顯著降低，表明在肝星狀細(xì)胞的增殖與凋亡中，甚至在膠原、胞外基質(zhì)的合成與降解等過(guò)程中，P38通路均發(fā)揮了重要作用[21]。

在肝多房棘球蚴病中，多房棘球絳蟲(chóng)原頭蚴能夠激活大鼠肝細(xì)胞ERK激酶，并且對(duì)JNK激酶和P38激酶也有不同程度的激活作用，同時(shí)多房棘球絳蟲(chóng)原頭蚴也能夠激活肝癌細(xì)胞的ERK激酶，表明多房棘球絳蟲(chóng)原頭蚴自身分泌的一些細(xì)胞因子，如EmIns、EmBMP1/2等，可與宿主表面受體結(jié)合，從而激活宿主肝細(xì)胞的MAPK信號(hào)通路[22]。采用大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6與不同蛋白濃度的多房棘球絳蟲(chóng)囊液進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，泡球蚴囊液對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞ERK1/2、JNK1/2和P38的mRNA水平存在顯著影響[19]。在肝細(xì)粒棘球蚴病中，Lin等[23]通過(guò)蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光測(cè)定表明，細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)囊液可通過(guò)脂多糖刺激小鼠巨噬細(xì)胞中的P38和ERK1/2信號(hào)通路。Liu等[24]用細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)囊液刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后，磷酸化的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶、磷酸化的P38絲裂原活化蛋白激酶、磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶表達(dá)水平均有所升高。

由此可見(jiàn)，利用多房棘球絳蟲(chóng)原頭蚴、囊液及細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)囊液刺激相關(guān)動(dòng)物模型后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的MAPK信號(hào)通路均有不同程度的激活，激活后的MAPK信號(hào)通路將進(jìn)一步調(diào)控機(jī)體內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)，推動(dòng)病情的進(jìn)展，尤其在肝臟病理進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。而宿主肝細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路對(duì)于棘球蚴絳蟲(chóng)刺激表現(xiàn)的高敏感性，或許為棘球蚴病常見(jiàn)的受累器官為什么是肝臟提供了相關(guān)合理解釋。

3 棘球蚴體內(nèi)的MAPK信號(hào)通路

3.1 MAPK信號(hào)通路相關(guān)基因的鑒定和克隆 在肝多房棘球蚴病中，Spiliotis等[25]在體外培養(yǎng)中間宿主感染期間，在幼蟲(chóng)期囊蚴和原頭蚴的裂解物中檢測(cè)到EmRaf與EmRas基因的表達(dá)，并證實(shí)EmRas與編碼Raf-1的人類基因共享4個(gè)高度保守的外顯子-內(nèi)含子邊界。使用酵母雙雜交系統(tǒng)表明EmRaf與EmRas相互作用，但不與EmRal相互作用。其團(tuán)隊(duì)后又成功分離了多房棘球蚴EmMPK1基因，并對(duì)其進(jìn)行了全序列測(cè)定，結(jié)果顯示該序列與已知物種的MAP激酶基因有顯著的同源性，并在體外培養(yǎng)和感染中間宿主的幼蟲(chóng)階段檢測(cè)了EmMPK1及其磷酸化形式[26]。Gelmedin等[27]采用兼并PCR方法鑒定和成功克隆了多房棘球蚴的EmMKK1和EmMKK1基因。在結(jié)構(gòu)上，EmMKK1和EmMKK2與來(lái)自其他物種的MKK3/6-和MEK1/2-MAPKK亞家族成員也表現(xiàn)出顯著同源性。在酵母雙雜交分析中，EmMKK2不僅與EmRaf相互作用，與EmMPK1也存在相互作用。而對(duì)EmMKK1來(lái)說(shuō)，其與EmRaf也有著強(qiáng)烈相互作用，但與EmMPK1或EmMPK2不存在相互作用。Gelmedin等[28]發(fā)現(xiàn)，多房棘球絳蟲(chóng)P38 MAPK 家族中的EmMPK2 與其他種族的 P38 MAPK 具有相當(dāng)大的同源性，但也存在幾個(gè)明顯的差異，如與人類P38-alpha 相比，EmMPK2 顯示出顯著的自身磷酸化活性和對(duì) MAPK 底物強(qiáng)烈升高的基礎(chǔ)活性。

在肝細(xì)粒棘球蚴病中，呂國(guó)棟等[29]應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法從新疆株細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭蚴和成蟲(chóng)中克隆出EgRas基因,其與多房棘球絳蟲(chóng)基因EmRas以及線蟲(chóng)、人類等物種來(lái)源的Ras基因都表現(xiàn)出了較高的同源性。雖然EgRas的具體功能有待進(jìn)一步研究，但推測(cè)其可能參與了細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)向成囊與成蟲(chóng)兩種不同發(fā)育模式的轉(zhuǎn)變過(guò)程。其團(tuán)隊(duì)后又從細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭蚴cDNA中克隆出Ral基因，檢測(cè)到其與EmRal的同源性高達(dá)99%，但與線蟲(chóng)、人類等物種來(lái)源的Ral基因同源性則較低[30]。細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)和多房棘球絳蟲(chóng)在不同的發(fā)育時(shí)期具有較相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，但二者在中間宿主體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育模式和致病過(guò)程卻表現(xiàn)出了較大的差異，推測(cè)Ral基因可能在這2種寄生蟲(chóng)不同的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮一定作用。對(duì)新疆株細(xì)粒棘球蚴EgERK1基因進(jìn)行相關(guān)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，EgERK1與多房棘球絳蟲(chóng)ERK基因EmMPK1同源性為95.45%，與線蟲(chóng)、人類等ERK基因的同源性為43.04%～61.88%。功能分析預(yù)測(cè)EgERK1具有ERK類激酶T-X-Y結(jié)構(gòu)保守區(qū)和酶激活功能域。Western印跡顯示，原核誘導(dǎo)表達(dá)的EgERK1重組蛋白能與抗人ERK1/2抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)[31]。Zhang等[32]檢出細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)EgMKK1和EgMKK2均在幼蟲(chóng)階段表達(dá)。酵母雙雜交和共免疫沉淀分析所示，EgMKK1與先前鑒定的 EgP38蛋白相互作用，但不與EgERK相互作用。另一方面，EgMKK2與EgERK相互作用。此外，EgMKK1和EgMKK2顯示出針對(duì)底物髓鞘堿性蛋白的激酶活性。Lv等[33]在細(xì)粒棘球蚴中鑒定了一個(gè)1107 bp的cDNA，該cDNA編碼了368個(gè)氨基酸的組成的EgP38蛋白。EgP38具有P38樣激酶的2個(gè)顯著特征：高度保守的TXY基序和激活環(huán)片段。結(jié)構(gòu)同源性建模表明EgP38、EmMPK2和智人P38α之間存在保守結(jié)構(gòu)，EgP38的活性形式在囊泡和原頭蚴中表達(dá)，但不在伴隨的囊液中表達(dá)(表1)。

3.2 MAPK信號(hào)通路的抑制劑與相關(guān)治療效果 在ERK途徑中，人EGF介導(dǎo)的EGFR/ERK信號(hào)促進(jìn)了多房棘球蚴生發(fā)細(xì)胞的增殖，使用EGFR抑制劑CI-1033和BIBW2992、MEK/ERK抑制劑U0126，抑制信號(hào)傳導(dǎo)會(huì)損害生發(fā)細(xì)胞增殖和幼蟲(chóng)生長(zhǎng)[32,36-37]。Raf抑制劑甲苯磺酸索拉非尼(25 μmol/L)、MEK選擇性抑制劑PD184352(100 μmol/L)、MEK抑制劑U0126-EtOH(100 μmol/L)可誘導(dǎo)細(xì)粒棘球蚴中EgMKK和EgERK去磷酸化，引起形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的改變，包括生發(fā)層中的細(xì)胞死亡、部分起皺和分離，同時(shí)降低原頭蚴活力。且甲苯磺酸索拉非尼比PD184352和U0126更可有效地降低原頭蚴活力[32]。ERK途徑中Tau蛋白的阻滯劑TRx0237(LMTX)mesylate可以抑制棘球蚴原頭蚴活性，阻礙生發(fā)層細(xì)胞與多房棘球蚴包囊的增殖。ERK蛋白的阻滯劑GDC-0994可以達(dá)到抑制原頭蚴活性與抑制多房棘球蚴包囊增殖的作用，但與多房棘球蚴生發(fā)層細(xì)胞的增殖關(guān)系不密切[8]。

在P38途徑與JNK途徑中，EmMPK2活性被抑制劑ML3403和SB202190有效抑制。當(dāng)將SB202190尤其是ML3403添加到體外培養(yǎng)的多房棘球蚴囊泡時(shí)，會(huì)導(dǎo)致寄生蟲(chóng)中EmMPK2的去磷酸化，損害棘球蚴細(xì)胞生發(fā)細(xì)胞增殖和幼蟲(chóng)生長(zhǎng)，并在不影響培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的濃度下有效殺死寄生蟲(chóng)囊泡[28,32]。用P38抑制劑ML3403處理細(xì)粒棘球蚴體外培養(yǎng)的原頭蚴可有效抑制EgP38活性，并在5 d內(nèi)導(dǎo)致顯著的原頭蚴死亡[33]。而P38途徑中靶點(diǎn)蛋白ASK1阻滯劑Selonsertib在體內(nèi)及體外均無(wú)明顯的抗多房棘球蚴作用[38]。ERK抑制劑PD98059、JNK抑制劑SP600125、P38抑制劑SB202190均對(duì)細(xì)粒棘球蚴原頭蚴的生長(zhǎng)有不同程度的抑制作用,且抑制P38及JNK信號(hào)通路對(duì)HO-1酶活性影響更大[39]。

在其他相關(guān)途徑中，P53蛋白的阻滯劑Pifithrin-β hydrobromide在小鼠體內(nèi)抗多房棘球蚴效果較好，而在體外實(shí)驗(yàn)中，對(duì)原頭蚴及生發(fā)層細(xì)胞均無(wú)明顯抑制作用，推測(cè)其可能在棘球蚴與宿主之間的交互作用中發(fā)揮了重要生物效應(yīng)[8]。BMP抑制劑LDN-193189能夠?qū)MP分子誘導(dǎo)的Smad、P38、AKT、ERK等信號(hào)通路產(chǎn)生抑制作用，阻礙寄生蟲(chóng)獲取能量，并破壞其蟲(chóng)體結(jié)構(gòu)。在體外培養(yǎng)體系中，予以不同濃度LDN-193189，阻斷其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，會(huì)使原頭蚴生存能力顯著減弱，且隨著濃度的增大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，這種效果更為顯著[40]。

4 小結(jié)和展望

綜上所述，棘球蚴絳蟲(chóng)的生長(zhǎng)和發(fā)育依賴于人體分子信號(hào)，而人體肝臟內(nèi)一系列病理過(guò)程的變化和棘球蚴的分子信號(hào)也有千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系。近年來(lái)，以肝棘球蚴病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵激酶為藥物的篩選靶點(diǎn)，探索具有高特異性且毒副作用小的新型靶向藥物已成為當(dāng)前肝棘球蚴病研究的熱點(diǎn)。而MAPK信號(hào)通路在肝棘球蚴病中存在蟲(chóng)體與宿主的雙重激活，參與肝棘球蚴病發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)方面，對(duì)進(jìn)一步研發(fā)更有效的治療方案有著重要意義。未來(lái)，以MAPK信號(hào)通路為靶點(diǎn)的藥物治療有望成為肝棘球蚴病治療新的選擇。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：董琳琳負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫(xiě)論文；蘆永良、鄂維建、張翔參與收集資料，修改論文；趙玲莉負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。